2. I nucleosomi 11/02/16

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1 2. I nucleosomi contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale u Ordinato e dinamico u Formazione della struttura terziaria u Enzimi creano e mantengono il rado di compattazione del DNA u Il meccanismo di compattazione deve però permettere l accesso alle informazioni contenute nel DNA 1

2 Avvolgimento ad elica di un elica DNA è avvolto in forma di doppia elica, nella quale entrambe ruotano intorno ad un asse Ulteriore ripiegamento o torsione dell asse porta al superavvolgimento Se non ci sono ripiegamenti il DNA è detto RILASSATO TOPOLOGIA branca della matematica che studia le proprietà che non si modificano nel corso di deformazioni continue degli oggetti Il DNA deve essere altamente compattato per trovare spazio all interno della cellula La Duplicazione e la Trascrizione richiedono una temporanea separazione delle eliche di DNA senza che la molecola subisca danni struttura DNA sottoposta a tensioni tali che inducono deformazioni che si traducono in Superavvolgimento 2

3 Per comprendere il superavvolgimento del DNA dobbiamo rivolgere l attenzione alle proprietà dei piccoli DNA circolari: DNA CHIUSI Il superavvolgimento si genera in molecole di DNA sottoposte a una qualche forma di tenzione strutturale. Nei DNA circolari il superavvolgimento è quasi sempre generato da una riduzione del grado di avvolgimento della doppia elica (underwinding). DNA circolare costituito da 84 bp Rilassato contiene 8 giri di doppia elica (1 giro ogni 10,5 bp, 84/8) Rimozione di un giro porta a deformazione strutturale (1 giro ogni 12 bp, 84/7) La deformazione è riequilibrata: a. dal superavvolgimento NB La deformazione provocata dal disavvolgimento è generalmente risolta dal superavvolgimento piuttosto che dalla separazione delle catene, perché l avvolgimento dell asse del DNA richiede meno energia della rottura dei legami idrogeno che tengono unite le due catene. b. oppure tramite la parziale separazione delle due catene a una distanza di circa 10 bp. 3

4 L k (Linking number) = numero di volte che la seconda catena ruota intorno alla prima ( proprietà che non varia quando la molecola si piega o cambia forma) Il numero di legame di una molecola di DNA circolare è sempre un numero intero Per convenzione il numero di legame è positivo (+) in un elica destrorsa, è negativo (-) in un elica sinistrorsa. Tre forme di una molecola di DNA: a) Forma rilassata b) Forma rilassata con interruzione, non definita c) Riduzione dell avvolgimento Superavvolgimento indotto dall underwinding è detto negativo nell overwinding è positivo 4

5 Il numero di legame può essere distinto in due componenti strutturali T w = numero di twisting (torsione) o numero di giri di elica di Watson e Crick = n tot bp/ bp x giro d elica. W r = numero di writhing o numero di superavvolgimenti q NON è alterato dalla torsione e dal ripiegamento dell asse q - Può essere modificato solo con rottura ed ricongiungimento della sua struttura Lk è una proprietà topologica del DNA non varia quando la doppia elica subisce qualunque tipo di torsione o deformazione 5

6 I topoisomeri di DNA si possono interconvertire soltanto tagliando uno o entrambi i filamenti del DNA e poi ricongiungendoli. Le topoisomerasi catalizzano questa reazione mediante un processo a tre tappe: 1) Taglio di uno o entrambi i filamenti di DNA 2) Passaggio di un segmento di DNA attraverso questa rottura 3) Chiusura della rottura sul DNA. 6

7 catalizza l aumento del numero di legame (L) di una unità (+1) ad ogni ciclo catalitico: esso favorisce pertanto il rilassamento del DNA superavvolto negativamente. o taglia solo un filamento del duplex o L enzima rimane legato covalentemente all estremità 5 o L estremità 3 è libera di ruotare e di attaccare nucleofilicamente il 5 fosfato attivato. Ogni cellula con,ene circa 2 metri di DNA Diametro nucleo = 5 8 μm Come organizzare il DNA? Il DNA nucleare si distribuisce nei CROMOSOMI 3,2 x 10 9 coppie di nucleo2di distribuite in 24 cromosomi 7

8 L enzima (due catene A di 105 kda e due catene B) catalizza l introduzione di superavvolgimenti negativi. è un trasduttore di energia: converte l energia libera dell ATP nell energia torsionale dei superavvolgimenti. o Avvolgimento di 200 bp attorno all enzima o Il legame dell ATP dà inizio al taglio di entrambi i filamenti. o Il terminale 5 - fosfato di ciascun filamento viene legato a un residuo di tirosina di ogni subunità A. o Un segmento di DNA a doppia elica passa quindi attraverso l interruzione formatasi tra le due estremità ancorate alle subunità A. o L enzima ricollega i filamenti Compattamento del DNA nei cromosomi a) Contenimento nel ristretto spazio cellulare (o virale) b) Protezione da possibili danni c) Maggiore stabilità per una corretta espressione dell informazione d) Efficiente trasmissione alle cellule figlie e) Organizzazione strutturale di ordine superiore: facilita l espressione genica e la ricombinazione omologa, che genera la diversità individuale DNA + proteine (> parte istoni) = cromatina 8

9 Le molecole di DNA sono fortemente compattate Vi sono 3 livelli di ripiegamento: 1. Nucleosomi (11 nm) 2. Filamenti da 30 nm 3. Anse radiali. Nucleosoma: Unità d impacchettamento della cromatina Il nucleosoma è composto di un core di di otto proteine istoniche e il DNA è avvolto intorno ad esse. Il DNA tra ciascun nucleosoma è chiamato DNA linker 9

10 Gli ISTONI sono le proteine più abbondanti associate al DNA eucariotico 5 tipi: H2A, H2B, H3, H4 (core del nucleosoma) H1 (lega il DNA linker fra 2 nucleosomi) proteine basiche, cioè cariche positivamente (> 20% di lisina e arginina) PM KDa (H1 è 20 kda) formati da un dominio ben conservato, detto histone-fold, formato da 3 α-eliche separate da 2 loop non strutturati Coda N terminale Histone fold La parte centrale del nucleosoma contiene un ottamero istonico e un DNA lungo 146 bp Cromatina al microscopio elettronico Tutto l istone H1 può essere rimosso senza alterare la struttura del nucleosoma, il che suggerisce che si trova all esterno della particella 10

11 Digestione DNA nucleosomico con Nucleasi micrococcica 11

12 Ci vogliono 80 paia di basi per fare un giro attorno all ottamero due regioni di DNA che siano separate di 80 paia di basi nella doppia elica in soluzione si trovano invece una vicina all altra sulla superficie del nucleosoma conseguenze funzionali H3 2 *H4 2 Nocciolo centrale 1 dimero H2A*H2B Visibile dall alto 12

13 Tramite le loro cariche + gli istoni si legano alla porzione zucchero- fosfato del DNA carico - Il DNA è avvolto 1,7 volte intorno all ottamero istonico, 13

14 Tutti e 4 gli istoni del nucleo stabiliscono contatti con il DNA: RIPIEGAMENTO ISTONICO L associazione è mediata da un grande numero di legami idrogeno tra le proteine e gli atomi di ossigeno dei legami fosfodiestere, vicino al solco minore del DNA. 14 siti di contatto 140 legami idrogeno 14

15 Ciascun istone del core possiede un estensione ammino-terminale chiamata coda che sporge all esterno del nucleosoma Posizioni code non ben definite La replicazione separa i filamenti di dna, quindi deve distruggere il nucleosoma, ma i nucleosomi si riformano immediatamente 15

16 La maggior parte dei nucleosomi non sono fissi nella loro posizione, ma possono venire posizionati in zone particolari (posizionamento dei nucleosomi). Rendere accessibile siti di legame sul DNA a proteine regolatrici (DNA linker) COMPLESSI DI RIMODELLAMENTO DEI NUCLEOSOMI ATP DIPENDENTI da 1,1 m X 2 nm a circa 16 cm X 11 nm 16

17 Nucleosoma 200 bp (146 DNA core+60 DNA linker) Ogni giro d elica contiene 10,5 bp ñ 200 bp/10,5 bp = 20 passi d elica Ogni passo d elica = 3,4 nm ñ 20 x 3,4 nm = 68 nm 68 nm/ 11 nm = 6 ñ Fattore d impaccamento 17

18 Il ruolo dell istone H1 L H1 interagisce sia con una porzione centrale del DNA core che con ~20 bp di uno dei due DNA linker, facendo aumentare la lunghezza di DNA arrotolato. L H1 induce i nucleosomi a raggrupparsi in un insieme ripetitivo ed ordinato Per formare la fibra di 30 nm Minore accessibilità per enzime e proteine al DNA Il legame di H1 aumenta il compattamento del DNA sul nucleosoma, imponendo una costrizione sugli angoli di entrata e uscita del DNA dal nucleosoma. 18

19 L istone H1 media la formazione della fibra da 30 nm L aggiunta di H1 stabilizza una struttura cromatinica di ordine superione: la fibra da 30 nm Sono stati proposti due modelli alternativi per illustrare la formazione di questa struttura: i) modello a soleneoide Superelica contenente 6 nucleosomi/giro DNA linker parte della superelica e non attraversa mai l asse del solenoide. ii) modello a zig- zag differisce dal precedente per la diversa posizione del DNA linker, che attraversa l asse longitudinale della fibra. 19

20 fibra da 30 nm In condizioni di maggiore forza ionica la cromatina appare come una fibra da 30 nm. Per ottenere questa struttura è necessaria la presenza dell istone H1. La fibra si avvolge su se stessa, con una periodicità di 6 nucleosomi per ogni giro, che corrisponde ad un rapporto di condensazione di 40 La fibra da 30 nm è la struttura di base sia della cromatina interfasica che di quella mitotica. Probabilmente l orientamento dei nucleosomi All interno della fibra è quello del solenoide: i nucleosomi sono ruotati di 60 uno rispetto all altro. L istone H1 è probabilmente localizzato all interno. Non conosciamo in dettaglio le strutture di ordine superiore in cui la fibra da 30 nm si organizza nel nucleo interfasico e nel cromosoma mitotico. 20

21 Le code istoniche contribuiscono alla formazione della fibra da 30 nm mediando interazioni (legami a idrogeno) tra nucleosomi adiacenti. istoni del core privi di code non sono in grado di formare fibre da 30 nm Le proteine istoniche mostrano un elevatissimo livello di conservazione per tutta la loro lunghezza. 21

22 sui nucleosomi: 6 volte: da 1 m a 16 cm nelle fibre da 30 nm: 40 volte: 1 m a 2.5 cm L impaccamento della cromatina molto lontano dall impaccamento necessario ( volte) per contenere il DNA nel nucleo. Strutture di ordine superiore della cromatina Il modello strutturale più accreditato realizza questo compattamento attraverso la formazione di anse (40-90 kbp) bloccate alla base da una struttura proteica denominata scaffold nucleare topoisomerasi II e proteine SMC (Structural Maintenance of Chromosome) sono componenti essenziali dello scaffold nucleare. I filamenti da 30 nm si associano ad un impalcatura di proteine non istoniche a formare le anse radiali. 22

23 5 avvolgimenti della doppia elica La compressione del DNA avviene a più livelli nucleosoma fibra da 30 nm fibra ad ansa fibra da 700 nm :cromatina si superavvolge (diametro dei singoli cromatidi) fibra da 1400 nm: livello di condensazione massimo (cromosomi mitotici) 23