I baculovirus infettano esclusivamente gli invertebrati, comprese molte specie di insetti

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1 I baculovirus infettano esclusivamente gli invertebrati, comprese molte specie di insetti Durante il ciclo infettivo se ne producono due forme, una delle quali è costituita da singoli virioni liberati da una cellula ospite infettata La seconda forma è costituita da un certo numero di virioni intrappolati (occlusi) in una matrice proteica La proteina che compone tale matrice è la poliedrina ed un pacchetto di virioni occluso è definito poliedro Molti di questi pacchetti si liberano nell ambiente in seguito alla lisi della cellula ed alla morte dell organismo ospite 1

2 I baculovirus possiedono genomi di DNA circolare di dimensioni comprese tra 90 e 180 kbp L infezione virale porta alla lisi cellulare, normalmente 3-5 giorni dopo l infezione iniziale, e la successiva morte dell insetto I virus della poliedrosi nucleare sono una classe di baculovirus che producono corpi di inclusione nel nucleo delle cellule infettate Questi corpi di inclusione sono primariamente costituiti da un unica proteina, la poliedrina, che circonda le particelle virali e le protegge da ambienti sfavorevoli I corpi di inclusione proteggono le particelle virali dalla degradazione nell intestino dell insetto 2

3 Il poliedro protegge i virioni dall inattivazione da parte di agenti ambientali L ingestione da parte di un ospite suscettibile determina la solubilizzazione della poliedrina ed i virioni liberati possono indurre un ciclo infettivo Durante le fasi tardive del ciclo infettivo sono sintetizzate notevoli quantità della proteina poliedrina La sintesi ha inizio ore dopo l infezione e dura 4-5 giorni, fino a quando le cellule infettate subiscono la lisi e l organismo ospite muore 3

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7 Il promotore del gene della poliedrina è eccezionalmente forte, ma il ciclo della riproduzione virale non dipende dalla presenza del gene della poliedrina Si è pensato di sostituire il gene della poliedrina con quello codificante una proteina eterologa La successiva infezione di cellule di insetto in coltura con il baculovirus manipolato geneticamente determina la produzione di grandi quantità di proteina eterologa Sistemi di modificazione post-traduzionale degli insetti e dei mammiferi sono simili 7

8 Lo specifico baculovirus adoperato ampiamente come vettore di espressione è il virus della poliedrosi nucleare multipla di Autographa californica (AcMNPV), il cui genoma è composto da un DNA a doppia elica, circolare, delle dimensioni di 130 kbp A. californica ed oltre 30 specie di insetti possono essere infettate da AcMNPV La linea cellulare più comunemente adoperata per l AcMNPV manipolato geneticamente è quella tratta dalla larva della falena autunnale Spodoptera frugiperda In queste cellule il promotore della poliedrina è particolarmente attivo durante le infezioni di baculovirus wild-type sono sintetizzate notevoli quantità di poliedrina (linee cellulari Sf9 e Sf21) 8

9 Il primo passo della produzione di un baculovirus ricombinante AcMNPV consiste nella creazione di un vettore di trasferimento Si tratta di un vettore basato su E.coli che reca un segmento di DNA derivante da AcMNPV ELEMENTI DEL VETTORE: 1. Regione promotrice della poliedrina ed una porzione adiacente (a monte) di AcMNPV che fornisce una regione per la ricombinazione omologa con AcMNPV 3. Un sito di clonaggio 4. Le regioni segnale di arresto e di poliadenilazione della poliedrina ed una porzione adiacente (a valle) del DNA di AcMNPV, che fornisce una seconda regione per la ricombinazione omologa con AcMNPV Il gene di interesse è clonato tra le sequenze del promotore e del terminatore della poliedrina Il costrutto è propagato in E.coli 9

10 Consentono all unità di espressione di integrarsi tramite ricombinazione omologa nel DNA di AcMnPV nelle cellule di insetto Promotore del gene della poliedrina Sequenze di arresto del gene della poliedrina 10

11 Cellule di insetto in coltura già trasfettate con il DNA di AcMNPV sono trasfettate con il vettore di trasferimento recante il gene clonato All interno delle cellule doppiamente trasfettate si verifica un evento di doppio crossing-over Il gene clonato si integra nel DNA di AcMNPV, con la simultanea perdita del gene della poliedrina I virioni privi del gene della poliedrina producono caratteristiche zone di lisi cellulare (placche senza occlusione) dalle quali è possibile isolare il baculovirus ricombinante 11

12 Virus wild-type: placche di lisi opalescenti Virus ricombinante: placche di lisi trasparenti Il riconoscimento visivo delle placche senza occlusione è tedioso e soggettivo METODI ALTERNATIVI PCR Ibridazione di DNA Gene lacz di E.coli sotto il controllo di un promotore del baculovirus che si attiva tra i primi e gli ultimi stadi del ciclo litico è introdotto nell unità di DNA incorporata nel genoma di AcMNPV le placche ricombinanti virano al blu quando si aggiunge al mezzo un substrato cromogenico per la β-galattosidasi 12

13 L enzima β-galattosidasi converte il substrato X-gal (bromo-cloro-indoil-ß-galattopiranoside) incolore in un composto blu e galattosio 13

14 Il procedimento originario di produzione del baculovirus ricombinante è stato modificato: 1. Sostituzione del promotore della poliedrina (attivo solo nelle ultime fasi del ciclo litico) con un promotore forte di AcMNPV sempre attivo 2. Intoduzione del sito di restrizione unico Bsu36I nel gene della poliedrina del genoma di AcMNPV la digestione con Bsu36I prima della trasfezione consente di aumentare la frequenza delle placche ricombinanti (1% 30%) La capacità infettiva dei genomi di baculovirus lineari si riduce. Un evento di doppio crossing-over tra una molecola di DNA di AcMNPV lineare ed un vettore di trasferimento circolare genera una molecola di DNA circolare (chiusa) infettiva. 14

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16 Il sistema di linearizzazione Bsu36I è stato sviluppato ulteriormente per generare un sistema capace di produrre placche di baculovirus ricombinante con frequenza altissima Il genoma di AcMNPV è stato manipolato introducendo due siti Bsu36I collocati ai due lati del gene della poliedrina Un sito è introdotto nel gene 603, l altro in un gene indispensabile ai fini della replicazione del virus Il DNA del baculovirus modificato è trattato con l enzima Bsu36I ed introdotto in cellule di insetto non si verifica alcuna replicazione virale, dal momento che manca un segmento del gene indispensabile In questo caso il vettore di trasferimento contiene il gene bersaglio e, ove occorra, un gene codificante un marcatore di selezione tra le versioni intatte del gene 603 e del gene indispensabile 16

17 Tale vettore è trasferito in cellule di insetto precedentemente trasfettate con il genoma di AcMNPV linearizzato e recante una delezione tra i siti Bsu36I Un evento di doppio crossing-over ristabilisce una forma funzionale di ORF1629 e, nel contempo, incorpora il gene clonato nel genoma di AcMNPV Con questo sistema risulta ricombinante fino al 99% delle placche di baculovirus 17

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20 Quando si infettano le cellule di insetto in coltura con baculovirus ricombinante la proteina eterologa può essere raccolta dopo 4-5 giorni. Il sistema di vettori di espressione basati su baculovirus è stato utilizzato per produrre più di 500 proteine eterologhe diverse, oltre il 95% delle quali portava le giuste modifiche post-traduzionali. 20

21 Modifiche post-traduzionali La via di glicosilazione degli insetti è diversa da quella dei mammiferi Linee cellulari di insetto scelte in base alla loro capacità di riprodurre modifiche post-traduzionali tipiche dei mammiferi (Sf9) Coespressione (nel baculovirus) di geni che codificano enzimi necessari alle corrette modifiche della proteina eterologa 21

22 Costruzione di un vettore navetta del baculovirus E.coli-cellula di insetto Il sistema utilizza una porzione di un piccolo plasmide di E.coli fiancheggiata da segmenti di DNA collocati al di là delle estremità 5 e 3 del gene della poliedrina. Sono anche presenti un gene che conferisce la resistenza alla kanamicina, una sequenza di DNA che agisce da sito di integrazione (sito di attacco) che viene inserita nel gene lacz senza alterarne la funzione, un origine di replicazione procariotica. Un evento di doppio crossing-over dà origine ad un unico costrutto di DNA circolare che può mantenersi in E.coli come plasmide e che, dopo inserimento nelle cellule di insetto, dirige la produzione dei Baculovirus. Questo vettore navetta prende il nome di bacmide 22

23 Il sistema comprende un secondo plasmide, plasmide donatore, costituito da un plasmide di E.coli in cui il gene di interesse è clonato tra il promotore della poliedrina ed una sequenza di arresto. Un gene che conferisce la resistenza alla gentamicina e l unità di espressione del gene di interesse sono fiancheggiati da sequenze di DNA che si legano al sito di integrazione del bacmide e da un gene che conferisce resistenza all ampicillina collocato al di fuori dei due siti di integrazione. L integrazione tra i siti corrispondenti del plasmide donatore e del bacmide si può verificare solo in presenza di determinate proteine (proteine di trasposizione) che, in questo sistema, provengono da un terzo plasmide di E.coli (plasmide helper), il quale contiene anche un gene che conferisce la resistenza alla tetraciclina. 23

24 Le cellule batteriche recanti il bacmide sono co-trasformate con i plasmidi donatore ed helper L integrazione del segmento del plasmide donatore con l unità di espressione e con il gene che conferisce la resistenza alla gentamicina nel sito di integrazione del bacmide distrugge la cornice di lettura del gene lacz Di conseguenza, in presenza di IPTG e di X-Gal, i batteri che portano i bacmidi ricombinanti producono colonie bianche Le colonie bianche resistenti alla kanamicina e sensibili tanto all ampicillina quanto alla tetraciclina portano solamente il bacmide ricombinante, ma non i plasmidi donatore ed helper L integrità del gene clonato può essere confermata mediante PCR Infine cellule di insetto saranno trasfettate con il DNA del bacmide ricombinante Esistono anche protocolli per effettuare le manipolazioni genetiche di AcMNPV in cellule di lievito, utilizzando vettori navetta lievito-cellula di insetto 24

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26 VANTAGGI Si possono produrre grandi quantità di proteina rispetto ad altri vettori di espressione eucariotici Il pattern di glicosilazione è simile, anche se non identico, a quello che si ritrova negli eucarioti superiori Geni multipli possono essere espressi da un singolo virus è possibile produrre complessi proteici i cui componenti individuali non risultano stabili se espressi singolarmente 26

27 Purificazione selettiva di proteine ricombinanti da cellule di insetto mediante l utilizzo di proteine di fusione: Tag di istidine GST Proteina che lega il maltosio 27