Cappa a flusso laminare di classe II

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Martina Bruni
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1 Cappa a flusso laminare di classe II

2 CAPPA A FLUSSO LAMINARE Flusso laminare: flusso unidirezionale formato da filetti di aria sterile, filtrata attraverso filtri HEPA, paralleli tra loro ed aventi tutti la stessa velocità, generalmente di 0,5 m/sec. I filetti di aria sterile trascinano lontano dall area di lavoro i contaminanti ed evitano la formazioni di vortici. Filtri HEPA(High Efficiency Particulate Air): prevengono la contaminazione particellare, sono costituiti da fogli di microfibre di vetro ripiegati più volte per aumentare la superficie filtrante; l efficienza è la capacità di trattenere particelle di 0,3 micron di diametro e deve essere compresa tra 99,97% e 99,99%. Le cappe a flusso laminare garantiscono principalmente la protezione del campione da contaminazioni non la protezione dell operatore e dell ambiente

3 Cappe biologiche di classe II: maggiormente impiegate in laboratori di ricerca e microbiologici, sono anche definite cappe di sicurezza microbiologica Cappe biologiche di classe III: caratterizzate da una chiusura totale ermetica, funzionano a pressione negativa; le manipolazioni all interno della camera sono consentite da due o più guanti di gomma incorporati nella struttura della cappa. I campioni, in contenitori chiusi, sono introdotti tramite un sistema di doppi sportelli. Hanno un filtro HEPA sull aria in ingresso ed un doppio filtro HEPA sull aria in uscita -Protezione totale dell operatore e dell ambiente. -Manipolazioni ad alto rischio biologico

4 Medium di Coltura I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule I più comuni terreni base di coltura: -MEM: Minimum Essential Medium -DMEM: Dulbecco s modification of MEM -RPMI: Roswell Park Memorial Institute Differiscono per la concentrazione in amminoacidi e sali e per la concentrazione di glucosio

5 Medium di Coltura Vitamine Agiscono come catalizzatori o come substrati per facilitare o controllare alcune funzioni metaboliche Biotina Pantotenato Acido folico Inositolo Nicotinamide Piridossina Riboflavina Tiamina Vitamina B12

6 Medium di Coltura Sali inorganici Essenziali per la crescita e il mantenimento delle funzioni cellulari e agiscono anche come tampone per le fluttuazioni del ph dovute a variazioni ambientali o ai prodotti del catabolismo Cloruro di calcio anidro Solfato di magnesio anidro Cloruro di potassio Nitrato di potassio Cloruro di sodio Fosfato di sodio bibasico Bicarbonato di sodio

7 Complementazione del Medium di Coltura Il terreno base viene conservato a 4 C e, prima di essere utilizzato, viene complementato con: Glutammina (aa essenziale molto labile) Antibiotici (penicillina/streptomicina) Siero (supplemento più comune delle colture cellulari) PHA (fitoemoagglutinina) stimola la divisone del linfocita. Agisce dopo 24 ore

8 SIERO Miscela complessa di proteine ed elementi fondamentali per la crescita in vitro della maggior parte delle cellule Fattori di crescita: PDGF, EGF, IGF Fattori di adesione: fibronectina, vitronectina Altri elementi: trasferrina, albumina, colesterolo, acidi grassi e glucorticoidi, elementi minerali Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino (FBS)

9 Coltura cellulare per Aberrazione cromosomiche Come si fa ad essere sicuri di analizzare le prime metafasi (M1)? Bromodesossiuridina (BudR) e colorazione FPG (Fluorescence plus Giemsa)

11 Bromodesossiuridina (BudR) e colorazione FPG Base azotata analoga della timina, che essa può sostituire efficientemente nel DNA Hoechst Pentahydrate (bis-benzimide) è un colorante per DNA che può essere eccitato da luce ultravioletta. La 5 BrdU smorza la fluorescenza del Hoechst per cui i cromatidi bisostituiti presenteranno una colorazione più debole rispetto ai cromatidi monosostituiti. Tale colorazione, rafforzata dalla sovracolorazione con Giemsa, FPG (fluorescence plus Giemsa), consente di differenziare i due cromatidi alla seconda divisione mitotica (P.Perry, 1974).

12 Fluorescence Plus Giemsa (FPG) Staining

13 BLOCCO MITOTICO SOSTANZE CHE BLOCCANO IL FUSO MITOTICO CONFERISCONO UN ASPETTO CONTRATTO AI CROMOSOMI COLCHICINA ESTRATTO VEGETALE CHE BLOCCA IL CICLO CELLULARE COLCEMID PRODOTTO DI SINTESI VOLTE MENO TOSSICO TEMPO DI AZIONE 2-3 ORE

14 KCl / SODIO-CITRATO SHOCK IPOTONICO SCOPO RIGONFIAMENTO DELLE CELLULE CON DISPERSIONE DEI CROMOSOMI NEL CITOPLASMA CROMOSOMI MENO SOVRAPPOSTI E PIU FACILMENTE IDENTIFICABILI

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