Beth Israel Deaconess Hospital, Boston, Massachusetts (2) Beth Israel Deaconess Hospital and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts

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1 Review Leukoreduction Leucodeplezione Anne B McDonald (1), Walter H Dzik (2) (1) Beth Israel Deaconess Hospital, Boston, Massachusetts (2) Beth Israel Deaconess Hospital and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts Introduction Transfusion of allogeneic donor leukocytes present in cellular blood components results in a number of both proven and perceived adverse effects in recipients. Over the last decade, a greater understanding of these possible adverse effects has been the impetus for improving methods of leukoreduction. Advances in technology have allowed more widespread use of leukoreduced components and have prompted active investigation into the potential benefits of these products. This review will describe the methods, indications for, and efficacy of leukoreduction. Cellular blood components contain a large number of residual donor leukocytes (Table I). The point at which a component can be considered adequately leukoreduced has varied in the past, with the level of 5x10 6 white blood cells (WBCs) per unit of red blood cells (RBCs) being established by the American Association of Blood Banks in 1991 and extension of the standard to leukoreduced platelets in Introduzione La trasfusione dei leucociti allogenici del donatore che sono presenti negli emocomponenti cellulari determina una serie di reazioni sfavorevoli, provate e percepite, nei riceventi. Nell'ultima decade, una maggiore consapevolezza di questi possibili effetti sfavorevoli ha costituito la spinta a migliorare i differenti metodi di leucoriduzione. I progressi nelle metodologie hanno permesso un più largo utilizzo di emocomponenti leucodepleti e hanno suggerito ricerche sui potenziali benefici di tali prodotti. Questa rassegna si propone di descrivere metodi, indicazioni ed efficacia della leucoriduzione. Gli emocomponenti cellulari contengono un notevole numero di leucociti residui provenienti dal donatore (Tabella I). Il grado al quale un emocomponente si può considerare adeguatamente leucoridotto è variato negli anni: un livello di 5x10 6 globuli bianchi (GB) per unità di concentrato eritrocitario (CE) è stato stabilito nel 1991 dall'american Association of Blood Banks (AABB) ed esteso, poi, ai concentrati piastrinici (CP) nel Methods of leukoreduction a- Centrifugation The use of centrifugal force to separate blood components by density has been used for many years. The removal of the buffy coat from whole blood is widely practiced. The process of centrifugation separates the least dense leukocytes from the packed red cells, with more efficient removal of lymphocytes and monocytes than granulocytes 1. In a variation of this process - the "top and da: Blood Safety and Survellance (2001) Jeanne V Linden, Celso Bianco (Eds) Marcel Dekker, Inc (270 Madison Avenue, New York, NY Tel. 001/212/ Fax (001/212/ Metodiche di leucoriduzione a- Centrifugazione L'utilizzo della forza centrifuga per separare, per densità, i vari componenti ematici è stato impiegato per molti anni. La rimozione del buffy-coat dal sangue intero viene tuttora largamente praticata. La centrifugazione è in grado di separare i meno pesanti leucociti dal sedimento dei globuli rossi, con una più efficiente eliminazione di linfociti e monociti rispetto ai granulociti 1. In una variante di questo procedimento - il metodo cosiddetto top and bottom - il sangue intero viene centrifugato a velocità relativamente alta per comprimere insieme nel buffy-coat piastrine e leucociti. Il plasma supernatante viene spremuto dall'alto LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol num. 6 novembre-dicembre 2001 ( ) 347

2 AB McDonald, WH Dzik Table I: approximate number of leukocytes in blood components Tabella I: numero approssimativo di leucociti negli emocomponenti Blood component Emocomponente Approximate No of leukocytes n approssimativo di GB Fresh whole blood Sangue intero (fresco) 10 9 Red cell concentrate Concentrato eritrocitario (CE) Buffy coat depleted red cells CE deprivato di buffy-coat 10 8 Washed red cell concentrate CE lavato 10 7 Frozen deglycerolized red cells CE congelato e deglicerolizzato Platelet concentrate Concentrato piastrinico (CP) Apheresis platelet CP da aferesi Fresh frozen plasma Plasma fresco congelato (PFC) <10 4 bottom" method - whole blood is centrifuged at relatively high centrifugal force to compress both platelets and leukocytes into the buffy coat. The supernatant plasma is then expressed out of the top of the primary bag into one satellite bag, while the red cells are removed via the bottom into another. The buffy coat, composed of donor white cells and platelets, is then pooled with further buffy coats and centrifuged again at a lower centrifugal force. This allows separation of the platelet-rich plasma from the white cell component, which is then discarded. This method removes 70-80% of leukocytes, a reduction sufficient to prevent many febrile nonhemolytic transfusion reactions, but not other complications whose prevention requires a higher degree of leukoreduction. A variation of this method involves manipulation of the temperature of whole blood prior to centrifugation. It was found that if the whole blood was first cooled and then warmed prior to centrifugation, the removal of leukocytes could be increased to 90%, with no apparent evidence of damage to red cells or coagulation factors 2. Other methods used in the past include washing and use of frozen/thawed red cells. Washing is not the most efficient way lo remove leukocytes because of the wide variation in the number removed 3. Significant red cell loss may occur. Because preparation takes place in an open system, washed red cells must be used within 24 hours. Frozen deglycerolized red cells reduce the risk of cytomegalovirus (CMV) transmission 4, but, because of the presence of viable lymphocytes 5, they are inadequate to prevent graft-versus-host disease in immunodeficient recipients. della sacca madre in una sacca satellite, mentre, dal basso, gli eritrociti vengono rimossi in un'altra sacca transfer. Il buffy-coat, composto da leucociti e piastrine del donatore, viene mescolato con altri buffy-coats e sottoposto a una ulteriore centrifugazione a bassa velocità. Si ottiene un plasma ricco di piastrine e povero di leucociti che vengono scartati. Questo metodo rimuove dal 70 all'80% dei GB, riduzione sufficiente a prevenire molte reazioni trasfusionali febbrili non emolitiche ma non altre complicazioni, la cui profilassi richiede un grado maggiore di leucoriduzione. Una variabile di questa metodica coinvolge la modifica della temperatura del sangue intero prima di procedere alla centrifugazione. Si è visto che se il sangue intero viene raffreddato e poi riscaldato prima della centrifugazione, l'eliminazione dei GB può essere aumentata sino al 90%, senza apparenti danni a globuli rossi e ai fattori della coagulazione 2. Altri metodi impiegati in passato riguardavano il lavaggio o il congelamento/scongelamento dei globuli rossi. Il lavaggio non è il metodo più efficace per rimuovere i GB, come indicato dalle ampie variazioni nel numero di leucociti rimossi 3 ; si ha anche una significativa perdita di eritrociti. Dato, poi, che il lavaggio avviene con sistema aperto, le emazie lavate debbono essere utilizzate entro 24 ore. Emazie congelate e deglicerolizzate riducano il rischio di trasmissione del citomegalovirus (CMV) 4, ma a causa della presenza di linfociti vitali 5 non sono adatti a prevenire la Graft versus Host Disease (GvHD) in pazienti immunocompromessi. 348

3 Leucodeplezione Table II: history of filters for blood transfusion Tabella II: storia dei filtri utilizzati in trasfusione del sangue Generation Removel target Filter material Generazione Bersaglio della rimozione Materiale filtrante First Clots Screen filter; pore size: µm Prima generazione Coaguli Filtro selettivo; dimensione dei pori: µm Second Micro-aggregates Screen/depth woven filter; pore size: 40 µm Seconda generazione Microaggregati Filtri di selezione/profondità in tessuto; diametro dei pori: 40 µm Third Leukocytes Nonwoven web of microfibers; fiber diam: 2-20 µm Terza generazione Leucociti Reti di microfibre; diametro dei pori: 2-20 µm b- Filtration Advances in filtration technology have made consistent production of leukoreduced components a viable option. Table II summarizes the changes in filtration over recent years. 1- Mechanism of Filtration Removal of leukocytes by filtration results primarily from retention by a barrier. The interior of most modern leukocyte removal filters consists of layers of synthetic mesh made of nonwoven fibers. The design is such that the blood entering the filter encounters a large surface area of the medium. Optimally, the blood cannot bypass the filtration medium and the amount of blood retained in the filter is minimal. Adsorption of leukocytes to the synthetic fibers also contributes to leukoreduction. Modification of synthetic surfaces, by increasing "wettability" to decrease the surface tension or by alteration in surface charge of the fibers 6, has improved the performance of filters. Biological mechanisms also influence leukoreduction. Electron microscopic analysis of filters demonstrates that platelets undergo activation and spreading on the surface of filter fibers during filtration of red blood cells. Leukocytes, especially polymorphonuclear leukocytes, adhere to the activated platelets and are removed 7. Platelets may also contribute by forming microaggregates that trap cells Factors Affecting Filtration Performance As leukoreduction methods have evolved, the factors that influence the residual number of leukocytes have become increasingly important as variables that can be controlled to improve the quality of the end product. These factors are summarized in Table III. The capacity of the filter used is of prime importance in the degree of leukoreduction achieved. Current high-performance filters can reduce the residual WBC content by 3-4 logs. The input load of the WBCs to be filtered has a direct relation b- Filtrazione I progressi che si sono ottenuti nella tecnologia della filtrazione hanno reso una opzione valida la coerente produzione di emocomponenti leucodepleti. La tabella II sintetizza i cambiamenti verificatisi negli anni recenti in materia di filtri. 1- Meccanismo della filtrazione La rimozione dei leucociti mediante filtrazione rappresenta il prodotto dell'azione di una barriera che trattiene. L'interno della maggior parte dei filtri moderni per la rimozione dei GB consiste di diversi strati di maglie di materiale sintetico costituito da fibre di non-tessuto. Il sangue che entra nel filtro viene così a contatto con un'estesa superficie di questo materiale. Nella condizione migliore, il sangue non può bypassare il materiale filtrante ma, nel contempo, la quantità di sangue trattenuta dal filtro è minima. Anche l'adesione dei leucociti alle fibre sintetiche contribuisce alla leucodeplezione. Modificare le superfici di materiale sintetico, accrescendone la "bagnabilità" per diminuzione di tensione superficiale o per alterazione della carica di superficie dei filtri 6, ha consentito il miglioramento nelle prestazione dei filtri stessi. Anche alcuni meccanismi biologici influenzano la leucoriduzione. Le analisi dei filtri al microscopio elettronico dimostrano che le piastrine si attivano e si spandono sulla superficie delle fibre durante la filtrazione di globuli rossi. I leucociti, in particolare i polimorfonucleati, aderiscono alle piastrine così attivate e vengono rimossi 7. Le piastrine possono anche contribuire alla rimozione formando microaggregati che intrappolano i GB Fattori che influenzano le prestazione dei filtri Via via che le metodiche di leucodeplezione evolvevano, i fattori che potevano influenzare il numero residuo di linfociti assumevano una crescente importanza quali variabili che potevano essere controllate al fine di migliorare la qualità del prodotto finale. Tali fattori vengono elencati in tabella III. La capacità filtrante di un apparato è di primaria 349

4 AB McDonald, WH Dzik Table III: factors affecting filter performance Tabella III: fattori che influenzano le prestazioni dei filtri per leucodeplezione Capacity of the filter Input number of leukocytes Flow rate, pressure, priming, rinsing Temperature, viscosity Number and function of platelets Holding time between blood collection and filtration Erythrocyte and leukocyte deformability Plasma content of cell suspension media Capacità globale del filtro Numero di leucociti nell emocomponente all inizio della filtrazione Ritmo di flusso, pressione, attivazione del filtro, lavaggio Temperatura, viscosità dell emocomponente Numero e funzionalità delle piastrine Tempo intercorso fra il prelievo del sangue e la sua filtrazione Deformabilità delle emazie e dei leucociti Contenuto in plasma del medium di sospensione cellulare to the postfiltration WBC content. Manufacturers' guidelines provide filter capacity, or number of units of RBCs or platelets, for the average WBC load. The cellular composition of the input product will affect the filtration process in other ways, too. For example, elevated hematocrit in red cell concentrate may result in slightly decreased leukocyte removal performance because of inhibited leukocyte approach to adsorption points 9. The nature of the erythrocyte may also affect filter performance. Filtration of hemoglobin AS (sickle cell trait) blood results in poorer WBC removal than does filtration of hemoglobin AA blood 10,11. It is thought that sickling of the red cells within the filter results in obstruction of flow, preventing adequate contact of the leukocytes with the filtration medium. Platelets in red cell concentrates also influence filtration. Filters have decreased retention for fresh RBCs in the presence of platelets; this has been attributed to biological interaction between platelets and WBCs that promotes retention of the latter 8. The flow rate through the filter is also a factor in leukoreduction; accelerated blood flow (100 ml/min) is associated with decreased reduction 9. This may result from partial detachment of adsorbed leukocytes due to accelerated shear stress or from decreased contact time with the filtration medium. Alternatively, slow filtration rate may result in insufficient pressure to ensure adequate contact of leukocytes with the filtering medium or may allow an increase in temperature resulting in increased leukocyte deformability 12. Studies have shown that the efficiency of filtration is improved at refrigerated temperatures 13. The reason for this may relate to decreased plasticity of leukocytes at lower temperatures. The medium in which cells are suspended also influences the efficiency of leukoreduction. The addition of small volumes of plasma to RBCs suspended in SAGMAN (saline/adenine/glucose/ manitol)-additive solution resulted in a marked improvement in filtration efficiency 14. This may result from adhesive proteins present in plasma contributing to leukocyte retention. importanza per raggiungere un determinato grado di leucodeplezione. I filtri ad alta efficienza attualmente disponibili sono in grado di ottenere una riduzione dei leucociti residui di 3-4 logaritmi. La quantità di GB negli emocomponenti influenza direttamente il contenuto di leucociti che residua dopo la filtrazione. Le istruzioni dei produttori forniscono i dati sulla capacità dei filtri o sul numero di unità di CE o CP che si possono filtrare in base alla quantità media dei GB presenti. La composizione in cellule del prodotto da sottoporre alla filtrazione influenza il procedimento anche in altri modi. Per esempio, un elevato ematocrito nel CE può determinare una prestazione leggermente meno efficace, dato che può inibire ai leucociti l'approccio ai punti di adesione 9. Anche le caratteristiche degli eritrociti possono alterare le prestazioni dei filtri. La filtrazione di emazie contenenti HbS (emazie falcemiche) è assai meno efficace di quella di emazie a emoglobina normale (HbA) 10,11. Si ritiene che la falcemizzazione degli eritrociti all'interno dei filtri determini una ostruzione al passaggio, impedendo un contatto adeguato fra leucociti e materiale filtrante. Anche le piastrine contenute in un CE possono influenzare la filtrazione. I filtri, infatti, hanno una ridotta capacità di trattenere i leucociti con CE freschi contenenti piastrine: questo fatto è stato attribuito a un'interazione biologica fra piastrine e GB 8. Pure la velocità di flusso attraverso il filtro rappresenta un fattore nella leucodeplezione: un aumento del flusso (100 ml/min) si associa ad una deplezione ridotta 9. Ciò può essere in relazione a un distacco parziale dei leucociti adesi al filtro per uno stress provocato da forze elastiche laterali accelerate o per ridotti tempi di contatto con il materiale filtrante. Alternativamente, un flusso a velocità ridotta può determinare una pressione insufficiente ad assicurare un contatto adeguato fra materiale filtrante e leucociti o può determinare un aumento della temperatura che, a sua volta, provoca un aumento della deformabilità leucocitaria 12. Infatti, studi al riguardo hanno dimostrato che l'efficienza della filtrazione viene aumentata da basse temperature. 13. La ragione di ciò potrebbe essere in relazione a una ridotta plasticità dei leucociti a temperature di refrigerazione. Anche 350

5 Leucodeplezione Table IV: advantages and disadvantages of timing of filtration Tabella IV: vantaggi e svantaggi dei differenti momenti della filtrazione Prestorage In blood bank At bedside Prima della conservazione In laboratorio (nel SIT) Al letto del ricevente Advantages Vantaggi May prevent accumulation of cytokines Red cell units filtered in short time span-? Convenience-filter added to intravenous of donor origin during storage improved leukoreduction line at time of filtration Previene l accumulo di citochine I CE vengono filtrati in minor tempo Comodità. Il filtro può essere aggiunto durante la conservazione (migliore deplezione?) al set da infusione May decrease risk of bacterial Smaller no. of staff performing contamination procedureless variability Può diminuire il rischio di Meno persone si occupano contaminazione batterica della procedura (minore variabilità) Leukoreduced units readily available Easier to control quality on request compared with bedside filtration Le unità leucodeplete sono I CQ sono più facili immediatamente disponibili (rispetto alla filtrazione bedside) Easier to control quality Record of special needs compared with bedside filtration of particular patients I controlli di qualità (CQ) sono più facili Vi può essere adattamento alle necessità (rispetto alla filtrazione bedside) di particolari riceventi Disadvanteges Svantaggi Transfusion of leukoreduced components to patients with no defined clinical indication Gli emocomponenti leucoridotti sono utilizzati indipendentemente dalle necessità del paziente Additional labor cost in blood bank Costi-lavoro aggiuntivi per il SIT May not remove leukocyte fragments that accumulate during storage Frammenti leucocitari formatisi durante la conservazione possono non essere rimossi Does not remove cytokines that may accumulate during storage Non vengono rimosse le citochine accumulate durante la conservazione delle piastrine Cost of filter Costo del filtro Filtration occurs slowly (2-4h)-red cell unit warms-may led to less efficient filtration La filtrazione avviene lentamente (2-4 h), le emazie si riscaldano, il che può determinare una filtrazione meno efficace More difficult to institute quality control measures Difficile istituire CQ validi Units which fail QC have already been transfused Le unità che non rispettano i CQ sono già state trasfuse More staff involved in process more difficult to institute standard procedures Più persone coinvolte nel procedimento: più difficile istituire procedure standard Cost of filter Costo del filtro 3- Timing of Filtration Leukocyte reduction can be performed before storage, before issuance from the blood bank, or at the bedside (Table IV) 15. Prestorage leukoreduction is gaining acceptance as the use of leukoreduced components becomes more routine. In-line filtration (a blood bag system with integrated filter) allows for separation of components and filtration without the need for opening the system, thereby avoiding contamination and bacterial overgrowth during subsequent storage. Prestorage leukoreduction has theoretical advantages of standardization and easy availability of filtered units. Prestorage leukoreduction may decrease the incidence of febrile nonhemolytic transfusion la soluzione nella quale sono risospese le cellule ematiche può influenzare la leucodeplezione. L'aggiunta di piccole quantità di plasma ad emazie sospese in una soluzione additiva SAG-MAN (salina/adenina/glucosio/mannitolo) si accompagna a una efficacia di filtrazione marcatamente accresciuta 14. Questo potrebbe essere in relazione alle capacità adesive di alcune proteine presenti nel plasma che contribuirebbero a trattenere leucociti. 3- Scelta del momento della filtrazione La leucodeplezione di un emocomponente può essere effettuata prima della sua conservazione (cosiddetta prestorage), prima della distribuzione dal servizio trasfusionale 351

6 AB McDonald, WH Dzik reactions (FNHTRs) from platelet transfusion that results from passive transfer of cytokines. In an animal model 16, the incidence of platelet refractoriness was decreased by prestorage leukoreduction. This may have resulted from removal of leukocyte fragments that may not be removed during poststorage filtration. The issue of the importance of leukocyte fragments has not been resolved. Some studies in an animal model indicate a greater degree of platelet refractoriness following transfusion of plasma supernatant of blood leukoreduced after storage when compared with that leukoreduced before storage 17. However, it has also been demonstrated that leukoreduction had no effect on soluble class I human leukocyte antigen (HLA) substance, and that deliberately prepared leukocyte fragments bearing HLA antigens did not seem to stimulate an alloimmune response in vitro 18. There have not yet been any clinical trials in humans to determine the effect of prestorage versus poststorage leukoreduction on prevention of alloimmunization. Therefore, the issue remains unresolved. The choice of filtration in the laboratory prior to issuance by the blood bank versus filtration at the bedside would appear to many to be a minor issue in leukoreduction. However, recent investigations have confirmed that bedside filtration may be less than optimal in many cases for a variety of reasons. Bedside filtration carries the advantage that expensive filters are restricted to units transfused to patients for whom leukoreduction is indicated. However, concerns have arisen regarding the quality of leukoreduction during bedside filtration. Ledent and Berlin 12 found a 78% failure rate (>5x10 6 WBC/unit) when leukoreduction was performed under conditions mimicking those of bedside filtration. The failure rate when performed as in a blood bank setting was less than 1%. The major difference in conditions was flow rate, with the rate at the bedside very much slower than that in the laboratory. Slow filtration allows time for warming of the unit, perhaps allowing increased leukocyte deformability and thus less efficient removal of leukocytes. Deliberate warming of blood to 27 C resulted in a 20-fold increase in the number of leukocytes passing through the filter 19, adding further weight to the importance of temperature control. Therefore, the ideal time span in which to filter a unit of red cells would appear to be slow enough so as not to generate excess shearing forces on the white cells trapped in the filter, yet fast enough to minimize any potential warming of the unit. Filtration at a relatively fast flow rate (by gravity over minutes), rather than the slow flow at the bedside (over 2-3 hours), would appear to be the most appropriate. Familiarity with the process of leukoreduction and adequate staff training may be further variables in the (post-storage) o al letto del ricevente (bedside) come illustrato in tabella IV. La filtrazione pre-storage sta guadagnando consensi dato che l'uso di emocomponenti leucodepleti diviene routinario. La filtrazione in-linea (utilizzando sacche con filtro integrato) permette la separazione dei componenti in un sistema chiuso, evitando, quindi, la contaminazione e la proliferazione batterica durante la successiva conservazione. La leucodeplezione pre-storage ha il teorico vantaggio di una standardizzazione e di una immediata disponibilità di unità filtrate. Essa è in grado di ridurre l'incidenza di reazioni febbrili non emolitiche nelle trasfusioni piastriniche per trasferimento passivo di citochine. In un modello animale 16, l'incidenza di refrattarietà piastrinica risultava diminuita dalla leucodeplezione prestorage. Ciò potrebbe essere in relazione alla rimozione di frammenti leucocitari che non possono essere allontanati con la filtrazione post-storage. L'importanza di questi frammenti di leucociti non è stata del tutto accertata. Alcuni studi su modelli animali indicano una maggiore incidenza di refrattarietà piastrinica conseguente a trasfusioni di sopranatanti di plasma provenienti da emocomponenti leucodepleti dopo la conservazione rispetto a quelli provenienti da emocomponenti leucodepleti prima della conservazione 17. Tuttavia, si è anche dimostrato che la leucodeplezione non ha alcun effetto sugli antigeni HLA solubili di I classe e che frammenti di antigeni leucocitari HLA deliberatamente preparati non sembrerebbero stimolare una risposta alloimmune in vitro 18. Non sono state ancora condotte ricerche cliniche su soggetti umani al fine di determinare gli effetti della leucodeplezione prestorage rispetto a quella post-storage sulla prevenzione dell'alloimmunizzazione. Il problema rimane, quindi, irrisolto. La scelta di utilizzare la filtrazione in laboratorio prima della distribuire di un emocomponente da parte del SIT nei riguardi della filtrazione bedside potrebbe apparire a molti di minor impatto. Tuttavia, recenti indagini hanno confermato che la filtrazione bedside è meno ottimale in molti casi per una serie di motivi. La filtrazione bedside ha il vantaggio che l'uso di filtri particolarmente costosi è riservato ai soli pazienti per i quali l'impiego di emocomponenti leucoridotti è indicato. Tuttavia, sono sorti problemi circa la qualità della leucodeplezione durante la filtrazione bedside. Ledent e Berlin 12 hanno riscontrato una percentuale del 78% di fallimento (> 5x10 6 GB/unità) quando la leucodeplezione veniva condotta in condizioni che riproducevano quelle della filtrazione bedside. Nella filtrazione eseguita imitando le condizioni della filtrazione in laboratorio, il fallimento incideva per meno dell'1%. La maggiore differenza riguardava la velocità di flusso, che nel bedside era molto più lenta rispetto a quella ottenibile in laboratorio. Una filtrazione lenta determina il 352

7 Leucodeplezione process of leukoreduction. Sirchia et al. 20 initially found that, in a hematology outpatient setting with staff trained in the use of bedside filters, the quality of leukoreduced product was not significantly different from that filtered in the laboratory setting. However, subsequent studies at the same center 19 found that, even under ideal conditions for bedside filtration, there was a 5% filtration failure rate. Again, the issue of rise in temperature during filtration was felt to be important, with improved results if transfusion was completed within 100 minutes of removal of the blood from the refrigerator. In addition to the important issue of quality control, other considerations may influence the decision concerning when to leukoreduce blood. One issue investigated recently is the effect of leukoreduction on the likelihood of bacterial overgrowth of blood products. Investigation of the potential role of leukoreduction has involved experiments using deliberate inoculation of units. Units of blood are "spiked" with varying concentrations of bacteria and then split into pairs, one of which is then filtered. Comparison of bacterial growth is then made at variable times. Most RBC experiments have focused on Yersinia enterocolitica, the most commonly encountered serious bacterial contaminant in RBCs. A significant reduction in bacterial concentration occurs during the time between inoculation and filtration (7 hours at room temperature) - an effect attributed to the natural antibacterial properties of blood 21. In addition, it was found that if the initial inoculation was of low concentration, filtration was successful in preventing bacterial overgrowth at 42 days. However, overgrowth during storage was not prevented when higher initial concentrations (greater than 3 colony-forming units/ml) were used. Whether or not routine prestorage filtration of white cells may be of benefit in reducing bacterial overgrowth in the clinical setting is not known. The optimal time to filter is not clear, but it appears there may be a benefit in an early delay to allow bacteriocidal activity of polymorphonuclear phagocytes in the first few hours after collection 22. However, the application of chemical sterilants may, in the future, make discussion of leukoreduction for this reason unnecessary. Prevention of the storage lesion has also been proposed as an argument in favour of widespread use of prestorage leukoreduction. It was initially felt that leukocyte degeneration during storage would result in release of lysosomal enzymes that could damage the red cell or platelet. However, comparison studies have shown little difference in the degree of hemolysis of red cells stored with or without prestorage leukoreduction, and in vivo survival studies failed to show any advantage to prestorage filtration. Prestorage filtration of platelet concentrates also riscaldamento dell'unità, favorendo forse una accresciuta deformabilità dei leucociti e, quindi, una loro rimozione meno efficace. Un deliberato riscaldamento del sangue a 27 C determinava un aumento di venti volte dei leucociti che attraversavano il filtro 19, fornendo ulteriore peso all'importanza di controllare la temperatura. Quindi, l'ideale intervallo di tempo per filtrare un'unità di emazie deve essere abbastanza lungo da non generare un eccesso di forze elastiche sui GB intrappolati nel filtro ma anche sufficientemente breve da minimizzare ogni possibile riscaldamento dell'unità. Sembra più appropriato un flusso relativamente rapido (intorno ai minuti, per gravità) piuttosto che uno lento, come nel bedside (oltre 2-3 ore). La dimestichezza con le procedure di leucodeplezione e un adeguato addestramento del personale possono essere ulteriori variabili. Sirchia et al 20 hanno inizialmente constatato che, in pazienti ematologici ambulatoriali trattati da personale particolarmente preparato nell'uso di filtri bedside, la qualità della leucoriduzione non era significativamente differente da quella ottenibile in laboratorio. Tuttavia, studi successivi effettuati allo stesso Centro 19 hanno dimostrato che, anche nelle condizioni ideali di utilizzo di filtri bedside, si assisteva a una percentuale di fallimento del 5%. Ancora, si riteneva che l'aumento della temperatura durante il procedimento rappresentasse il dato più importante, poiché si miglioravano i risultati se la trasfusione veniva completata entro 100 minuti dall'uscita dell'unità di sangue dal frigorifero. Oltre all'importanza dei controlli di qualità, anche altre considerazioni possono influenzare le decisioni circa il momento migliore di procedere alla leucodeplezione. Un problema studiato di recente riguarda gli effetti della leucoriduzione sulla probabilità di proliferazione batterica negli emocomponenti. Si sono eseguiti esperimenti usando deliberatamente inoculazioni batteriche in unità ematiche. Le unità di emocomponenti venivano contaminate con varie concentrazioni di batteri e poi suddivise in due parti, una delle quali veniva filtrata. Le comparazioni circa la proliferazione batterica venivano effettuate a tempi diversi. La maggior parte degli esperimenti su CE erano incentrate sulla Yersinia enterocolitica, quale batterio più comunemente incontrato come contaminante di CE. Una riduzione significativa nella concentrazione batterica si riscontrava nell'intervallo di tempo fra l'inoculazione e l'inizio della filtrazione (7 ore a temperatura ambiente), effetto che si attribuiva alle proprietà antibatteriche del sangue 21. Inoltre, si constatava che se l'inoculazione iniziale era a bassa concentrazione, la successiva filtrazione era in grado di impedire la proliferazione batterica per 42 giorni. Tuttavia, non si riusciva a prevenire tale proliferazione quando venivano impiegate concentrazioni batteriche iniziali più 353

8 AB McDonald, WH Dzik Table V: methods of leukoreduction: advantages and disadvantages Tabella V: metodi per la leucodeplezione: vantaggi e svantaggi Method % of removal Advantages Disadvantages of leukoreduction Metodo % di rimozione Vantaggi Svantaggi di leucodeplezione Centrifugation 70-80% Simple inexpensive method Variable degree of leukoreduction Centrifugazione Metodo semplice ed economico Grado variabile di leucodeplezione Adequate for prevention of FNH Inadequate for many of clinical indications for transfusion reactions leukoreduction Previene le reazioni febbrili Non adatto per molte indicazioni non-emolitiche a prodotti leucodepleti Freeze/thaw/wash 90-95% Relatively simple method Time-consuming Congelamento/ Metodo relativamente semplice Prolisso scongelamento/lavaggio Adequate for most clinical indications Significant red cell loss may occur for leukoreduction* Può determinare notevoli perdite di emazie Adatto a molte indicazioni cliniche Red cells must be transfused within 24h per prodotti leucodepleti* (risk of contamination) Le emazie vanno trasfuse entro 24 h (rischio contaminazione) Filtration 99.9% Simple, higly efficient method Expense Filtrazione Semplice ed efficace Costo Adequate for most indications Potential red cell/platelet loss for leukoreduction* Possibile perdita di emazie e di piastrine Adatto a molte indicazioni per prodotti leucodepleti* Low-WBC 99.9% Leukoreduction at source Expense apheresis platelets Adequate for most clinical Costo CP da aferesi indications for leukoreduction* a basso contenuto Adatto a molte indicazioni cliniche in leucociti per prodotti leucodepleti* * Inadequate for prevention of transfusion-associated graft versus host disease * Non previene la malattia dell innesto contro l ospite (GvHD) failed to have any major impact on either in vitro measures of effects of storage or post-transfusion survival of radiolabeled platelets. c- Low Leukocyte Apheresis Platelets In recent years, improvements in apheresis technology have led to increased collection of platelets with decreased concentration of residual donor leukocytes in the final product (Table V). Further reduction has been achieved by some manufacturers through the use of in-line filters in the disposable tubing used in the process. One large study evaluated the performance of the MCS+ system (Haemonetics Corporation, Braintree, MA). With the use of an in-line filter, it was found that 98.3% of 432 collections contained less than 5x10 6 leukocytes. Collection variables, such as use of donors with platelet count less than 200,000 per µl, lipemic samples, anticoagulant curate dextrose solution (ACD) reactions, or red cell contamination, were found to predict those collections in which leukoreduction was not adequate 23. Manipulation of the path of the blood flow during apheresis has also been used by manufacturers to improve alte (oltre 3 unità formanti colonie per ml). Non si conosce se la filtrazione pre-storage è in grado di ridurre la proliferazione batterica. Non è, quindi, chiaro quale sia il tempo ottimale per la filtrazione, ma sembra possa essere vantaggioso un iniziale ritardo per permettere l'attività battericida dei fagociti polimorfonucleati nelle prime ore dopo la raccolta 22. Tuttavia, l'uso di sterilizzanti chimici potrebbe, in futuro, rendere inutili le discussioni su questo argomento. Anche le lesioni provocate dalla conservazione sono state proposte come argomento a favore della leucodeplezione pre-storage. Si era ritenuto, in un primo momento, che la degenerazione dei leucociti durante la conservazione determinasse il rilascio di enzimi lisosomiali in grado di danneggiare emazie e piastrine. Tuttavia, studi di comparazione hanno dimostrato esistere piccole differenze per quanto riguarda l'emolisi di globuli rossi conservati con o senza una leucodeplezione pre-storage e anche gli studi di sopravvivenza in vivo delle emazie non hanno evidenziato alcun vantaggio offerto dallo stesso tipo di filtrazione. Anche la filtrazione pre-storage di CP ha mancato di evidenziare un favorevole impatto sia su misurazioni in vitro degli effetti della conservazione che sulla sopravvivenza in vivo di piastrine radiomarcate. 354

9 Leucodeplezione separation of cellular elements. In the COBE BCT Spectra system (Lakewood, CO), a platelet-rich interface is separated from the denser red cells by centrifugation, the interface then being drawn towards a separation "dam". Platelets, being more buoyant, rise over the dam and continue to flow in the same direction to the outlet line and platelet collection bag. Leukocytes, being less buoyant, are drawn in the opposite direction toward the red cell return line. This counterdirectional flow of platelets improves separation of these cellular components. In recent times, further modifications have been made by the same company with the introduction of the Spectra Leukocyte Reduction System (Spectra LRS) based upon the principle of fluidized particle bed separation. A cone-shaped chamber is added to the disposable set at the platelet collection line. The platelet concentrate enters at the narrow base of the conical chamber. Flow patterns that develop in the widening portion of the chamber result in slowing of particle velocity. The deceleration is greatest for heavy particles, such as leukocytes, while lighter particles, such as platelets, advance to the higher chamber level and subsequently escape to the collection bag. The width of the conical chamber increases in stepwise gradations. The design is such that any white cells that advance to a higher level are directed back into the center of the chamber and away from the outlet by the spinning forces. The conical chamber narrows at the top, resulting in acceleration of the platelets prior to entering the outlet tubing. Preliminary results indicate that this method achieves leukoreduced products without the need for secondary filtration 24. An alternative method used in the CS3000 series of Baxter Biotech (Round Lake, IL) involves the initial separation of platelet-rich plasma from the leukocytes and red cells in a separation chamber. The leukocytes and red cells are returned to the patient, while the platelet-rich plasma enters a second chamber and is centrifuged with return of the plasma to the patient. The manufacturers have again used the geometry of the separation chamber to minimize the number of leukocytes remaining in the platelet-rich plasma. In addition, a system of optics monitors the density of the platelet-rich plasma and can be adjusted to achieve consistently leukoreduced platelet collections. Counting methods for low leukocyte numbers It is important in terms of the clinical, financial, and technical aspects of leukoreduced components to verify that the end product meets expectations for leukocyte c- Concentrati piastrinici (CP) da aferesi a basso contenuto di leucociti In questi ultimi anni, miglioramenti nella tecnologia aferetica hanno fatto aumentare la raccolta di concentrati piastrinici con basso numero di leucociti residui nel prodotto finale (Tabella V). Alcuni produttori hanno conseguito ulteriori deplezioni con l'impiego di filtri in linea posti sui set (a perdere) durante le procedure di prelievo in aferesi. Un ampio studio ha valutato le prestazioni del sistema MCS+ (Haemonetics Corporation, Braintree, MA). Con l'uso del filtro in linea, si è potuto verificare che il 98,3% di 432 raccolte in aferesi conteneva meno di 5x10 6 leucociti. Le variabili relative al prelievo, quale l'uso di un donatore con una conta piastrinica inferiore a /µL, la lipemia del campione, le reazioni da ACD o la contaminazione da globuli rossi, si dimostrarono in grado di far predire raccolte con una leucodeplezione inadeguata 23. Sono state anche utilizzate manipolazioni del flusso ematico durante l'aferesi per migliorare la separazione degli elementi cellulari. Nel sistema BCT Spectra della COBE (Lakewood, CO) un interfaccia ricca di piastrine è separata, per centrifugazione, dai più densi globuli rossi e viene attirata verso una "diga" di sbarramento. Dato che le piastrine galleggiano meglio, superano la diga e continuano a scorrere nella stessa direzione sino alla via d'uscita e alla sacca di raccolta. Invece i leucociti, che galleggiano meno, sono tratti in direzione opposta verso la linea di ritorno dei globuli rossi. Tale flusso antidirezionale delle piastrine migliora la loro separazione. Più recentemente, la stessa ditta ha apportato ulteriori modifiche con l'introduzione dello Spectra LRS (Leukocyte Reduction System) basato sul principio della separazione su letto di particelle fluide. Una camera di raccolta a forma conica è stata aggiunta al set (non riusabile) di raccolta delle piastrine. Il concentrato piastrinico entra nel punto più stretto della camera conica. Il flusso che si sviluppa nella parte più larga della camera determina un rallentamento della velocità delle particelle. La decelerazione è maggiore per le particelle più pesanti, quali i leucociti, mentre le particelle più leggere, quali le piastrine, avanzano al livello più alto della camera e successivamente sfuggono nella sacca di raccolta. L'ampiezza della camera conica favorisce la gradualità della raccolta. Il modello è così concepito che ogni globulo bianco che si porti a un livello più alto viene respinto indietro al centro della camera e allontanato dalla via di uscita dalle forze centrifughe. La camera conica si restringe verso l'alto, determinando una maggior accelerazione delle piastrine verso la via d'uscita. Risultati preliminari indicano che questo metodo realizza una leucodeplezione senza richiedere una successiva filtrazione 24. Un metodo alternativo utilizzato nella serie di separatori CS3000 della Baxter Biotech (Round Lake, IL) suddivide inizialmente nella camera di separazione il plasma ricco di piastrine (PRP) dai leucociti e dagli eritrociti. Globuli bianchi e globuli rossi ritornano al donatore, mentre il PRP entra in una seconda camera di separazione, viene 355

10 AB McDonald, WH Dzik content. The low concentration of white cells now achieved in many products is below the threshold of routine methods of counting cells. In some circumstances it may be adequate to ensure that a product has "passed" or "failed" in terms of the accepted standard of leukoreduction. However, the lower limit of leukoreduction at which all the various adverse effects of transfused white cells can be seen has not yet been determined. As such, development of improved counting methods has paralleled the development of improved leukoreduction. This is important in order to evaluate new technology critically and to gain a better understanding of clinical trials involving leukoreduced components. Methods to count residual leukocytes have used light or fluorescent microscopy, radioimmunoassays, flow cytometry, volumetric capillary cytometry, and the polymerase chain reaction (PCR) 25. The most widely used method involves a large volume (50 µl) hemocytometer (Nageotte chamber). The sample to be counted is mixed with a red cell or platelet lysing agent and a nuclear stain, allowed to settle undisturbed in the counting chamber, and then examined under 200x magnification. When viewed by a trained observer, the method is simple and has been shown to be accurate to approximately 1 WBC per µl 26. By concentrating a larger volume prior to sampling, the lower limit of detection of Nageotte-based methods may be reduced even further 27. Flow cytometry, by which a larger volume of sample can be analyzed, achieves a lower limit of accurate detection of 0.1 WBC per µl. Most flow cytometric methods stain leukocytes with a fluorescent nuclear stain and analyze the emission of light. The major disadvantage of this method is the need for expensive instrumentation. Other methods that have not yet achieved widespread use include volumetric capillary cytometry and PCR-based counting methods. PCR-based methods have an acceptable lower limit of detection, but have disadvantages of labor intensity, equipment cost, and sample contamination. Clinical indications for leukoreduction a- Prevention of Febrile NonHemolytic Transfusion Reactions (FNHTR) Febrile nonhemolytic transfusion reactions (FNHTRs) can be a troublesome and often frightening aspect of transfusion to both patient and clinician. Modest reduction in the WBC count was found to be effective in reducing this complication with RBC transfusion, and prevention of FNHTRs is an established indication for transfusion of leukoreduced components. centrifugato e il plasma restituito al donatore. I produttori hanno ancora usato la forma geometrica della camera di separazione per ridurre al minimo i leucociti che restano nel PRP. Inoltre, un sistema ottico monitorizza la densità del PRP e può essere adattato per ridurre consistentemente la quantità di leucociti nella raccolta piastrinica. Metodi di conteggio per un basso numero di leucociti È importante, per motivi clinici, finanziari e tecnici riguardanti gli emocomponenti leucodepleti, verificare se il prodotto finale risponde alle attese per quanto riguarda il contenuto in leucociti. La bassa concentrazione di leucociti che si ottiene in molti prodotti è sotto la soglia degli usuali metodi di conteggio. In qualche circostanza può essere sufficiente assicurarsi che il prodotto "ha superato" o "non ha superato" gli standard accettati di leucoriduzione. Tuttavia, non è stato ancora precisato il più basso limite di leucodeplezione al quale possono intervenire tutte le reazioni avverse dovute ai GB trasfusi. Al riguardo, lo sviluppo di progrediti metodi di conteggio è andato di pari passo con lo sviluppo di migliori tecniche di leucodeplezione. Questo fatto riveste notevole importanza per valutare le nuove tecnologie e per raggiungere una migliore comprensione dei problemi clinici relativi agli emocomponenti leucodepleti. Per contare i leucociti residui si sono utilizzati diversi metodi: microscopia ottica e a fluorescenza; test radioimmunologici; citometria a flusso; citometria volumetrica capillare; reazione polimerasica a catena (PCR) 25. Il metodo più largamente impiegato è l'emocitometro ad ampia camera (50 µl) di Nageotte. Il campione da contare viene mescolato con una soluzione che lisa eritrociti e piastrine e con un colorante nucleare, viene lasciato riposare nella camera di conteggio e poi esaminato a 200 ingrandimenti. Se letto da un esaminatore esperto, il metodo risulta semplice e in grado di contare, approssimativamente, 1 leucocita per µl 26. Mediante la concentrazione di un campione più ampio, il limite inferiore di individuazione del metodo basato sulla camera di Nageotte può essere ulteriormente abbassato 27. La citometria a flusso, con la quale si possono esaminare campioni di volume maggiore, raggiunge un livello inferiore di accuratezza pari a 0,1 leucocita per µl. La maggior parte dei metodi citometrici colora i leucociti con un colorante nucleare fluorescente e analizza l'emissione di luce. Lo svantaggio più grande di questo metodo risiede nella necessità di una apparecchiatura costosa. Gli altri metodi, che non hanno avuto larga diffusione, sono la citometria volumetrica capillare e la tecnologia PCR. Le metodiche basate sulla PCR hanno un limite inferiore di individuazione accettabile ma hanno lo svantaggio di un 356

11 Leucodeplezione Table VI: mechanisms of FNH transfusion reactions Tabella VI: meccanismi delle reazioni febbrili trasfusionali non emolitiche (FNHTR) Mechanism Source of cytokines Clinical situation Meccanismo Sorgenti delle citochine Situazione clinica Classic Donor WBCs Recipient leukocyte antibodies attack donor WBCs Classico Leucociti del donatore Donor cells release cytokine Prevented by leukoreduction Gli anticorpi del ricevente attaccano i GB del donatore Questi rilasciano citochine Reazione prevenuta dalla leucodeplezione Passive cytokines Donor WBCs Cytokines released in components stored at room temperature Citochine introdotte Leucociti del donatore and passively infused passivamente Citochine liberate nei componenti conservati a temperatura ambiente Prevented by leukoreduction prior to storage Reazione prevenuta dalla leucodeplezione pre-storage Immune complex Recipient WBCs Recipient antibodies to cells (or proteins) in donor Immunocomplessi Leucociti del ricevente unit attack donor material after trasfusion Resulting immune complexes trigger recipient immune system to release cytokines Anticorpi del ricevente diretti contro cellule o proteine del donatore attaccano il materiale antigenico del donatore dopo la trasfusione I complessi immuni circolanti spingono il sistema immune del ricevente a liberare citochine Leukoreduction confers incomplete protection La leucodeplezione determina una protezione incompleta The cause of FNHTRs may be multifactorial, with the final common pathway being elaboration of inflammatory cytokines that react with receptors in the thermoregulatory centers of the brain. Proposed mechanisms for FNHTRs (Table VI) include recipient antibodies reacting with donor leukocytes, release of inflammatory cytokines by recipient cells in response to antigen-antibody complexes between recipient antibody and donor antigenic material 28, and the passive transfer of inflammatory cytokines that may accumulate in platelets during storage 29. Filtration of RBCs has been found to be effective in prevention of FNHTRs in multitransfused patients. Conversely, prevention of FNHTRs with platelet concentrate transfusion has been found to be more difficult 30, favouring the hypothesis that passive transfer of cytokines accumulating during storage is a causative factor. Prestorage leukoreduction of platelet concentrates has been found to moderate the increase in cytokine concentration that occurs with storage 31. Further studies have shown a lower incidence of reactions to plasma-reduced concentrates compared with poststorage leukoreduced units 32. b- Prevention of HLA alloimmunization Formation of HLA alloantibodies has been recognized as one of the causes of refractoriness to platelet transfusions. Prevention of this immunization has been impegno pesante, di apparecchiature e materiale di consumo costosi e della possibile contaminazione del campione. Indicazioni cliniche per la leucodeplezione a- Prevenzione delle reazione trasfusionali febbrili non emolitiche Le reazioni trasfusionali febbrili non emolitiche (universalmente note come FNHTR, da Febrile Non Haemolytic Transfusion Reactions) possono rivestire un aspetto preoccupante e spesso allarmante della trasfusione sia per il paziente che per il clinico. Si è dimostrato che anche una modesta riduzione del numero di leucociti è in grado di ridurre questa complicazione della trasfusione di CE e la prevenzione di FNHTR è fra le indicazioni primarie della leucodeplezione. La patogenesi delle FNHTR può essere multifattoriale, con la comune elaborazione di citochine infiammatorie che reagiscono con recettori del centro cerebrale di termoregolazione. I meccanismi proposti (Tabella VI) contemplano: anticorpi del ricevente che reagiscono con i leucociti del donatore; rilascio di citochine infiammatorie da parte di cellule del ricevente in risposta a complessi antigeneanticorpo che si formano fra gli anticorpi del ricevente e materiale antigenico del donatore 28 ; trasferimento passivo di citochine infiammatorie che si accumulano nei CP durante la conservazione 29. La filtrazione di CE si è dimostrata 357

12 AB McDonald, WH Dzik attempted with the use of leukoreduced components. It has been shown that the use of leukoreduced components has decreased the overall incidence of HLA sensitization among multiply transfused patients 33. Analyses of particular subgroups of patients have demonstrated in some studies that, for patients previously exposed to HLA antigens, such as females with history of pregnancy, the use of leukoreduced components did not as effectively prevent immunization or delay time to development of refractoriness 34. The National Institutes of Health Trial to Reduce Alloimmunization to Platelets found that transfusion support with leukoreduced pooled platelets, leukoreduced apheresis platelets, or ultraviolet B-treated platelets resulted in significantly less HLA alloimmunization and platelet refractoriness compared with unmodified pooled platelets. This trial provides the best clinical evidence to date that leukoreduction prevents HLA alloimmunization in patients undergoing cytoreductive chemotherapy. A major issue for consideration is that HLA alloimmunization may be only a poor surrogate marker for bleeding complications due to platelet refractoriness. Because HLA alloimmunization is only one cause of refractoriness to platelet transfusions, its elimination may not necessarily prevent this problem. Furthermore, serious bleeding complications are infrequent even when unmodified components are used, and it may be difficult to justify the widespread use of a costly procedure, such as leukoreduction, for a potentially small gain. Analysis of this issue continues. c- Prevention of transmission of Cytomegalovirus and other leukotropic viruses The human leukotropic viruses - cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV), and human T-cell lymphotropic virus (HTLV-1/11) - reside within leukocytes of infected individuals. In terms of pathogenicity, CMV is the most important and is capable of causing significant complications in immunocompromised patients. HTLV-I/11 is potentially a serious problem, but screening measures have minimized the risk of transmission by transfusion. EBV has high prevalence in the community, but transfusion-transmitted disease has not been a significant problem. Early studies demonstrated that leukoreduction could prevent transfusion-transmitted CMV 35. In one large study, Bowden et al. 36 randomized 502 CMV seronegative patients undergoing bone marrow transplantation to receive either CMV-seronegative blood components or leukoreduced components from CMV unscreened donors. efficace nel prevenire FNHTR in politrasfusi. Inversamente, la prevenzione di FNHTR nella trasfusione di CP si è dimostrata molto più ardua 30, facendo supporre che l'accumulo delle citochine durante la conservazione sia il fattore scatenante. La leucodeplezione pre-storage dei CP attenua l'aumento della concentrazione di citochine che interviene durante la conservazione 31. Ulteriori ricerche hanno dimostrato una più bassa incidenza di reazioni in concentrati con ridotta quantità di plasma rispetto a unità leucodeplete dopo la conservazione 32. b- Prevenzione dell'alloimmunizzazione anti-hla La formazione di alloanticorpi anti-hla è stata riconosciuta come una delle cause di refrattarietà alla trasfusione di piastrine. La prevenzione di questa immunizzazione può essere ottenuta con l'impiego di emocomponenti leucoridotti. È stato dimostrato che l'uso di emocomponenti leucodepleti ha fatto diminuire l'incidenza globale di immunizzazione HLA nei pazienti politrasfusi 33. L'analisi di particolari sottogruppi di riceventi ha documentato in alcuni studi che, per quei pazienti precedentemente esposti ad antigeni HLA, quali pluripare, i componenti leucodepleti non sono in grado di prevenire efficacemente l'immunizzazione o di ritardare la comparsa della refrattarietà 34. Il trial condotto dall'nih (National Institute of Health) per ridurre l'alloimmunizzazione alle piastrine ha provato che un supporto trasfusionale con pool di piastrine leucodeplete, con CP da aferesi leucodepleti o con piastrine trattate con luce ultravioletta B comporta alloimmunizzazioni HLA e refrattarietà significativamente meno frequenti se comparato a un supporto con piastrine non trattate. Questo studio ha fornito la migliore evidenza clinica ad oggi che la leucodeplezione previene l'immunizzazione HLA in pazienti sottoposti a chemioterapia citoriduttiva. È maggiormente da considerare che l'immunizzazione HLA rappresenta soltanto un piccolo marcatore sostitutivo per le complicanze emorragiche dovute alla refrattarietà piastrinica. Dato che la immunizzazione HLA è soltanto una delle cause della refrattarietà, la sua eliminazione non comporta necessariamente la risoluzione del problema. Per di più, anche quando vengono usati emocomponenti non trattati, le gravi complicanze emorragiche sono rare e può essere difficile giustificare l'uso estensivo di una procedura costosa come la leucodeplezione per poter raggiungere un modesto traguardo. Continuano tuttora gli esami analitici di questo problema. c- Prevenzione della trasmissione di citomegalovirus e di altri virus leucotropi I virus leucotropi umani, il Citomegalovirus (CMV), il virus di Epstein-Barr (EBV) e il virus linfotropico delle cellule 358

13 Leucodeplezione Table VII: filtered versus seronegative study arms 36 Tabella VII: studio relativo all uso di componenti filtrati o sieronegativi 36 Filtered Seronegative p-value Filtrati Sieronegativi valore di p Probability CMV-disease (1-100 days) 2.4% 0% 0.03 Probabilità di malattia da CMV (entro 100 gg dal TMO) Probability CMV disease (> 21 days) 1.2% 0% 0,25 Probabilità di malattia da CMV (dopo 21 giorni dal TMO) Deaths attributed to CMV Morti attribuite alla malattia da CMV Infection occurring more than 21 days after the day of transplant was considered related to transfusion. Infections occurring prior to day 21 were considered to be due to infection prior to enrollment in the study. There was no significant difference between the two study arms in either probability of infection or survival. However, the occurrence of a small number of infections in the filtered arm when compared to the complete absence of cases in the seronegative arm is of concern (Table VII). Problems identified with this study include the fact that filtration was done at the bedside with no assessment of the adequacy of leukoreduction and that the platelet filters used in the early phase (PL 50 ) had a lower performance rating than filters currently in use. Therefore, it may be that a proportion of the patients received inadequately filtered units. A further smaller study by van Prooijen et al. 37 using blood center leukoreduced units showed no evidence of CMV transmission with filtered units, supporting the current recommendation that adequately leukoreduced components can be regarded as equivalent to CMV-seronegative, and can be used to prevent CMV transmission to a seronegative recipient. It has been suggested that exposure of seropositive recipients to allogeneic donor leukocytes may promote activation of latent recipient virus. In vitro studies have suggested that this effect is not seen with exposure to other allogeneic cellular elements 38. There has also been analysis of the possibility that there may be transmission through transfusion of a second strain of CMV to a seropositive recipient. This phenomenon has been seen with solid organ transplantation 39 but not yet with blood transfusion. T umane (HTLV-I/II)risiedono nei leucociti e infettano le persone. In termini di patogenicità, il CMV è maggiormente importante ed è in grado di determinare severe complicazioni in soggetti immunocompromessi. L'HTLV-I/II pone seri problemi, ma le misure di screening hanno minimizzato il rischio di una sua trasmissione trasfusionale. Il virus di Epstein-Barr ha un'alta prevalenza nella popolazione, ma la malattia trasmessa per via trasfusionale non è particolarmente significativa. Già i primi studi avevano dimostrato come la leucodeplezione potesse prevenire la trasmissione trasfusionale del CMV 35. In un'ampia ricerca, Bowden et al. 36 avevano esaminato 502 pazienti CMVsieronegativi, sottoposti a trapianto di midollo osseo (TMO), che avevano ricevuto, a caso, o emocomponenti CMV-negativi o componenti leucodepleti provenienti da donatori non selezionati per CMV. Una infezione che si fosse instaurata più di 21 giorni dopo TMO veniva considerata come dovuta alle trasfusioni, mentre un infezione instauratasi prima dei 21 giorni veniva ritenuta come preesistente al momento dell'inserimento nello studio. Non si notò alcuna significativa differenza nei due bracci dello studio sia per la probabilità di infezione che per la sopravvivenza. Tuttavia, l'incidenza di un piccolo numero di infezioni nel braccio relativo all'uso di componenti filtrati rispetto alla completa assenza di infezioni in quello relativo all'uso di componenti sieronegativi sembra porre qualche problema (Tabella VII). I problemi identificati da questo studio riguardano anche il fatto che la filtrazione avveniva bedside senza alcun controllo dell'adeguatezza della deplezione e che i filtri utilizzati in un primo tempo per le piastrine (PL 50 ) avevano prestazioni più scadenti di quelli attualmente in uso. Di conseguenza, forse una parte di pazienti poteva aver ricevuto componenti non adeguatamente filtrati. Un successivo studio, più ridotto numericamente, di van Prooijen et al. 37 utilizzando emocomponenti filtrati in laboratorio non riportava casi di trasmissione di CMV con unità filtrate, a sostegno delle attuali raccomandazioni che emocomponenti correttamente leucodepleti possono essere ritenuti equivalenti a quelli CMV-sieronegativi e possono essere impiegati per prevenire la trasmissione di CMV a riceventi sieronegativi. È stata avanzata l'ipotesi che l'esposizione di un ricevente sieropositivo a leucociti del donatore possa provocare l'attivazione di virus latenti. Studi in vitro suggeriscono che tale effetto non si verifichi con l'esposizione ad altri elementi cellulari 38. È stata anche presa in considerazione la possibilità che vi possa essere una trasmissione, tramite la trasfusione, di un secondo ceppo di CMV a riceventi sieropositivi. Questo fatto è stato visto nel trapianto di organi solidi 39 ma non ancora con la trasfusione di sangue. 359

14 AB McDonald, WH Dzik Conclusion Leukoreduction has become an important consideration for choosing appropriate blood components for transfusion. The major disadvantages of leukoreduction are additional cost and loss of cellular components intended for transfusion. The potential advantages of adequately leukoreduced components have been outlined. Emphasis on quality control is essential to ensure that leukoreduced components confer maximal benefit. Conclusioni La leucodeplezione viene attualmente presa in considerazione nella scelta di emocomponenti appropriati da trasfondere. I suoi maggiori svantaggi riguardano i costi aggiuntivi e la perdita di elementi cellulari destinati a essere trasfusi. In questa rassegna, sono stati sottolineati i vantaggi potenziali di emocomponenti correttamente e adeguatamente leucodepleti. È essenziale enfatizzare l'esecuzione di controlli di qualità così da assicurare che emocomponenti leucodepleti apportino il massimo beneficio possibile. 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