LE ANALISI DI LABORATORIO PER LA DIAGNOSI PRENATALE: DALLA CITOGENETICA TRADIZIONALE AGLI ARRAY

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1 Laboratorio di Citogenetica Laboratorio di Biologia Molecolare LE ANALISI DI LABORATORIO PER LA DIAGNOSI PRENATALE: DALLA CITOGENETICA TRADIZIONALE AGLI ARRAY MODENA, 09 MARZO 2013 Dott.ssa Patrizia Caggiati Responsabile Settore Biologia Molecolare N TELEFONO Laboratorio Test Viale Verdi, Modena

2 Con il termine di DIAGNOSI PRENATALE si intende l insieme delle indagini strumentali e di laboratorio finalizzate ad ottenere informazioni sullo stato di salute dell embrione e del feto e ad individuare eventuali patologie fetali su base genetica,infettiva,iatrogena o ambientale.

3 DIAGNOSI PRENATALE Dati recenti indicano che circa il 2-5% dei neonati è affetto da una malattia genetica. Lo scopo della diagnosi prenatale (DP) è quello di offrire ai genitori e al medico le migliori informazioni possibili sui rischi di dare alla luce un bambino affetto da un'anomalia congenita o da una malattia genetica. Le tecniche di DP utilizzate sono: non invasive (ecografia, test biochimici) invasive (villocentesi,amniocentesi,cordocentesi)

4 DIAGNOSI PRENATALE LE TECNICHE DI DP NON INVASIVE consentono di effettuare esclusivamente una valutazione probabilistica dal momento che non permettono di identificare o di escludere direttamente le anomalie cromosomiche ma di selezionare pazienti a basso e ad alto rischio. LE TECNICHE DI DP INVASIVE permettono di giungere ad una diagnosi di tipo citogenetico, molecolare, immunologico, infettivo.

5 DIAGNOSI PRENATALE Attualmente l indagine citogenetica per lo studio del cariotipo fetale interessa circa l 80% delle diagnosi prenatali eseguite per evidenziare patologie genetiche.

6 DIAGNOSI PRENATALE I laboratori di citogenetica eseguono specifici test finalizzati allo studio del cariotipo. Viene definito cariotipo l insieme dei cromosomi caratteristico per numero e struttura del genoma di una specie. L analisi citogenetica permette di identificare anomalie cromosomiche costituzionali o acquisite, di numero o di struttura, omogenee o a mosaico.

7 ANOMALIE CROMOSOMICHE

8 ANOMALIE CROMOSOMICHE NUMERICHE POLIPLOIDIE La più comune è la TRIPLOIDIA dovuta a fecondazione di un singolo ovulo da parte di due spermatozoi (DISPERMIA) o dalla fecondazione che coinvolge un gamete diploide anomalo. La TETRAPLOIDIA è invece dovuta al non completamento della prima divisione zigotica.

9 ANOMALIE CROMOSOMICHE NUMERICHE ANEUPLOIDIE Le aneuploidie più comuni sono le TRISOMIE e MONOSOMIE. I principali meccanismi sono: NON-DISGIUNZIONE: incapacità dei cromosomi di separarsi durante la prima divisione meiotica, o dei cromatidi fratelli appaiati di separarsi nella seconda. divisione meiotica. I due cromosomi o cromatidi congiunti migrano ad un polo e vengono inclusi in una sola cellula figlia, mentre l altra avrà materiale genetico in meno. RITARDO ANAFASICO: ritardata migrazione del cromosoma durante l anafase e conseguente perdita del cromosoma. Mancata incorporazione di un cromosoma nel nucleo di una delle cellule figlie.

10 ANEUPLOIDIE PIU FREQUENTI ALLA NASCITA

11 ANOMALIE CROMOSOMICHE NUMERICHE CROMOSOMI MARKER Il termine di cromosoma marker (ESACs) viene usato in citogenetica per indicare qualsiasi piccolo cromosoma sovrannumerario non identificabile mediante le usuali tecniche di bandeggio. Possono essere classificati come de novo o familiari. Possono essere omogenei oppure a mosaico. Da un punto di vista morfologico la classificazione fondamentale è quella che distingue i marker satellitati (con satelliti che derivano da cromosomi acrocentrici) da quelli non satellitati. Incidenza dei marker : 0,6/1000 a 0,9/1000 casi in amniocentesi 3:1000 in pazienti con ritardo mentale 1:4.000 nella popolazione generale

12 CROMOSOMI MARKER

13 CROMOSOMI MARKER

14 ANOMALIE CROMOSOMICHE NUMERICHE MOSAICISMO CROMOSOMICO Per mosaicismo cromosomico si intende la presenza nello stesso individuo, in suo organo o tessuto, di due o più linee cellulari derivanti dallo stesso zigote, dovute ad una non disgiunzione o ritardo cromosomico verificatisi in una delle divisioni mitotiche in fase embrionale precoce. Il mosaicismo può coinvolgere sia il feto che la placenta, oppure indipendentemente l uno dall altro, in relazione allo stadio precoce o tardivo in cui si instaura la nuova linea cellulare durante l embriogenesi. La frequenza del mosaicismo cromosomico è valutata in circa l 1-2% delle aneuploidie esaminate.

15 ANOMALIE DI STRUTTURA Delezioni Duplicazioni Inversioni Traslocazioni (reciproche e robertsoniane) Cromosomi ad anello Isocromosomi Anomalie cromosomiche bilanciate: se non c è acquisizione o perdita netta di materiale cromosomico. Anomalie cromosomiche sbilanciate: se c è acquisizione o perdita netta di materiale cromosomico. In caso di sbilanciamento la gravità è correlata al tipo di cromosoma e alla quantità di geni interessati.tanto più grave è lo sbilanciamento cromosomico tanto più precoce sarà l interruzione di gravidanza. Negli aborti la frequenza delle alterazioni strutturali sbilanciate è dell 1,54% e dello 0,28% per quelle bilanciate. Tra i nati vivi è dello 0,06% per riarrangiamenti sbilanciati e dello 0,52% per quelli bilanciati. Nella popolazione generale circa 1 individuo su 200 è portatore di un riarrangiamento strutturale bilanciato.

16 FREQUENZA DELLE ANOMALIE CROMOSOMICHE IN DIAGNOSI PRENATALE Direttamente correlata con l età materna. Inversamente correlata con l epoca gestazionale. 20% dei prodotti del concepimento vengono abortiti prima dell impianto 42% vengono abortiti prima della 7 a s.g. 10% vengono abortiti tra la 7 a e la 12 a s.g. 3% vengono abortiti dopo la 12 a s.g. Solo il 25% dei concepiti arrivano alla nascita.

17 INDICAZIONI ALL ESECUZIONE DELLA DIAGNOSI PRENATALE Età materna avanzata: superiore a 35 anni. Coppie con precedente figlio affetto da una anomalia cromosomica. Genitore portatore di una anomalia cromosomica strutturale bilanciata. Genitore portatore di un marcatore cromosomico sovrannumerario. Genitore con mosaicismo cromosomico. Riscontro ecografico di malformazioni fetali, ritardo dello sviluppo fetale. Indagini biochimiche su siero materno suggestive di un aumento del rischio di patologia cromosomica nel feto. Storia familiare di malattia genetica. Storia familiare di difetti del tubo neurale. Malattie infettive insorte in gravidanza.

18 ANALISI DI DIAGNOSI CITOGENETICA PRENATALE EFFETTUATE PRESSO IL NOSTRO LABORATORIO Cariotipo su villi coriali Incubazione a breve termine: Analisi del citotrofoblasto Coltura a lungo termine: Analisi Mesoderma extraembrionale Cariotipo su liquido amniotico Materiale abortivo

19 SETTORE DI CITOGENETICA La Sezione di Citogenetica è attiva dal 1991 ed opera sia su richiesta dei singoli medici, che in convenzione con strutture pubbliche e private. Il Laboratorio Test garantisce per tutte le analisi citogenetiche gli standard qualitativi previsti dalle linee guida emanate dall ISS. Per gli aspetti tecnici, il Laboratorio Test fa riferimento alle linee guida per l analisi citogenetica riportate sul documento del CONSENSUS 2007, formulate da gruppi di lavoro della Società Italiana di Genetica Umana (SIGU) facendo riferimento ai documenti internazionali, in particolare: Cytogenetic Guideline and Quality Assurance a cura della European Cytogeneticists Association (2006). Il laboratorio TEST possiede la certificazione SIGUCERT specifica dei laboratori di Genetica Medica. Nel settore di citogenetica viene monitorata trimestralmente la qualità del servizio mediante l analisi di specifici indicatori statistici. Il laboratorio partecipa inoltre a controlli di qualità esterni (CEQA). Nel settore di citogenetica opera personale tecnico con consolidata esperienza e personale laureato con specializzazione in genetica medica e genetica applicata.

20 VILLI CORIALI Prelievo eseguito tra la 10 a e la 12 a settimana di gestazione (10 mg). Se eseguita prima della 10 a settimana si associa più frequentemente ad anomalie degli arti, micrognatia, microglossia. Metodo diretto : Si sfruttano le mitosi spontanee delle cellule del citotrofoblasto; si procede alla selezione dei villi idonei, eliminando eventuale sangue o decidua aspirati durante il prelievo; i villi vengono messi in coltura per h; si aggiunge colchicina; si effettua lo shock osmotico con soluzione ipotonica per rompere le membrane cellulari; si esegue il fissaggio e lo striscio del preparato sul vetrino e analisi delle metafase dopo colorazione. Vantaggi: tempi risposta (2-7 gg), minor inquinamento da cellule materne. Svantaggi: l attivita mitotica e la qualità delle metafasi sono inferiori al metodo della coltura. Risoluzione 300 bande /set aploide. Metodo coltura : I villi sono posti in coltura previo trattamento con enzimi proteolitici (pronase e collagenase) per disgregare le cellule del mesenchima. A crescita avvenuta, si procede al trattamento con colchicina, cui segue shock osmotico, fissaggio dei preparati su vetrino e analisi delle metafase dopo colorazione. Tempi di risposta 18-21gg. Risoluzione 400 bande /set aploide.

21 VILLI CORIALI L INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO dipende da: Risoluzione delle metafasi ottenute Numero di bande osservabili. Rischio di non scorgere minime alterazioni strutturali (inferiori a 10 Mb). Contaminazione materna Presenza di decidua nel materiale prelevato. Mosaicismo TIPO I (solo citotrofoblasto) TIPO II (solo nel mesenchima) TIPO III (nel citotrofoblasto e nel mesenchima) Il riconoscimento di una condizione di mosaicismo richiede una conferma nel II trimestre di gravidanza: mosaicismo vero o mosaicismo confinato alla placenta (CPM). Differenze nel cariotipo delle diverse componenti dell unità feto-placentare vengono osservate nell 1-2% circa dei prelievi di villi coriali. Necessità di consulenza genetica

22 VILLI CORIALI Successo e accuratezza diagnostica Fallimento dell esame nello 0,5-1% dei casi (assenza di metafasi in diretta e/o di crescita cellulare in coltura). Falsi positivi dell esame citogenetico nell 1% dei casi circa per la presenza di mosaicismi placentari (90%) e raramente per aneuploidie non a mosaico. Falsi negativi degli esami citogenetici sono rarissimi (1 su 3000) utilizzando la sola tecnica diretta, eccezionali (1 su ) utilizzando l analisi diretta insieme a quella colturale.

23 LIQUIDO AMNIOTICO Prelievo di 16 ml di liquido amniotico eseguito tra la 16 a e la 18 settimana di gestazione. Materiale esaminato: cellule di desquamazione provenienti da sacco amniotico,epidermide, mucosa del tubo digerente, del tratto respiratorio e di quello urogenitale. Metodo in situ : l analisi avviene per colonie. Migliore valutazione diagnostica in caso di mosaicismo cromosomico o di contaminazione materna. Metodo in fiasca : si perde l individualità. Su un aliquota di liquido amniotico viene eseguito il dosaggio dell alfafetoproteina per lo screening dei difetti del tubo neurale. Tempi di refertazione 15 giorni. Risoluzione: 400 bande per set aploide.

24 LIQUIDO AMNIOTICO L INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO dipende da: Risoluzione delle metafasi ottenute Numero di bande osservabili. Rischio di non scorgere minime alterazioni strutturali (inferiori a 10 Mb). Contaminazione materna Presenza di cellule materne nel materiale prelevato. Mosaicismo Tipo I: una singola cellula con anomalia numerica o strutturale (2,5%-7%). Tipo II: due o più cellule con la stessa alterazione proveniente da una coltura in fiasca o da una singola colonia o più colonie anomale osservate in una singola coltura in situ (0,7%-1,1%). Tipo III : più metafasi o colonie in almeno due preparati provenienti da due colture in fiasca o da due colture in situ indipendenti (0,2%). Tipo I e II: pseudomosaicismo Tipo III: mosaicismo fetale o vero Necessità di consulenza genetica

25 PROBLEMATICHE E LIMITI DELL ANALISI CITOGENETICA PRENATALE 1. Possibilità che le cellule in coltura non crescano in maniera adeguata e non sia possibile effettuare la diagnosi sul campione prelevato. Assenza di metafasi nel metodo diretto e/o di crescita cellulare nel metodo coltura per i villi coriali (1%). Assenza o ridotta crescita cellulare per il liquido amniotico ( %). 2. Possibilità che l analisi fornisca un risultato ambiguo. Contaminazione materna (0.3% in L.A. e 2% in V.C.). Mosaicismo cromosomico, pseudomosaicismo.

26 PROBLEMATICHE E LIMITI DELL ANALISI CITOGENETICA PRENATALE 3. Diagnosi certa ma implicazioni fenotipiche incerte Questo costituisce attualmente un importante limite della diagnosi citogenetica fetale. In pratica, a fronte di un risultato diagnostico accurato a livello di laboratorio, non è possibile in certi casi predire con altrettanta accuratezza il fenotipo fetale. In queste situazioni viene attribuito un rischio empirico di patologia, che non è ulteriormente precisabile. Esempi di queste problematiche sono rappresentati da riarrangiamenti strutturali de novo e dalla presenza di marker sovrannumerari.

27 ARRAY-CGH Array based Comparative Genomic Hybribation L analisi array-cgh viene utilizzata per analizzare lo sbilanciamento del numero di copie di sequenze genomiche ad una risoluzione di molto superiore a quella possibile con le tradizionali tecniche di citogenetica su metafasi. Questa tecnologia è basata sull uso di campioni di DNA da analizzare e DNA di controllo marcati con fluorocromi diversi che vengono ibridati contemporaneamente a DNA targets (BAC od oligonucleotidi) localizzati su un vetrino. L analisi a-cgh è impiegata per la diagnosi di anomalie cromosomiche quantitative, ossia di CNVs (Copy Number Variations), in forma di delezione o duplicazione. Permette di analizzare numerosi riarrangiamenti cromosomici responsabili di sindromi con ritardo psicomotorio e anomalie fenotipiche multiple (anomalie comprese tra 10Mb e kb). Per eseguire l analisi molecolare in prenatale è necessario una fiasca di amniociti coltivati oppure 10-20mg di villi coriali e il prelievo ematico dei genitori in K3-EDTA e in Litio o Na-Eparina per eventuali controlli.

28 ARRAY-CGH

29 ARRAY-CGH Array-CGH ad alta risoluzione (oligoarray) può essere utilizzato in diagnosi prenatale in presenza di: 1. Riarrangiamenti cromosomici de novo apparentemente bilanciati. 2. Piccoli cromosomi marcatori soprannumerari (ESACs). 3. Translucenza nucale >4mm in presenza di un cariotipo standard normale 4. Associazione, in varia combinazione, tra più marcatori ecografici minori (cisti dei plessi coroidei, iperecogenicità intestinale, pielectasia renale, arteria ombelicale unica). 5. Alterazioni del volume del liquido amniotico e/o ritardo dell accrescimento fetale in associazione con marcatori ecografici minori. 6. Cardiopatie congenite. 7. Ernia diaframmatica. 8. Anomalie del sistema nervoso centrale (esclusa anencefalia).

30 LIMITI DELLA TECNICA a-cgh deve essere intesa come un integrazione dell esame cromosomico convenzionale. Con questa tecnica non si evidenziano riarrangiamenti cromosomici bilanciati come traslocazioni bilanciate e inversioni e le polipliodie. Non si evidenziano mosaicismi cellulari inferiori al 10%.

31 LIMITI DELLA TECNICA Esistono problematiche connesse con l interpretazione dei risultati legati ai seguenti aspetti CNVs BENIGNE CNVs di piccole dimensioni, sono riscontrabili in individui normali e sono prive di significato patologico. CNVs PATOGENICHE CNVs delete o duplicate responsabili di riarrangiamenti submicroscopici clinicamente significativi. CNVsdi SIGNIFICATO INCERTO Riarrangiamento de novo caratterizzato da CNVs piccole e/o con geni poco caratterizzati. Oppure CNVs ereditate da un genitore che ad oggi non assume un chiaro significato patogenetico. Tuttavia il coinvolgimento del riarrangiamento come consausa della malattia non può essere escluso.

32 E' fondamentale prima di procedere al prelievo fornire alla coppia le informazioni sull'esame richiesto e richiedere il consenso all analisi.

33 GRAZIE PER L ATTENZIONE

34 Laboratorio di Citogenetica Laboratorio di Biologia Molecolare Direttore Laboratorio Dott.ssa Rossana Bellucci Dott.ssa Patrizia Caggiati Dott.ssa Angela Ricco Dott.ssa Francesca Ravasini Dott.ssa Alessandra Scarselli Sig.ra Elisabetta Loro Sig. Raffaele Gambini