UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PARMA FACOLTA' DI AGRARIA CORSO DI LAUREA IN SCIENZE E TECNOLOGIE ALIMENTARI

Transcript

1 UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PARMA FACOLTA' DI AGRARIA CORSO DI LAUREA IN SCIENZE E TECNOLOGIE ALIMENTARI Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare Valutazione di differenti strategie per la produzione in forma ricombinante di un fattore di trascrizione (AFLR) che controlla la sintesi delle aflatossine Relatori: Prof. RODOLFO BERNI Dott.ssa CLAUDIA FOLLI Laureanda: LIVIA BADALOTTI Anno Accademico 2002/2003

2 VALUTAZIONE DI DIFFERENTI STRATEGIE PER LA PRODUZIONE IN FORMA RICOMBINANTE DI UN FATTORE DI TRASCRIZIONE (AFLR) CHE CONTROLLA LA SINTESI DELLE AFLATOSSINE Laureanda: Livia Badalotti Relatori: Prof. Rodolfo Berni, Dott.ssa Claudia Folli Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare. Università di Parma. Introduzione Le micotossine, prodotti del metabolismo secondario di alcune specie di funghi filamentosi che possono svilupparsi su una grande varietà di derrate alimentari, sono tra le sostanze tossiche naturali più diffuse negli alimenti. Micotossina è il nome che generalmente viene dato ad un metabolita secondario che svolge azione tossica acuta o cronica verso l uomo e altri vertebrati. L importanza delle micotossine è dovuta al fatto che molte delle malattie conseguenti all'ingestione di alimenti contaminati da xenobiotici sono causate da metaboliti secondari di alcune specie fungine. Tre generi fungini, l Aspergillus, il Fusarium e il Penicillium, sono principalmente tossigeni. Oltre alle risposte tossiche tipiche delle micotossicosi, gli effetti genotossici, associati al possibile coinvolgimento di alcune micotossine nella eziologia dei tumori umani, destano particolare preoccupazione 1. In quest ambito, le aflatossine sono ritenute le più importanti, poiché, fra le sostanze naturali, sono quelle con la più accentuata attività cancerogena. La classe di micotossine più studiata è rappresentata dalle aflatossine 2, che possono essere prodotte da A. flavus, A. parasiticus e, più raramente, da A. nomius. Le aflatossine conosciute fino ad oggi sono numerose, ma, fra queste, quelle che più frequentemente contaminano i prodotti alimentari sono: aflatossine B 1, B 2, G 1, G 2, M 1, M 2. Gli alimenti di origine vegetale più frequentemente contaminati da aflatossine sono mais, arachidi e derivati, semi oleaginosi (lino, cocco, palma), diversi tipi di noci e mandorle, soprattutto se provenienti da zone tropicali e subtropicali. Tra gli alimenti di origine animale, particolarmente rilevante è la presenza di aflatossina M 1 in latte e derivati (effetto carry over). La biosintesi delle aflatossine è un processo multienzimatico altamente regolato, controllato da più di 20 geni e influenzato da una molteplicità di fattori ambientali e nutrizionali, che possono agire favorendo la biosintesi. Si ritiene che tali fattori possano modulare l espressione di un gene regolatore, aflr, il cui prodotto, l AFLR (Aflatoxin Regulator), è un fattore di trascrizione zinco-dipendente che regola l espressione dei geni che codificano per i diversi enzimi preposti alla biosintesi delle aflatossine.

3 Scopo della ricerca Poiché l AFLR è presente solo in piccole quantità nelle fonti naturali e non è quindi possibile la sua purificazione da tali fonti, in questo lavoro di tesi ci si è proposti di ottenere l AFLR in forma ricombinante, in quantità sufficienti per poterne studiare le proprietà regolative e strutturali. Per ottenerne l espressione sono stati impiegati due differenti sistemi di espressione: il batterio Escherichia coli e il lievito metilotrofico Pichia pastoris. Materiali e Metodi Espressione di AFLR in E. coli. Si è proceduto alla trasformazione, mediante elettroporazione, di cellule di E. coli, ceppo BL21 Origami, con pet 11b-AFLR e sono state condotte prove di espressione di AFLR in terreno LB e in presenza di IPTG 1mM. Espressione di AFLR in P. pastoris. Dopo amplificazione mediante PCR del DNA codificante per l'aflr e successiva reazione catalizzata dalla DNA-ligasi nel vettore ppic9k, sono state inizialmente trasformate cellule di E. coli, ceppo XL1B. La presenza dell inserto e la sua corretta direzione d'inserzione all interno del vettore sono state dimostrate mediante digestione con appropriate endonucleasi di restrizione associata al sequenziamento del plasmidio ppic9k- AFLR secondo il metodo di Sanger. Il plasmidio ricombinante ppic9k-aflr e il plasmidio ppic9k vuoto linearizzati con gli enzimi di restrizione Sac I e Dra I sono stati utilizzati per la trasformazione di cellule di P. pastoris, ceppo GS115 His -, rese elettrocompetenti. Successivamente sono state selezionate mediante terreni selettivi privi di istidina e contenenti metanolo come unica fonte di carbonio, cellule con fenotipo His + Mut s (crescita lenta in presenza di metanolo) e His + Mut + (crescita normale in presenza di metanolo). L avvenuta integrazione nel genoma dell ospite di ppic9k ricombinante è stata verificata mediante PCR, sfruttando come templato il DNA genomico estratto da alcune colonie che presentavano fenotipi Mut + e Mut s e primer localizzati nelle regioni AOX1 5' e AOX1 3' presenti sia nel genoma dell ospite sia nel vettore d espressione. L espressione della proteina è stata condotta mediante induzione da metanolo 0.5% per 6 giorni (colonie Mut s ) o per 4 giorni (colonie Mut + ), a 30 C. Il vettore ppic9k è stato sottoposto a mutagenesi sito-specifica con lo scopo di inserire un secondo sito di restrizione per l endonucleasi SnaB I, oltre a quello già naturalmente presente, in posizione adatta all'eliminazione della regione codificante per il segnale di secrezione (l'á-factor Signal Sequence). Dopo aver verificato la presenza della mutazione mediante digestione con l enzima di restrizione SnaB I, sono state inizialmente trasformate cellule di E. coli, ceppo XL1B, con il plasmidio ricombinante ppic9k mutato-aflr. Si è proceduto quindi a

4 trasformazione di cellule di P. pastoris e sono state condotte prove di espressione della proteina per colonie con fenotipo Mut + come sopra riportato. Risultati e discussione Espressione della proteina AFLR in E. coli. Per l espressione dell AFLR in E. coli è stato utilizzato il vettore plasmidico pet 11b che permette di ottenere una proteina integra e purificabile con metodi convenzionali. L analisi mediante SDS-PAGE (Fig.1) non ha, però, rivelato la presenza di una banda corrispondente alla proteina AFLR (47 kda) 1 2 M 45 kda 33 kda Figura 1. Analisi elettroforetica su gel in presenza di SDS (SDS-PAGE) dei prodotti di lisi cellulare di E. coli, ceppo BL 21 Origami, trasformato con il plasmidio pet 11b-AFLR indotto con IPTG. M: marcatori di peso molecolare, Rodanesi (33 kda) e Albumina (45 kda); lane1: estratto cellulare non indotto; lane2: estratto cellulare indotto. Espressione della proteina AFLR in P. pastoris. Per l espressione dell AFLR in Pichia pastoris è stato utilizzato il vettore ppic9k, sistema avanzato che permette l espressione ad alti livelli di proteine ricombinanti grazie ad un promotore forte e altamente inducibile da metanolo, il promotore AOX1. A seguito della fusione del DNA di interesse con la sequenza codificante per l'á-factor Signal Sequence, ppic9k è in grado di indirizzare la secrezione della proteina nel mezzo colturale. La sequenza codificante per AFLR è stata amplificata mediante PCR utilizzando primers specifici ed in seguito è stata clonata nel vettore ppic9k opportunamente linearizzato e defosforilato. Il sequenziamento del plasmidio ricombinante ppic9k-aflr ha permesso di verificare la correttezza del clonaggio. Il plasmidio ppic9k- AFLR linearizzato con l'enzima di restrizione Dra I, impiegato per la trasformazione di P. pastoris GS115 His -, ha dato origine principalmente a cloni His + Mut + e a poche colonie His + Mut s, mentre trasformando le cellule GS115 His - con i costrutti linearizzati ottenuti mediante digestione con l'enzima di restrizione Sac I si sono ottenuti solo cloni His + Mut + (Fig. 2a e 2b).

5 2a 2b Figura 2a: Integrazione del plasmidio ricombinante ppic9k-aflr nel locus HIS4 del DNA genomico di P. pastoris a seguito di taglio con l'enzima di restrizione Sac I. 2b: Integrazione del plasmidio ricombinante ppic9k-aflr nel genoma di P. pastoris mediante doppia ricombinazione a seguito di taglio con l'enzima di restrizione Dra I. Poiché non è possibile stabilire a priori il fenotipo più efficiente per l'espressione dell AFLR, questa è stata saggiata sia per l ospite ricombinante His + Mut +, sia per quello His + Mut s. Per il fenotipo Mut + è stata indagata l espressione di AFLR mediante l'analisi del mezzo colturale per 4 cloni trasformati con ppic9k-aflr e mediante l'analisi del pellet cellulare per 2 dei suddetti cloni. Dall analisi mediante SDS-PAGE dei mezzi di crescita, anche dopo concentrazione in centricon (cut-off ), dell ospite ricombinante Mut + trasformato con ppic9k-aflr, non sono risultate evidenti bande corrispondenti a proteine di peso molecolare simile a quello dell AFLR (47000). Si è proceduto, quindi, all analisi delle proteine estratte dalle cellule di P. pastoris, dopo opportuna lisi cellulare di due ceppi trasformati His + Mut +. Si è così osservata la presenza di una banda di peso molecolare corrispondente a quello della proteina AFLR fusa col segnale di secrezione (circa 60000), la cui intensità aumentava per i campioni corrispondenti ai tempi di induzione maggiori; questa banda era però presente anche nel campione non indotto e nel controllo trasformato con ppic9k senza inserto, suggerendo che essa fosse dovuta ad una proteina diversa da AFLR, ad esempio AOX1. E da notare, infatti, che la proteina AOX1, indotta da Metanolo, ha un peso molecolare simile a quello dell AFLR fusa con il peptide di secrezione potendo, così, prevenirne la rivelazione in modo univoco. Per ovviare a questa difficoltà di determinazione si è proceduto con la mutagenesi del vettore ppic9k, al fine di esprimere una proteina priva del suddetto segnale di secrezione. E stata, quindi, saggiata l espressione intracellulare dell AFLR nell ospite ricombinante His + Mut + per 5 cloni trasformati con ppic9k mutato-aflr. Dall analisi mediante SDS-PAGE delle proteine estratte dalle cellule

6 di P. pastoris dopo opportuna lisi cellulare dei ceppi trasformati His + Mut + mutati, si è potuto rilevare la presenza di una banda debolmente indotta avente peso molecolare simile a quello dell'aflr (47000), che aumentava in modo proporzionale al t empo di induzione; questa banda è però risultata presente anche nel controllo trasformato con ppic9k mutato senza inserto, anche se il suo livello di espressione sembrava essere costante nel tempo. Non è possibile, quindi, discriminare con certezza fra i due campioni in merito alla presenza della proteina d'interesse. L analisi mediante SDS-PAGE dei lisati totali dell ospite ricombinante Mut s, trasformato con ppic9k-aflr, non ha rivelato bande corrispondenti a proteine indotte di peso molecolare simile a quello dell AFLR fusa con il segnale di secrezione (60000). Benchè l analisi dei mezzi colturali di crescita tal quali non abbia evidenziato la presenza di bande corrispondenti alla proteina matura (47 kda), dopo concentrazione in centricon (cut-off ) dei mezzi di crescita per tre cloni Mut s si è rilevata la presenza di una proteina con peso molecolare attribuibile ad AFLR (Fig.3 ). M 1 M kda 45 kda Figura 3. Analisi elettroforetica in gel denaturante (SDS-PAGE) dei terreni di coltura concentrati ottenuti da una crescita di P. pastoris fenotipo Mut s trasformata con ppic9k-aflr e con ppic9k dopo 120 ore di induzione. M 1 : marker BSA (66 kda); M 2 : marker Albumina (45 kda); lane 1: terreno di coltura concentrato ottenuto da una crescita di P. pastoris fenotipo Mut s trasformata con ppic9k; lane 2, 3, 4: terreno di coltura concentrato ottenuto da una crescita di tre cloni di P. pastoris, fenotipo Mut s, trasformata con ppic9k-aflr. Conclusioni Mentre l analisi dei prodotti di espressione di E. coli, ceppo BL21 Origami, trasformato c on pet 11b-AFLR non ha evidenziato la produzione di AFLR, esperimenti successivi condotti con

7 il lievito metilotrofico Pichia pastoris, che è filogeneticamente vicino ai miceti filamentosi, hanno permesso di ottenere per alcuni trasformati una proteina probabilmente attribuibile ad AFLR, sebbene in basse quantità. Sono ora in corso indagini rivolte alla conferma dell'identità di questa proteina e alla individuazione delle condizioni più adatte alla sua sovra-espressione da parte di P. pastoris. 1 Bhatnager, D., Yu, J. and Ehrlich, K. C. (2002). Toxins of filamentous fungi. Chem. Immunol. 81, Sweeney, M. J., and Dobson, A. D. W., (1998). Mycotoxin production by Aspergillus, Fusarium and Penicillium species. International Journal of Food Microbiology. 43,