TUTTI GLI ENZIMI POSSONO ESSERE ANALIZZATI IN MODO DA POTER QUANTIFICARE SIA LA VELOCITA DI REAZIONE CHE LA LORO EFFICIENZA ENZIMATICA

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1 TUTTI GLI ENZIMI POSSONO ESSERE ANALIZZATI IN MODO DA POTER QUANTIFICARE SIA LA VELOCITA DI REAZIONE CHE LA LORO EFFICIENZA ENZIMATICA Lo studio della cinetica enzimatica inizia nel 1909 con ADRIAN BROWN e i sui studi sulla velocità di IDROLISI del SACCAROSIO catalizzata dall enzima β-fruttofuranosidasi SACCAROSIO + H 2 O GLUCOSIO + FRUTTOSIO Quando la concentrazione del saccarosio è molto più elevata dell enzima, la velocità di reazione diventa indipendente dalla concentrazione del saccarosio 1

2 [E] V 0 = = NUMERO NUMERO DI MOLI DI DI MOLI DI PRODOTTO SUBSTRATO CHE SI CONSUMANO CHE SI FORMANO IN UN SECONDO IN UN AD SECONDO UNA AD UNA CONCENTRAZIONE FISSA FISSA DI DI ENZIMA Leonor Michaelis e Maud Menten nel 1913 proposero un semplice modello matematico per spiegare queste caratteristiche cinetiche Velocità a differenti concentrazioni di S Michaelis e Menten proposero che la REAZIONE ENZIMATICA COMPLESSIVA fosse costituita da due REAZIONI ELEMENTARI La reazione raggiunge velocemente l equilibrio Il punto focale dell ipotesi di Michaelis e Menten sta nella formazione di un COMPLESSO ES SPECIFICO come intermedio essenziale per la catalisi COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO K 1 K E + S ES 2 P + E K 3 2

3 Questi scienziati attraverso una serie di assunzioni logiche vogliono determinare un equazione della velocità che metta in relazione la velocità di reazione alla concentrazione del substrato in una reazione catalizzata da un enzima. Vogliono cioè ricavare l equazione della velocità che sia valida per una qualsiasi reazione catalizzata da un qualsiasi enzima LA PRIMA ASSUNZIONE ( assunzione dell' "equilibrio rapido") dice che il complesso ES è in equilibrio con l E libero e il S e che questa situazione di equilibrio non è disturbata dalla formazione del P. In altre parole la velocità di formazione del prodotto a partire da ES è molto piccola rispetto alla velocità con cui ES si scinde per dare E+S ( k 3 << k 2 ). La velocità di catalisi è data dalla formazione del prodotto (reazione più lenta) V = d[p] dt = K 3 [ES] 3

4 LA SECONDA ASSUNZIONE (assunzione della velocità iniziale V 0 ) la velocità della reazione viene valutata per un periodo di tempo durante il quale la reazione inversa è fisicamente trascurabile in quanto poco è il prodotto formatosi: la velocità iniziale che può così essere determinata sarà la massima velocità ottenibile. In condizioni di velocità iniziale la reazione è di fatto irreversibile (k 4 =0) e deve essere scritta nel seguente modo: Stato Prestazionario e Stato Stazionario 4

5 LA TERZA ASSUNZIONE (assunzione dello "stato stazionario ) Dice che il complesso ES si mantiene in uno stato stazionario durante tutto il periodo di tempo in cui si possono misurare le velocità iniziali. [ES] rimane costante per cui la velocità con cui il complesso ES si forma a partire da E+S è uguale alla somma delle velocità con cui si scinde per dare E+P ed E+S. Stato Prestazionario e Stato Stazionario 5

6 ASSUNZIONE DELLO STATO STAZIONARIO [S] >> [E] Velocità di sintesi di ES rimane COSTANTE equazione di conservazione di massa per l'enzima: COME SI ARRIVA ALL EQUAZIONE DELLA VELOCITA V 0 =K 3 [ES] La concentrazione di ES deve essere scritta in termini di concentrazioni note v di SINTESI = v di CONSUMO 6

7 Velocità di formazione di ES Velocità di formazione di ES Velocità di scissione di ES = Velocità di scissione di ES [ES]= K 1 [E] [S] [ES]= (K 2 +K 3 ) [ES] Svolgiamo l equazione portando le costanti tutte dalla stessa parte [E] [S] [ES] = (K 3 + K 2 ) K 1 (K 3 + K 2 ) K 1 = K M Poiché [E] T = [E] + [ES] K 1 [E] [S] = K 3 [ES] + K 2 [ES] COSTANTE DI MICHAELIS K M = Per poter essere utilizzate le espressioni CINETICHE devono essere formulate in quantità note [E] = [E] T - [ES] [E] [S] [ES] d[es] dt = 0 K 1 [E] [S] = K 3 [ES] + K 2 [ES] sostituendo K M = ([E] T [ES])[S] [ES] 7

8 K M = [ES] K M = [E] T [S] [ES][S] [ES] K M + [ES][S] = [E] T [S] [ES] (K M + [S]) = [E] T [S] Poiché la velocità iniziale è data da V 0 = ([E] T [ES])[S] [ES] d[p] dt = K 3 [ES] Sostituendo a [ES] l equazione diventa: Risolvendo rispetto a ES [ES] = [E] T[S] K M + [S] [ES] = V 0 / K 3 V 0 = K 3 [E] T [S] K M + [S] V 0 = v 0 = K 3 [E] T [S] K M + [S] V MAX [S] QUANDO [S]>> [E] [ES] [E T ] TUTTO L ENZIMA E SATURATO V 0 = K 3 [ES] V 0 = K 3 [E T ] K M + [S] V MAX = K 3 [ET] Equazione di una iperbole 8

9 Equazione di Michaelis-Menten v 0 = V MAX [S] K M + [S] V MAX diventa l asintoto a cui tende l iperbole e K M? v 0 = quando V 0 = V MAX /2 V MAX 2 V MAX [S] K M + [S] = V MAX (K M + [S]) = 2 V MAX [S] K M + [S] = 2 [S] V MAX [S] K M + [S] Se V MAX è il valore dell asintoto a cui tende l iperbole, a che valore corrisponde la K M? K M = [S] La K M equivale alla concentrazione del substrato quando la velocità è uguale a V MAX /2 9

10 Per concentrazioni di substrato basse [S]<<Km l'equazione di Michaelis-Menten diviene l'equazione della retta: v 0 = V MAX [S] K M + [S] Per concentrazioni di substrato [S]>>Km l'equazione di Míchaelis-Menten si semplifica nella relazione: ANALISI DEI DATI CINETICI L' equazione di Michaelis-Menten può però essere manipolata per ottenere l' equazione di una retta in cui Vmax e Km siano delle intercette e non più degli asintoti. Grafico di Lineweaver e Burk o Grafico dei doppi reciproci Trasforma l equazione di un iperbole nell equazione di una retta v 0 = V MAX [S] 1 K = M + [S] K M + [S] V 0 V MAX [S] 1 V 0 = K M V MAX [S] + [S] V MAX [S] 1 V 0 = K M V MAX 1 S + 1 V MAX Equazione lineare rispetto a 1/v 0 e 1/S Y = m X + c 10

11 Equazione di una retta SVANTAGGI: 1) la maggior parte delle misure sperimentali di [S] sono concentrate nella parte sinistra del grafico. 2) piccoli valori di [S] piccoli errori in v 0 Grandi errori in K M e V MAX Grandi errori 1/v 0 La K M ha un valore unico per ciascuna coppia ENZIMA- SUBSTRATO CORRISPONDE ALLA CONCENTRAZIONE DI SUBSTRATO IN CUI LA VELOCITA DI REAZIONE E META DELLA VELOCITA MASSIMA 11

12 quando K M = (K 3 + K 2 ) K 1 K M = K 2 K 1 K 3 << K 1 = K S Capacità di incontrare K M = K S Quando K 1 > K 2 K M bassa Quando K 1 <K 2 K M alta Costante di EQUILIBRIO il substrato alta affinità bassa affinità Rappresenta la capacità dell enzima di legare il substrato A più alta (Km 2 ) o più bassa (Km 1 ) concentrazione di substrato ottengo la stessa V 0 = V MAX/2 La K M ha un valore unico per ciascuna coppia enzimasubstrato 12

13 Significato pratico della Km. Il valore della Km è importante per varie ragioni: q La Km rappresenta approssimativamente il valore della concentrazione intracellulare del substrato. q La Km è una costante specifica per ogni enzima, il suo valore numerico ci fornisce un mezzo per comparare enzimi provenienti da organismi diversi, da differenti tessuti dello stesso organismo o dallo stesso tessuto a differenti stadi di sviluppo: se due enzimi hanno valori differenti di Km è probabile che siano due ISOENZIMI. q c) Spesso ligandi differenti dal substrato provocano modificazioni del valore della Km. Se la Km determinata in vitro sembra essere troppo alta, allora è pensabile che in vivo sia presente un inibitore che ne abbassi il valore ad una livello 'fisiologico'. q d) Se si conosce il valore della Km di un enzima, allora è possibile misurarne la velocità di reazione in condizioni di [S] di saturanti. 13

14 K M è anche chiamata: In realtà il valore della V MAX non è una costante ma dipende dalla quantità di enzima che è stata messa per calcolare l equazione di Michaelis-Menten. MA poichè: V MAX = K 3 [E] T = K cat moli/sec E moli T Misura la velocità di un processo catalitico ( a carico di una molecola enzimatica) ed ha le dimensioni: sec -1 K 3 = V max NUMERO DI TURNOVER Numero di molecole di substrato trasformate da una molecola enzimatica in un secondo Nella cellula la maggior parte degli enzimi non si trova mai a concentrazione di substrato saturante ma a concentrazioni che determinano una velocità che varia tra il 10-50% di quella massima Quando V 0 = [S] << K M Vmax [S] K M + [S] V 0 = Vmax [S] Kcat = V max Vmax = Kcat [E T ] E T [ES]molto piccolo [E] [E] T V 0 = Kcat [E][S] La velocità diventa la probabilità dell enzima di trovare il substrato e il valore Kcat/K M K M K M Misura l efficienza catalitica di un enzima 14

15 A bassa concentrazione di substrato V 0 = Kcat K M [E][S] La maggior parte delle reazioni enzimatiche ha più substrati per ognuno possiamo calcolare la l efficienza catalitica La TEORIA DELLA DIFFUSIONE dice che esiste un valore teorico della capacità di incontro di due molecole e questo valore è di (moli/l) -1 s -1 La trioso isomerasi che catalizza la reazione di isomerizzazione della G3P a DHAP possiede un valore di Kcat/K M = 2,4 x 10 8 (mol/l) -1 sec -1. Efficienza che si avvicina a quella massima Da questi dati è abbastanza evidente che la chimotripsina ha una predilezione ad operare l idrolisi in prossimità dei residui maggiormente idrofobici 15

16 La velocità di reazione è limitata solo dalla velocità con cui riescono ad incontrare il substrato in soluzione. I limiti imposti dalla velocità di diffusione possono essere superati mediante s t r u t t u r e polienzimatiche Possono essere divise in due classi : reazioni sequenziali e reazioni a doppio spostamento Complesso multienzimatico

17 MECCANISMO ORDINATO A B P Q Prima tutti i substrati si combinano con l enzima poi vengono rilasciati come prodotti MECCANISMO CASUALE E A B B A EAB EPQ P Q Q P E E EA EAB EPQ EQ E Creatina chinasi creatina ATP Creatina P ADP piruvato NADH+H + lattato NAD + E E creatina ATP E ADPcreatina P E E E piruvato NADH E lattato NAD + E ATP creatina ADP Creatina P 17

18 Reazioni a doppio spostamento Reazioni a ping-pong Uno o più prodotti vengono rilasciati dal complesso prima che tutti i substrati si siano legati + + A P B Q E EA FP F FB EQ E glutammato Α-chetoglutarato ossalacetato aspartato In queste reazioni i reagenti non si incontrano mai sulla superficie dell enzima E Eglut-Fchetoglut F Fossal-Easpart E + + I meccanismi a due substrati, molto più complicate di quelli a singolo, possono essere studiati con le misure di cinetiche allo stato stazionario, contengono però 4 costanti cinetiche e possono essere utilizzate per distinguere i vari meccanismi. 18

19 Gli studi di CINETICA STAZIONARIA non danno informazioni sulla velocità di formazione o quella di scissione né sulla natura del complesso ES né se esistano uno o più complessi. OPPURE E + S D ES D EX D EP D E + P E + S D ES EX EY EP D E + P Tuttavia se i DATI CINETICI non sono compatibili con un certo meccanismo molecolare allora quel meccanismo deve essere scartato Unità di attività enzimatica e dosaggio degli Enzimi Catal (kat): è la quantità di enzima che converte 1 mole di reagente nel prodotto in 1 secondo nelle condizioni di reazione standard (ottimali). L Unità internazionale (U): corrisponde alla quantità di enzima che converte 1 µmole di reagente nel prodotto in 1 minuto. Poiché 1 µmole /min = moli /s quindi U = kat. L attività specifica: è il rapporto tra il numero di U o di Kcat e la quantità totale di proteina espressa in milligrammi. 19

20 Effetto del ph L attività enzimatica è influenzata dal ph. Ciò può derivare dai valori di pk a del substrato e/o dell enzima. Perciò il ph scelto e la selezione di un tampone appropriato sono fondamentali per i saggi di attività enzimatica. L attività specifica è una misura del grado di purificazione dell enzima e il suo valore tende a raggiungere un massimo e rimane poi costante quando tutte le molecole del campione in esame sono molecole di enzima attivo. 20

21 Effetto della temperatura Le reazioni enzimatiche, temperatura come le reazioni chimiche, dipendono dalla temperatura, inoltre se la temperatura diventa troppo alta l enzima può denaturarsi e si avrà perdita di attività. Misure sperimentali e Analisi dei dati cinetici Per misurare la velocità di reazione abbiamo bisogno di un sistema per seguire la formazione del prodotto o il consumo di substrato. Via via che il substrato viene consumato la velocità diminuisce fino a quando alla fine viene raggiunto l equilibrio. Di regola si preferisce predisporre una serie di esperimenti tutti alla stessa concentrazione di enzima, ma a diverse concentrazioni di substrato e misurare la velocità iniziale (V). 21

22 Esempio: misura dell attività enzimatica della fosfatasi alcalina Poiché la variazione di [S] rispetto a t è pressoché lineare nelle fasi iniziali è possibile eseguire analisi accurate di V in funzione di [S]. PNPP PNP La fosfatasi alcalina catalizza l idrolisi di tutti I fosfomonoesteri. Si esegue il saggio enzimatico con un composto non naturale sistetizzato chimicamente: il p-nitrofenilfosfato (PNPP) che viene idrolizzato a p-nitrofenolo (PNP) e P i. La forma ionica del PNP è colorata (410 nm) quindi la reazione può essere misurata spettrofotometricamente. 22

23 Le sostanze che alterano l attività di un enzima legandosi ad esso, sono chiamate INIBITORI Ogni sostanza che riduca la velocità di una reazione enzimatica è da considerarsi un inibitore. La formazione reversibile di un legame non covalente con una molecola diversa dal substrato porta alla formazione di complessi anomali, che non fanno parte del normale processo catalitico. Nella trattazione cinetica della inibizione enzimatica si applicano le assunzioni di Michaelis-Menten anche all'inibitore. Ci sono almeno tre tipi principali di inibizione. REVERSIBILE Legame non covalente tra inibitore e enzima INIBIZIONE IRREVERSIBILE Legame covalente tra inibitore e enzima INATTIVATORI Azione di tossine e veleni specifici, molti dei quali provocano inattivando la morte degli enzimi chiave. 23

24 INIBIZIONE COMPETITIVA Sostanza che compete con il substrato per il SITO ATTIVO INIBITORE COMPETITIVO INIBIZIONE NON COMPETITIVA INIBIZIONE INCOMPETITIVA Sostanza che si lega ad un SITO DIVERSO dal sito attivo INIBITORE NON COMPETITIVO INIBITORE INCOMPETITIVO L inibitore che somiglia al substrato lega l enzima nel SITO ATTIVO, ma diversamente dal substrato non è capace di reagire per dare un prodotto di reazione. K I K 1 K E + S D ES " E + 3 P + K 2 I In presenza dell INIBITORE l enzima E non può legare il substrato come di E I consueto. L Enzima opera come se la sua K M per il substrato fosse aumentata [E] t = [E] + [ES] + [EI] Enzima totale Enzima libero Enzima legato al substrato Enzima legato all inibitore 24

25 STESSA Vmax DIVERSA K M aumenta la K M U N I N I B I T O R E COMPETITIVO RIDUCE LA CONCENTRAZIONE DI ENZIMA LIBERO DISPONIBILE PER LEGARE IL SUBSTRATO Per tutto il tempo che l inibitore occupa il sito attivo, l enzima non è disponibile per la catalisi 25

26 Un inibítore competitivo è una sostanza che si lega all'enzíma libero, impedendo così la formazione del complesso enzima-substrato. Esso può essere un analogo non metabolizzabile del substrato, un substrato alternativo per l'enzima o un prodotto di reazione. L'inibizione della succinico deidrogenasi da parte dell'acido maloníco è un classico esempio di inibizione competitiva da analogo non metabolízzabile: 26

27 Quando l inibitore si lega ad un SECONDO SITO sulla superficie dell enzima diverso dal SITO ATTIVO modificando la Kcat INIBITORE NON COMPETITIVO molecola che non somiglia al substrato dell'altro, ma il complesso ESI è inattivo, non è in grado cioè di liberare il prodotto. L inibitore non competitivo si comporta come se determinasse una rimozione di molecole enzimatiche attive dalla soluzione K M uguale V MAX VARIA L inibitore si lega tanto ad E che a ES e che S si lega sia ad E che a EI. La presenza di uno di essi non ha alcun effetto sulla costante di dissociazione 27

28 L inibitore si lega direttamente al complesso ES ma non all enzima libero K 1 K 2 E + S D ES " E + P L inibitore incompetitivo, che non deve necessariamente somigliare al substrato provoca una distorsione nel sito attivo, rendendo l enzima cataliticamente inattivo K -1 + I K I ESI Nessuna reazione L inibitore influenza la funzione catalitica dell enzima, ma non il suo legame con il substrato. Importante solo per gli enzimi a substrati multipli. Varia sia V MAX che K M 28

29 E' interessante notare che per l inibizione incompetitiva, il grado di inibizione aumenta all'aumentare della concentrazione del substrato. Ciò è comprensibile in quanto l'inibitore incompetitivo si lega al solo complesso ES, e la [ES] cresce al crescere di [ S ]. L'inibitore incompetitívo è inibitore per il suo effetto sulla Vmax, ma è virtualmente un attivatore per quanto riguarda la Km. 29