Centro Regionale Trapianti - Regione Lazio VALUTAZIONE VIROLOGICA

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1 VALUTAZIONE VIROLOGICA

2 DEFINIZIONE DEI LIVELLI DI RISCHIO Rischio standard Rischio calcolato Rischio aumentato ma accettabile Rischio non valutabile Rischio inaccettabile

3 RISCHIO INACCETTABILE Donatore Positivo per antihiv il trapianto d organo da donatore antihiv Pos. è vietato in ogni caso

4 RISCHIO CALCOLATO il processo di valutazione evidenzia la presenza di uno specifico agente patogeno o di uno stato sierologico del donatore compatibile con il trapianto in riceventi che presentino lo stesso agente o stato sierologico a prescindere dallo status del ricevente.

5 RISCHIO AUMENTATO MA ACCETTABILE il processo di valutazione evidenzia la presenza di agenti patogeni trasmissibili, ma l utilizzo degli organi è giustificato dalla gravità delle condizioni cliniche del/i ricevente/i

6 ESAMI DI LABORATORIO anti HIV anti HCV HBsAg ed anti-hbc (Totale e IgM) Ricerca Agδ(in soggetti HBs Ag pos) VDRL o TPHA (abitudini a rischio) anticmv e anti-toxoplasma antiebv (ricevente pediatrico) VZV (ricevente pediatrico) Ab antitoxoplasma Altri esami in particolari condizioni (HTLV1, Chikungunya, WNV, A_H1N1 etc.)

7 ESAMI DI LABORATORIO Impossibilità di raccogliere l anamnesi o abitudini di vita a rischio per poter considerare il donatore a Rischio Standard è necessario eseguire: esami infettivologici biomolecolari per HIV, HCV, HBV (tutti con esito negativo)

8 DI ROUTINE ESAMI BIOMOLECOLARI PER HIV, HBV, HCV

9 ESAMI DI LABORATORIO non urgenti

10 ESAMI SPECIFI IN CORSO DI FOCOLAI EPIDEMICI West Nile Virus Chikungunya Influenza A H1N1

11 HTLV1/2 Endemic Areas CHAGAS E. A.

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13 QUALITA E SICUREZZA

14 CRT Lazio HIV1/2 Ab HBsAg anti HBc anti-hcv TPHA/VDRL Marcatori epatite delta CMV-IgG e IgM EBV (anticorpi VCA-IgGe EBNA) HSV-1 e 2 (anticorpi IgG) VZV (anticorpi IgG) Toxoplasma (anticorpi) Chikungunya Malaria West Nile Virus VHTL 1-2 Influenza N1H1 Malattia di Chagas

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16 PROTOCOLLI NAZIONALI DONATORE ORGANI RICEVENTE HBcAb-IgG Pos Anti HCV Pos HBsAg Pos Meningite Batterica Batteriemia Infezioni Sistemiche FEGATO CUORE POLMONE RENE FEGATO CUORE POLMONE RENE FEGATO CUORE POLMONE RENE TUTTI HBsAg Pos HBsAg Neg + HBsAb > 10 Ul/ml HBsAg Neg + HbsAb Neg HCV RNA Pos + Status 2b + età > 50 aa. antihcv Neg + Urgenza clinica antihcv Pos anti HCV Neg + Urgenza Clinica HCV RNA Pos HCV RNA Pos + Status 2b + età > 50 aa. antihcv Neg + Urgenza clinica HBsAg Pos + HDV Neg HBsAg Neg + HBsAb > 10 UI/ml + Urgenza Clinica (solo organi salvavita) HBsAg Neg + HBsAb Neg + Urgenza Clinica (solo organi salvavita) Tutti

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18 Rischio Infettivo Donatore Positivo per antihcv Trapianto di Cuore, Polmone, Rene il trapianto d organo da donatore antihcvpos. a ricevente antihcvneg. èconsentito solo nei casi di urgenza clinica (Rischio aumentato) èconsentito il trapianto d organo da donatore antihcvpos. a ricevente antihcv Pos. (Rischio calcolato)

19 TRAPIANTO DI RENE. Donatori con sierologia positiva per il virus HCV Reni di donatori Ab anti HCV positivi Si, riceventi PCR(+) No, riceventi PCR(-)

20 % Supervivienza del trapianto TRAPIANTO DI FEGATO Recidiva dell Epatite C Donatore HCV-/ Riceventi HCV+(n.169) 64 % 23 % Anni Vargas HE et al, Gastroenterology 2000, 117:149

21 % Supervivienza del trapianto TRAPIANTO DI FEGATO Sopravvivenza del paziente 89 % 88 % Donatore HCV-/ Riceventi HCV+ (n.169) Donatore HCV+ / Riceventi HCV+ (n. 23) 73 % 72 % Anni Vargas HE et al, Gastroenterology 1999, 117:149

22 lobulo epatico Centro Regionale Trapianti - Regione Lazio VALUTAZIONE ISTOLOGICA SECONDO ISHAK GRADING (infiammazione) Epatite periportale o perisettale Score 0-4 Necrosi confluente 0-6 Necrosi focalelitica, apoptosi ed infiammazione fovale 0-4 Infiammazione portale 0-3 L ORGANO E IDONEO SE: Staging = 0 Grading 4 STAGING (fibrosi) 0-6

23 Rischio di trasmissione di infezione da HBV

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25 δantigen Hepatitis D (Delta) Virus HBsAg RNA

26 Rischio Infettivo Donatore Positivo per HBsAg Trapianto di Cuore, Polmone, Rene HBsAg il trapianto da donatore HBsAg Pos. a ricevente HBsAg Neg. sprovvisto di antihbs èvietato ad eccezione delle condizioni salvavita in urgenza clinica (Rischio aumentato) èconsentito il trapianto da donatore HBsAg Pos. a ricevente HBsAg Pos (Rischio calcolato)

27 Rischio Infettivo Donatore Positivo per HBcAb Trapianto di Fegato HBcAb èconsentito il trapianto da donatore antihbc Pos. a favore di ricevente HBsAg Pos. oppure HBsAg Neg, mahbs Ab pos (Rischio calcolato) èconsentito il trapianto da donatore antihbc Pos. a favore di ricevente HBsAg Neg in particolari condizioni di urgenza clinica (Rischio aumentato)

28 TRAPIANTO DI FEGATO Donatore HBcAb + Sieroconversioni HBsAg+ Kadian M, et al J Transpl Coord 1994, 4: 57 Wachs ME, et al Transplantation 1995, 59:230 Uemoto S, et al Transplantation 1998, 65:494 4 / 12 (33 %) 3 / 6 (50 %) 15 / 16 (93%)

29 Rischio Infettivo Donatore Positivo per HBcAb Trapianto di Cuore, Polmone, Rene HBcAb èconsentito il trapianto da donatore antihbc Pos. a ricevente HBsAg Pos. o antihbc Pos oppure HBsAg Neg con antihbs (titolo > 10 UI/ml) (Rischio standard) èconsentito il trapianto da donatore antihbc Pos. a ricevente HBsAg Neg. e antihbs Neg vaccinati(rischio calcolato)

30 TRAPIANTO DI RENE Donatore HBcAb + / Ricevente HBsAb+ e/o HbcAb+ Sieroconversioni HBsAg+ Kadian M, et al J Transpl Coord 1994, 4: 57 Satterthwaite R, et al Transplantation 2001, 33: 1335 Madayag RM, et al Transplantation 1997, 64: / 19 ( 0 ) 0 / 11 ( 0 ) 0 / 45 ( 0 )

31 VALUTAZIONE IMMUNOLOGICA

32 Presentation of antigens to CD8 + T cells HLA Presentation of antigens to CD4 + T cells

33 700 NUMERO DI ALLELI A B1 A1 B1 A1 B1 A B C DR DQ DP Alleli di Classe II Alleli di Classe I

34 NUMERO TEORICO COMBINAZIONI ATTESE A B C DRB1 Alleli 396 X 699 X 198 X 413 =

35 Probabilità di compatibilità in famiglia

36 Probabilità di compatibilità nella popolazione

37 Matching per HLA Probabilità di sopravvivenza Matching max matching ottimale Matching min Probabilità di trapianto

38 LA TIPIZZAZIONE HLA Tecniche

39 Tipizzazione HLA Sierologica (classe I e II) Test di linfocitotossicità complementomediata: Incubazione dei linfociti del paziente con sieri contenenti anticorpi specifici per gli antigeni HLA (formazione del legame Ag/Ab); Negativo aggiunta del complemento (lisi cellulare); Positivo rivelazione della reazione mediante colorante vitale (penetra solo nelle cellule morte); lettura al microscopio.

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41 Tipizzazione HLA Genomica (classe I e II) PCR-SSP Typing: metodica che prevede amplificazione di DNA mediante l uso di coppie di primer sequenza specifici. estrazione del DNA amplificazione corsa elettroforetica in gel di agarosio lettura fotografica ai raggi UV

42 RISCHIO IMMUNOLOGICO Valutazione della Compatibilità HLA CompatibilitàHLA (Matching):valutazione della uguaglianza donatore/ricevente per gli antigeni HLA. Priorità di matching: HLA-DR, HLA-B, HLA-A IncompatibilitàHLA (Missmatching):valutazione del numero di diversitàper gli antigeni HLA donatore/ricevente (0-6 MMs).

43 Valutazione della Compatibilità HLA Donatore: Ricevente: A1,, A2 B5, B35 A1,, A3 B5, B35 DR1,, DR11 DR1,, DR7 Compatibilità: 4/6 antigeni Incompatibilità (MMs): 2 MMs

44 Valutazione della Compatibilità HLA Donatore: Ricevente: A1,, / B5, B35 A1,, A3 B5, B35 DR1,, / DR1,, DR7 Compatibilità: 4/6 antigeni Incompatibilità (MMs): 0 MMs

45 HLA e Trapianto di Rene

46 CROSS MATCH Crossmatch: prova crociata Donatore/Ricevente. Sieri dei potenziali riceventi il trapianto d organo testati con i linfociti del donatore (sangue periferico, linfonodi o milza) al fine di evidenziare la presenza, nel siero del ricevente, di anticorpi anti HLA classe I e II specifici per gli antigeni HLA non self del donatore.

47 RISCHIO IMMUNOLOGICO Presensibilizzazione = presenza di anticorpi anti HLA circolanti dovuti a precedenti immunizzazioni quali: trasfusioni gravidanze/aborti pregressi trapianti Rigetto iperacuto o accelerato: dovuto alla presenza nel ricevente di anticorpi anti-hla preformati e specifici per gli antigeni HLA non self presenti sul rene trapiantato.

48 Separazione delle cellule con biglie magnetiche Linfocita (T o B) Siero storico Siero attuale - Buffy coat MoAb anti- CD2 o -DR - Cellule mononucleate Test sui T Linfociti Test sui B Linfociti

49 CDC-XM Test di microlinfocitotossicità complemento mediata: - 1 µl di linfociti T o B (2x10 3 ) del donatore + 1 µl di siero del paziente; - incubazione (30/60 min. a t.a.); - complemento di coniglio (10 µl/test); - incubazione (60/120 min. a t.a.); - colorante vitale (5 µl/test di etidio bromuro /arancio di acridina); - lettura al microscopio rovesciato (score 1/2/4/6/8) Score 1/2 =Negativo Score 4/6/8 = Positivo

50 Test citofluorimetrico triparametrico: -linfociti del donatore incubati con il/i sieri del ricevente; -marcatura con monoclonali anti-cd3 PerCP e anti-cd19 PE per evidenziare il tipo di linfociti (T e/o B) contro cui sono diretti gli anticorpi; -marcatura con anti-igg/igm FITC per evidenziare gli anticorpi legati ai linfociti; - analisi al citofluorimetro. FL2 FL3 Negative control R1 = T cell gate (CD3 PerCP+ cells) R2 = B cell gate (CD19 Pe+ cells) Test serum Anti-human IgG FITC (FL1) Positive FCXM: defined as median channel shift value greater than 2SD above the predetermined median channel shift from the negative control sample

51 Risk assignment based on crossmatch interpretation

52 STUDIO ANTICORPI ANTI-HLA

53 FlowPRA Screening Beads (%PRA = Panel Reactive Antibodies) Anticorpi anti-hla anti-igg (o IgM) FITC FL1 A Antigeni HLA purificati DR Classe I Beads C (30 differenti linee cellulari) Classe II Beads DP B DQ biglie di Classe I : non fluorescenti biblie di Classe II : elevata fluorescenza rossa (FL2)

54 FlowPRA Screening Beads Analisi Classe I beads Classe II beads Control beads

55 LABScreen Single Antigen Beads (Caratterizzazione delle specificità degli anticorpi anti-hla) LABScreen Single antigen Beads: microsfere colorate con una miscela di due differenti marcatori fluorescenti utilizzati a diversa concentrazione. Analisi mediante citofluorimetro dedicato Luminex dotato di 2 laser e 3 PMTs in grado di discriminare/analizzare fino a 100 microsfere diversamente colorate.

56 LABScreen Single Antigen Beads (Principi della tecnica) anti-igg PE Anticorpo anti-hla A1 NC A1 A1 PC A1 A1 Biglie di controllo: NC (controllo negativo= biglia nuda) PC (controllo positvo = IgG umane)

57 Caratterizzazione/Quantificazione degli anticorpi anti-hla Anticorpianti-HLA classe I Paziente: A.E. Sensibilizzazioni: 1 Tx (MMs: B8, Cw4, Cw7) Anticorpianti-HLA classe II Paziente: B.L. Sensibilizzazioni: 1 Tx (MMS: DR11, DQ7, DP?)

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59 Rischio immunologico inaccettabile Anticorpi anti HLA specifici contro il donatore Antigeni proibiti da un precedente trapianto Virtual Crossmatch

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63 Tipizzazione HLA Crossmatch Studio anticorpale pre-trapianto Studio anticorpale post-trapianto CRT Lazio CRTL azio Lab. Immunologia dei Trapianti