Corso di Laboratorio di Biofotonica

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1 SAPIENZA Università di Roma Laurea magistrale in Ingegneria delle Nanotecnologie A.A Corso di Laboratorio di Biofotonica Prof. Francesco Michelotti SAPIENZA Università di Roma Facoltà di Ingegneria Civile e Industriale francesco.michelotti@uniroma1.it

2 LABORATORIO 3 Microscopia di Fluorescenza Wide-Field e Confocale Istituto Italiano di Tecnologia Dott. Simone De Panfilis Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo Dott.ssa Angela Cirigliano Mercolerdì 18 novembre 2015 h9.30-h11.00

3 Microscopia di Fluorescenza Schema dell esercitazione Descrizione di un microscopio di fluorescenza in modalità wide-field e confocale Dimostrazione del suo utilizzo Esempi di colorazione di lieviti con: DAPI GFP Green Fluorescent Protein RFP Red Fluorescent Protein

4 Richiami di Microscopia ottica Visione umana diretta Le dimensioni apparenti di un oggetto dipendono dalle dimensioni dell immagine che si forma sulla retina dell occhio, che sono proporzionali all angolo di visione, cioè l angolo sotteso dall oggetto a partire dall occhio. Per vedere i dettagli occorrerebbe portarlo il più vicino possibile all occhio. Esiste una distanza minima d 0 a cui può disporre un oggetto in modo che l occhio riesca a metterlo a fuoco sulla retina. Bambino di 10 anni d 0 = 7 cm Uomo adulto d 0 = 25 cm Uomo anziano d 0 > 25 cm (presbiopia) y 0 d 0 Angolo massimo nella visione diretta =

5 Richiami di Microscopia ottica Visione umana tramite microscopio semplice (lente d ingrandimento) Una lente sottile convergente fornisce un immagine diritta e virtuale di un oggetto posto a distanza inferiore della focale f. Si può disporre l oggetto in una posizione tale da formare l immagine a distanza d d 0 dall occhio, che in questo modo opera senza problemi. y 0 y F 1 f d 0 Angolo massimo nella visione >

6 Richiami di Microscopia ottica Visione umana tramite microscopio semplice (lente d ingrandimento) Le dimensioni angolari massime dell immagine di hanno quando l oggetto è nel piano focale della lente. In questo modo l occhio opera in condizioni di completo rilassamento, ovvero è accomodato per visione all infinito. y F 1 f Angolo massimo nella visione Ingrandimento angolare = = = ( ) Tipicamente M = 5 10

7 Richiami di Microscopia ottica Visione umana tramite microscopio composto Formato da due sistemi di lenti corrette. Il primo (obiettivo) ha focale f 1 molto corta e serve a fornire dell oggetto un immagine reale ingrandita. Il secondo (oculare) ha focale f 2 più lunga e serve ad osservare tale immagine con l occhio nelle migliori condizioni. x 1 x 2 f 1 f 1 f 2

8 Richiami di Microscopia ottica Visione umana tramite microscopio composto L ingrandimento angolare totale del microscopio è il prodotto dell ingrandimento lineare m 1 dell obiettivo e dell ingrandimento angolare M 2 dell oculare. Ingrandimento lineare dell obiettivo = = Ingrandimento angolare dell oculare = ( ) x 1 x 2 f 1 f 1 f 2

9 Richiami di Microscopia ottica Visione umana tramite microscopio composto Ingrandimento angolare totale M = Tipicamente si ha M<1000. Nei microscopi la distanza oculare/obiettivo è fissa, essendo essi montati in un tubo, e la messa a fuoco si esegue spostando il tubo rispetto all oggetto da osservare. x 1 x 2 f 1 f 1 f 2

10 Richiami di Microscopia ottica Visione umana tramite microscopio composto Quasi tutti i fabbricanti disegnano microscopi che utilizzano obiettivi corretti per l infinito, che proiettano un immagine dell oggetto all infinito. Per visualizzare l immagine, il tubo deve contenere una lente supplementare, la tube lens. La tube lens forma un immagine sul piano del diaframma dell oculare (piano d immagine intermedio). I sistemi corretti per l infinito: -presentano una zona in cui i raggi sono paralleli; -eliminano le immagini fantasma causate dal passaggio di fasci convergenti attraverso elementi ottici piani; -permettono di inserire tra obiettivo e tube lens dei sistemi ottici complessi. Ciò è particolarmente utile in microscopia di epifluorescenza wide-field e confocale e nelle loro evoluzioni più avanzate.

11 Microscopia di Fluorescenza Schema del microscopio di fluorescenza in riflessione (Epifluorescenza) Sorgenti luminose Lampade(Hg, Xe) Laser(Ioni Argon)

12 Microscopia di Fluorescenza Sorgenti luminose Righe di emissione del laser a ioni Argon

13 Microscopia di Fluorescenza Schema del microscopio di fluorescenza in riflessione (Epifluorescenza) Sorgenti luminose Lampade(Hg, Xe) Laser(Ioni Argon) Blocco filtri e specchio dicroico

14 Microscopia di Fluorescenza Blocco filtri e specchio dicroico Filtro di eccitazione Seleziona una porzione di spettro della lampada in corrispondenza dello spettro di eccitazione del particolare fluoroforo utilizzato Specchio dicroico Riflette la radiazione di eccitazione e trasmette quella emessa dai fluorofori Filtro di emissione Seleziona la porzione di spettro corrispondente allo spettro di emissione del particolare fluoroforo utilizzato

15 Microscopia di Fluorescenza Blocco filtri e beam splitter Nei microscopi di fluorescenza commerciali i tre filtri necessari per visualizzare un particolare cromoforo sono raccolti in un blocchetto. I microscopi sono dotati di più blocchetti che possono essere cambiati mediante un caricatore. Quasi tutti i filtri sono di tipo interferenziale. Sono multistrati periodici costituiti da due materiali ad alto e basso indice di rifrazione.

16 Microscopia di Fluorescenza Blocco filtri e beam splitter Cromoforo: Green Fluorescent Protein (GFP) Le caratteristiche principali cui deve soddisfare un filtro sono: Valori minimi di autofluorescenza Transizioni molto nette tra zone di trasmissione e riflessione Trasmittanza massima nella regione di trasmissione Rapporto segnale rumore massimo

17 Microscopia di Fluorescenza Blocco filtri e beam splitter Cromoforo: 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)

18 Microscopia di Fluorescenza Filtri interferenziali

19 Microscopia di Fluorescenza Problemi La fluorescenza che proviene dalle zone del campione fuori dal piano focale illuminate viene comunque raccolta dal detector. Ciò causa un deterioramento del contrasto. Lo spessore dei campioni è quindi limitato alla profondità focale dell obiettivo da microscopio utilizzato. La rivelazione di bassissime concentrazioni di cromofori è limitata dal rapporto segnale rumore ovvero dal potere del filtro di emissione di estinguere completamente i fotoni del fascio di eccitazione. DETECTOR LAMPADA Piano focale

20 Microscopia di Fluorescenza GFP fusion

21 Microscopia di Fluorescenza The rpn11-m1 mutant shows a mitochondrial morphology defect Wild-type rpn11-m1 Fluorescence microscopy images; DAPI staining and MitoGfp

22 Risoluzione laterale di un microscopio wide-field D Schermo x n n Diffrazione ( Airy) sin D Apertura numerica N. A. n sin n n D 2x

23 Risoluzione laterale di un microscopio wide-field g g Schermo d MIN n n Rayleigh g ' MIN AIRY D Snell n sin g 2 n'sin g ' 2 sin g 2 g 2 ng n' g '

24 Risoluzione laterale di un microscopio wide-field g g d MIN n n d MIN g x n' n g ' x n' n n' D x g ' MIN AIRY D n 2 DD n' n n' N. A. Abbe d MIN 0.61 n' N. A N. A. essendo n' 1

25 Risoluzione laterale di un microscopio wide-field Risoluzione laterale di un microscopio ottico convenzionale. Obiettivo N.A. d d 20x 0.5 (aria) 652.7nm 817.4nm 40x 0.75 (aria) 435.1nm 544.9nm 60x 1.4 (olio) 233.1nm 291.9nm

26 Microscopia confocale Schema dell esercitazione Dimostrazione del suo utilizzo su: Lieviti marcati con DAPI e GFP Strutture fotoniche o biologiche studiate dal laboratorio ospite

27 Microscopia confocale Caratteristiche DETECTOR Il microscopio confocale utilizza lo stesso schema del microscopio di fluorescenza. In particolare il blocco dei filtri di eccitazione ed emissione e lo specchio dicroico. La sorgente è normalmente un laser a singola linea. La novità fondamentale è l introduzione di un pin-hole nel punto in cui vengono rinviati i raggi provenienti dal piano focale (punto coniugato). Il pin-hole: elimina la radiazione proveniente dai piani fuori fuoco; Permette di aumentare la risoluzione laterale filtrando i massimi secondari della figura di diffrazione: 0.4 d MIN N. A. Spostando il campione verticalmente si possono ottenere delle immagini della fluorescenza che proviene da vari piani all interno del campione con risoluzione assiale d 1.4 n ASS 2 ( N. A.) LASER Piano focale

28 Microscopia confocale Risoluzione laterale ed assiale di un microscopio confocale. Obiettivo N.A. d d d d 20x 0.5 (aria) 428.0nm 536.0nm 4.164mm 5.215mm 40x 0.75 (aria) 285.3nm 357.3nm 1.850mm 2.318mm 60x 1.4 (olio) 152.8nm 191.4nm 0.531mm 0.665mm Obiettivo N.A. d d Microscopio ottico 20x 0.5 (aria) 652.7nm 817.4nm 40x 0.75 (aria) 435.1nm 544.9nm 60x 1.4 (olio) 233.1nm 291.9nm

29 Microscopia confocale Caratteristiche dei «sistemi scanning» Le immagini vengono ottenute spostando il punto in cui viene eccitato il campione, e da cui viene emessa la fluorescenza, mediante un sistema di due specchi montati su attuatori galvanometrici (scanner).

30 Microscopia confocale Caratteristiche dei «sistemi spinning disk» Le immagini vengono ottenute utilizzando un Nipkow disk associato ad un array di microlenti. Tali sistemi possono utilizzare dischi contenenti arrays di circa microlenti. Ogni microlente ha il compito di focalizzare esattamente nel pinhole sottostante la luce che arriva, aumentando l intensità laser (portandola a circa il 70%) che arriva sul campione. Illuminando anche 1000 punti del campione alla volta (multi-point scanner), può raggiungere velocità di scansione superiori a 2000 fps, diventando quindi uno strumento essenziale per studi di live cells in real-time.

31 Microscopia confocale DETECTOR Problemi L utilizzo del pin-hole riduce molto la luminosità delle immagini. Occorre quindi aumentare la sensibilità del detector (tubi fotomoltiplicatori), l intensità della sorgente di eccitazione oppure i tempi di esposizione. LASER In entrambi i due ultimi casi aumenta la dose di radiazione fornita ai fluorofori accelerando il processo di photobleaching. La microscopia confocale non può quindi essere utilizzata su fluorofori che presentano soglie di photobleaching basse, come ad esempio il DAPI. Piano focale

32 Microscopia confocale DETECTOR ESERCITAZIONE Analisi di lieviti colorati con Green Fluorescent Protein (GFP). Paragone tra le immagini ottenute per microscopia wide-field in luce bianca, microscopia wide-field di fluorescenza e microscopia confocale. LASER Analisi di strutture fotoniche. Piano focale