La fermentazione. Rese teoriche in ATP per molecola di glucosio

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1 B La fermentazione Nella fermentazione non si ha la completa demolizione del composto di partenza, che viene solo parzialmente fermentato in uno o più prodotti finali per lo più ancora organici, che mantengono ancora parte dell energia del composto iniziale. Pertanto la resa energetica della fermentazione non è paragonabile a quella dei processi respiratori e l ATP viene generato soltanto per trasferimento di un gruppo fosfato legato ad un intermedio del processo con un legame ad alto contenuto energetico all ADP (fosforilazione a livello di substrato) Rese teoriche in ATP per molecola di glucosio RESPIRAZIONE: molecole teoriche di ATP (2 da glicolisi, 2 dal ciclo di Krebs (GTP) e dalla catena di trasporto degli elettroni) FERMENTAZIONE ALCOLICA e LATTICA: 2 ATP FERMENTAZIONE dei BIFIDOBATTERI: 2,5 ATP Il metabolismo respiratorio è circa 15 volte più efficiente del metabolismo fermentativo Il metabolismo fermentativo, però, è molto rapido! 1 B La fermentazione La glicolisi è la principale via che precede numerose fermentazioni. Per la maggior parte dei processi fermentativi la stessa glicolisi è anche la via che frutta alle cellule l energia, scopo del processo metabolico (2 moli di ATP per mole di glucosio fermentato) attraverso le già citate reazioni di fosforilazione a livello di substrato. Le tappe successive della fermentazione hanno invece lo scopo di consentire la riossidazione delle due moli di, prodotte nell ossidazione della 3-fosfo gliceraldeide ad acido 1,3-difosfoglicerico, in quanto nei microrganismi anaerobi la catena di trasporto degli elettroni è incompleta. Pertanto l equilibrio ossido-riduttivo si ristabilisce mediante riossidazione del a spese di un intermedio del processo a valle dell acido piruvico. In qualche caso, in questo tratto della fermentazione si ha ulteriore produzione di ATP, che porta la resa energetica della fermentazione a valori comunque di ben poco superiori a 2 Quasi sempre le varie vie fermentative sono caratteristiche di ben definiti gruppi microbici, i quali dimostrano un elevata specificità di processo 2

2 B1 La fermentazione omolattica È operata dai batteri omolattici od omofermentanti, anaerobi obbligati ossigeno-tolleranti appartenenti ai generi Gram positivi Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus In questa fermentazione è lo stesso acido piruvico di origine glicolitica a fungere da accettore di elettroni per la riossidazione del, riducendosi così ad acido lattico lattato deidrogenasi da ricordare! 3 B2 La fermentazione alcolica È caratteristicafermentazione dei lieviti, che sono ALCOOLICA eumiceti unicellulari anaerobi facoltativi di cui è ben noto il genere Saccharomyces. L enzima-chiave di questa fermentazione è la piruvato decarbossilasi glucosio 2ATP 2 etanolo 2 gliceraldeide-3- P + NAD 2 CO2 2 acetaldeide NAD + da ricordare! 2 piruvato Equazione generale: 4ATP glucosio 2 etanolo + 2 CO2 Avviene anche nel già citato batterio Zymomonas Resa energetica = 2 ATP 4

3 succinato acetaldeide etanolo ossaloacetato B3 acetil-coa La fermentazione acido-mista glucosio 2 2ATP CO2 fosfoenolpiruvato piruvato 2ATP CoA (PEP) formiato lattato Gli enterobatteri (cioè i membri della famiglia Enterobacteriaceae) come Escherichia, Salmonella, Shigella e i generi Proteus, Vibrio e Photobacterium sono microrganismi Gramnegativi anaerobi facoltativi che in anaerobiosi fermentano il glucosio secondo questa via. I diversi prodotti finali caratteristici di questo provesso sono acidi organici a basso peso molecolare quali acido formico, acido acetico, acido lattico e acido succinico e piccole quantità di etanolo (in E. coli e Proteus l acido formico è scisso in CO 2 e H 2 dalla formico idrogenoliasi, un enzima la cui presenza assume una rilevante importanza tassonomica e diagnostica) acetil- P acetato ATP CO 2 H 2 formico idrogenoliasi I rapporti percentuali di questi prodotti variano nei diversi microrganismi e a seconda delle condizioni colturali e ambientali, sempre nel rispetto dell equilibrio ossido-riduttivo del processo 5 La fermentazione 2,3-butilenglicolica FERMENTAZIONE B4 2.3-BUTILENGLICOL acetaldeide etanolo glucosio 2 2 ATP lattato piruvato formiato acetil-coa 4 CO 2 H2 CO 2 Tipica di altre Enterobacteriaceae aventi come habitat il suolo o le acque (Enterobacter aerogenes e i generi Erwinia, e Serratia, patogeni delle piante). Il prodotto principale è il 2,3- butilenglicol che si forma dalla condensazione di due molecole di piruvato con la liberazione di due molecole di CO 2. In minore quantità si producono anche gli acidi della precedente fermentazione accanto a notevoli quantità di etanolo per il mantenimento dell equilibrio ossido-riduttivo. α-acetolattato acetoino acetoina CO 2 2,32,3-butilenglicol butilenglicole L uso di questa via causa il decremento della formazione di acidi (il butilenglicole è neutro) e la formazione dell intermedio ACETOINO. Coloro che si occupano di analisi microbiologica delle acque possono distinguere i coliformi fecali (fermentazione acidomista) dai non fecali (fermentazione butileglicolica tipica dei generi come Klebsiella) andando a svelare la presenza di acetoino ed un ph più alto o butandiolo 6

4 B5 La fermentazione propionica acido lattico acido assalacetico acido malico Il glucosio viene fermentato ad acido acetico, CO 2 ed acido propionico dal genere Propionibacterium attraverso una via complessa detta del metilmalonilcoa. Veillonella, il cui habitat è il rumine dei bovini, compie la stessa fermentazione partendo dall acido lattico. Altri microrganismi producono acido propionico da acido lattico attraverso una via diversa acido propionico N.B.: La resa energetica, tra le più elevate, include anche una mole di ATP prodotto per fosforilazione ossidativa (cioè attraverso la ATP sintasi) tramite una breve catena di trasporto degli elettroni nella riduzione del fumarato a succinato (respirazione del fumarato: è un tipo di respirazione anaerobica) Resa energetica = 5 ATP / 1,5 glucosio o 2 ATP / 3 ac. lattico 7 CH 3 - CH 2 - CH 2 - COOH FERMENTAZIONE BUTIRRICA B6 La fermentazione butirrica ATP CoA P i CH 3 - CH CH - CO - CoA H 2 O butirrato CH3 - CH2 - CH2 - CO - O - P butirril fosfato CH 3 - CH 2 - CH 2 - CO - CoA butirril-coa crotonil-coa CH 3 - CH - CH 2 - CO - CoA OH L (+) -β-idrossibutirril-coa Ferredossina idrogenasi Ferredossina 2H 2 2H + 2 glucosio 2CH 3 - CO - COOH 2Fd OX 2Fd RED 2CH 3 - CO - CoA 2ATP 2CO 2 2CoA CoA CH 3 - CO - CH 2 - CO - CoA acetoacetil-coa Si ritrova in Clostridium, sporigeno anaerobio obbligato sensibile all ossigeno, in grado di fermentare il glucosio. Caratteristica di questa via è la produzione di CO 2 e H 2 nella reazione del coenzima A (CoASH) con il piruvato. Il principale prodotto finale è l acido butirrico, la cui formazione consente il mantenimento dell equilibrio ossidoriduttivo Alcuni Clostridi producono in particolari condizioni butanolo e acetone, che sono di interesse industriale Equazione generale: glucosio butirrato + 2CO 2 + 2H 2 Resa: 3 ATP N.B.: la ferredossina è una ferro-zolfo proteina che media il trasferimento di elettroni in diverse reazioni metaboliche 8

5 B7 La fermentazione omoacetica In alcuni clostridi, il glucosio (1 mole) viene stechiometricamente fermentato a 3 moli di acetato, una delle quali deriva dalla riduzione delle 2 moli di CO 2, che provengono dalla scissione del piruvato ad acetil-coa Non va confusa con la produzione di acido acetico da parte di Acetobacter e Gluconobaceter, i quali, per produrre acido acetico, non operano una fermentazione, ma ossidano l etanolo ad acido acetico per recuperare potere riducente ( + H + ) 9 4 B8 Il metabolismo fermentativo dei bifidobatteri Ha scarsa attività nei bifidobatteri È assente nei bifidobatteri Aldolasi Il fruttosio 1,6 bisfosfato funge da induttore della lattato deidrogenasi 10

6 Fruttosio-6-P Pi H 2 O F6PPK (xfp) 4 B8 1 Acetil-P ADP ATP Acetato D-gliceraldeide-3-P D-eritrosio-4-P Diidrossiaceton transferasi Fruttosio-6-P D-sedoeptulosio-7-P Via fermetativa di Bifidobacterium o via della Fruttosio-6-P Fosfochetolasi D-xilulosio-5P D-ribosio-5-P 2 Acetil-P ADP ATP 2 Acetate D-ribulosio-5-P D-xilulosio-5-P Pi H 2 O 2 D-gliceraldeide-3-P F6PPK (xfp) ACETATO:LATTATO = 3:2 2 Formiato Etanolo 11 Legenda per la descrizione tassonomica p = phylum, cioè divisione c = classe o = ordine f = famiglia g = genere Per esempio, per descrivere Escherichia coli, scriveremo: p Proteobacteria;c Gammaproteobacteria;o Enterobacteriales; f Enterobacteriaceae;g Escherichia oppure, per descrivere Bacillus licheniformis: p Firmicutes;c Bacilli;o Bacillales;f Bacillaceae;g Bacillus 12

7 I BATTERI LATTICI Sono batteri Gram POSITIVI, immobili, chemioeterotrofi a forma di bastoncino o cocco Il loro nome deriva dal fatto che formano ACIDO LATTICO come principale (e talvolta unico) prodotto finale del loro metabolismo energetico Hanno un metabolismo fermentativo; sono tutti anaerobi con variabile capacità di tollerare l ossigeno (con rare eccezioni, legate alla presenza di EME esogeno) Sono incapaci di produrre ATP attraverso un metabolismo aerobio, a causa dell incapacità di sintetizzare citocromi o altri enzimi contenenti il gruppo eme. A causa dell impossibilità di produrre proteine eminiche, sono CATALASI NEGATIVI e quindi non possono operare la decomposizione dell H 2 O 2 in H 2 O e O 2 Una caratteristica propria dei batteri lattici è la loro elevata ACIDO-RESISTENZA, la quale consente loro di crescere fino a quando il ph raggiunge valori inferiori a 5. Questa caratteristica fisiologica è di grande importanza ecologica, perché permette loro di vincere la competizione di altri batteri in ambienti ricchi di materia organica. Come risultato della loro specializzazione fisiologica, i batteri lattici sono confinati in pochi e caratteristici ambienti naturali: alcuni vivono in associazione con le piante e crescono a spese delle sostanze nutritive liberate in seguito alla morte e alla decomposizione dei tessuti vegetali; si trovano quindi in alimenti e bevande preparate con materiale vegetale come sottaceti, crauti, foraggi insilati, vino e birra. Altri fanno parte del normale microbiota degli animali (bocca, intestino, mucosa vaginale). Infine, alcuni sono spesso associati al latte (per es. Streptococcus thermophilus). 13 Alcuni generi di batteri lattici Streptococcus Oenococcus Pediococcus Lactococcus Lactobacillus Enterococcus Carnobacterium Leuconostoc Immagini al SEM p Firmicutes;c Bacilli;o Lactobacillales;f Lactobacillaceae;g Lactobacillus p Firmicutes;c Bacilli;o Lactobacillales;f Lactobacillaceae;g Pediococcus p Firmicutes;c Bacilli;o Lactobacillales;f Streptococcaceae;g Lactococcus p Firmicutes;c Bacilli;o Lactobacillales;f Streptococcaceae;g Streptococcus p Firmicutes;c Bacilli;o Lactobacillales;f Leuconostocaceae;g Oenococcus p Firmicutes;c Bacilli;o Lactobacillales;f Leuconostocaceae;g Leuconostoc p Firmicutes;c Bacilli;o Lactobacillales;f Enterococcaceae;g Enterococcus p Firmicutes;c Bacilli;o Lactobacillales;f Carnobacteriaceae;g Carnobacterium 14

8 I BATTERI LATTICI Sulla base dei loro prodotti di fermentazione, sono divisi in tre sottogruppi metabolici 1 OMOFERMENTANTI: degradano il glucosio via glicolisi e non sono in grado di utilizzare i pentosi. Il piruvato viene poi ridotto ad acido lattico, unico prodotto della loro fermentazione 2 ETEROFERMENTANTI OBBLIGATI: non possono degradare il glucosio via glicolisi in quanto non possiedono l enzima FRUTTOSIO 1,6 DIFOSFATO ALDOLASI che catalizza la scissione del fruttosio 1,6 difosfato in gliceraldeide-3- fosfato e diidrossi-acetone-fosfato. Per tale ragione essi fermentano il glucosio attraverso la via dei pentoso fosfati, ottenendo tre prodotti finali in rapporto equimolare: ACIDO LATTICO, ETANOLO e CO 2. Possono utilizzare anche i pentosi, nel qual caso senza produzione di CO 2. Possono produrre anche piccole quantità di acido acetico 3 ETEROFERMENTANTI FACOLTATIVI: in presenza di ESOSI essi li fermentano attraverso la glicolisi con produzione di solo ACIDO LATTICO, comportandosi perciò come omofermentanti. In presenza di PENTOSI, effettuano l ossidazione di tali composti attraverso la via dei pentoso fosfati, senza produzione di CO 2 L acido lattico prodotto può essere in configurazione L, D oppure in miscela racemica DL 15 Oenococcus 16

9 Omofermentanti Zuccheri esosi X Zuccheri pentosi Eterofermentanti Esosi facoltativi Eterofermentanti esosi obbligati Pentosi in quantità ridotte ( ) 17 TERRENI COLTURALI PER BATTERI LATTICI Terreno MRS a ph 6,2-7: non selettivo, adatto per il mantenimento dei lattobacilli Terreno SL: selettivo per l isolamento dei lattobacilli (tripticase, estratto di lievito, citrato, glucosio, arabinosio, saccarosio, acetato, ph finale 5,4) Terreno ATB: adatto per l isolamento di Oenococcus oeni (peptone, estratto di lievito, succo di pomodoro 25 %, ph finale 4,8) Poiché i batteri lattici sono anaerobi (sebbene ossigeno tolleranti), i migliori risultati di crescita si ottengono incubando le piastre di isolamento in giare di anaerobiosi (Gas-Pak) 18

10 I BATTERI ACETICI p Proteobacteria;c Alphaproteobacteria;o Rhodobacterales;f Acetobacteraceae Appartengono alla famiglia delle Acetobacteraceae Sono bastoncini Gram NEGATIVI, aerobi chemio-eterotrofi, catalasi positivi, termolabili e psicrotrofi Sono marcatamente acidofili (crescono fino a ph 4, a concentrazioni di ac. acetico fino a 0,4 M) Il ph ottimale è compreso tra 5,4 e 6,3. Acetobacter pasteurianus cresce anche a ph 3 se l etanolo è inferiore all 8% Si localizzano soprattutto sulla superficie di piante, in particolare fiori e frutti Sono microrganismi mesofili che crescono con temperatura ottimale intorno a 30 C; alcuni ceppi si riescono a sviluppare anche a 5 C, altri sono blandamente termotolleranti (37-40 C) Tollerano basse concentrazioni di acido acetico; tollerano bene l etanolo e molti ceppi crescono in un range compreso tra 8 e 15 %. La concentrazione tollerata dipende da ph, temperatura e concertazione di O 2 I tre generi più noti: Acetobacter: A. xylinus, A. aceti, A. pasteurianus, A. cerevisiae, A. pomorum Gluconoacetobacter: G. xylinus, G. diazotrophicus, G. intermedius, G. liquefaciens Gluconobacter: G. oxydans, G. frateurii Altri generi e specie: Acidomonas methanolica, Asaia spp., Kozakia baliensis, Saccharibacter spp., Swaminathania spp., Frateuria spp. 19 Le specie più importanti nella produzione industriale dell aceto sono: - Acetobacter aceti subsp. orleanensis - Acetobacter aceti subsp. xylinum (madre dell aceto) - Acetobacter pasteurianus subsp. lovaniensis - Acetobacter pasteurianus subsp. ascendens - Acetobacter pasteurianus subsp. paradoxus In particolare, i membri del genere Acetobacter sono particolarmente importati da un punto di vista industriale (sia positivamente che negativamente) per diversi motivi, tra i quali: 1. sono usati per la produzione dell aceto (usati per convertire intenzionalmente l etanolo del vino o di altri prodotti alcolici in acido acetico) 2. possono deteriorare il vino producendo quantità eccessive di acido acetico o etil-acetato (entrambi rendono sgradevole il vino). La crescita di Acetobacter nel vino può essere inibita attraverso la completa eliminazione dell ossigeno durante la conservazione del vino oppure con l aggiunta di moderate quantità di SO 2 3. sono usati per acidificare intenzionalmente alcune birre aventi periodi di maturazione lunghi (per esempio per la produzione della birra tradizionale Flemish Sour Ale) 20

11 Peculiarità metaboliche I batteri acetici sono aerobi obbligati aventi metabolismo aerobio (respirazione aerobica) In particolare, i batteri acetici sono caratterizzati da metabolismo aerobio con ossidazione incompleta dei substrati organici Utilizzano diverse fonti di carbonio, dagli zuccheri agli aminoacidi. Preferiscono etanolo, glicerolo, lattato, mannitolo, sorbitolo, fruttosio, glucosio Come fonte di azoto molti ceppi utilizzano NH 4 + Gli zuccheri sono ossidati esclusivamente attraverso la via del pentosio fosfato L acetato deriva dalla ossidazione parziale della materia organica e non da un vero processo di fermentazione Il PIRUVATO è trasformato attraverso una decarbossilazione non ossidativa ad acetaldeide (la decarbossilazione ossidativa del piruvato ad Acetil-CoA e CO 2, tipicamente presente nel processo di respirazione, non avviene in quanto il COMPLESSO DELLA PIRUVATO DEIDROGENASI nei batteri acetici è inattivo) FONDAMENTALE!!! DA RICORDARE!!! 21 I BATTERI ACETICI tutto il generato in queste reazioni di ossidazione è destinato alla catena di trasporto degli elettroni, per creare il gradiente di H+ che permette la sintesi dell ATP ACIDO LATTICO NAD + +H + lattato deidrogenasi Glucosio via del pentosio fosfato pentosi-p interconversione non ossidativa triosi-p ultime tappe della glicolisi Ac. piruvico ETANOLO NAD + +H + alcol deidrogenasi CO 2 decarbossilazione non ossidativa Acetaldeide NAD + +H + aldeide deidrogenasi acetil-coa ligasi acetil-coa sintetasi Gluconobacter non ha un ciclo di Krebs funzionale e non può dunque ossidare l acetato Ac. acetico Acetil-CoA Ciclo dei TCA CO 2 CO 2 In Acetobacter il ciclo di Krebs è inibito solo a concentrazioni elevate di etanolo 22

12 I BATTERI ACETICI: la metabolizzazione dell etanolo Sono capaci di crescere utilizzando etanolo come unica fonte di carbonio ed energia producendo acido acetico L etanolo, infatti, viene ossidato ad acetato, ed il potere riducente ottenuto si trasforma in energia per la cellula (cioè in ATP) a livello della catena di trasporto degli elettroni CH 3 CH 2 OH pirrolochinolin-chinone, associato all aldeide deidrogenasi NAD +, PQQ catena respiratoria biosintesi, PQQH 2 ATP CH 3 COOH rilasciato extracellularmente acetil-coa sintetasi detta anche acetil-coa ligasi CH 3 COSCoA KREBS X Il blocco del ciclo di Krebs è causato da: presenza di etanolo in Acetobacter carenze genetiche in Gluconobacter 23 I BATTERI ACETICI: la metabolizzazione dell etanolo La produzione di acido acetico a partire da etanolo da parte dei batteri acetici NON è una fermentazione, ma il risultato di una semplice ossidazione parziale dell etanolo, al fine di recuperare potere riducente Solo i membri del genere Acetobacter possono ossidare completamente l acetato a CO 2, se le concentrazioni di etanolo non sono troppo alte 24

13 Come distinguere Acetobacter da Gluconobacter in laboratorio Si devono preparare piastre contenenti il seguente terreno di coltura agarizzato: Estratto di lievito CaCO 3 50 g/l 20 g/l Etanolo 7 % Agar 20 g/l rende il terreno di coltura opaco è la fonte di carbonio ed energia per il batterio Dopo semina e incubazione a 28/30 C per 2-3 giorni, parte dell etanolo sarà convertito dai batteri acetici in acido acetico, che abbasserà il ph solubilizzando il carbonato di calcio: le colonie appariranno quindi con un alone di chiarificazione intorno a loro. Prolungando l incubazione la concentrazione di etanolo diminuirà fino a permettere agli Acetobacter di ossidare completamente l acido acetico prodotto (poiché il ciclo di Krebs è sbloccato). Dopo altri 2-3 di incubazione, quindi, il ph sarà risalito, con conseguente riprecipitazione del carbonato di calcio. Dopo un totale di 5-6 giorni di incubazione, quindi, le colonie di 2-3 giorni di Gluconobacter avranno un alone di incubazione chiarificazione, mentre quelle di Acetobacter no, poiché il carbonato di 5-6 giorni di calcio riprecipitando avrà reso di incubazione nuovo opaco il terreno (sì vedrà un alone opaco di precipitazione). Acetobacter Gluconobacter colonia batterica alone di chiarificazione alone di precipitazione 25 La fermentazione malolattica (o meglio, conversione malolattica) NON è una fermentazione nel senso metabolicamente corretto del termine 26

14 CENNI DI ANABOLISMO L'anabolismo comprende tutto l'insieme dei processi di sintesi o bioformazione delle molecole organiche (biomolecole) più complesse da quelle più semplici o dalle sostanze nutritive. Questi processi richiedono energia, al contrario del catabolismo Sebbene l'anabolismo e il catabolismo siano due processi contrari, funzionano in maniera coordinata ed interdipendente Le vie cataboliche forniscono gli intermedi biochimici utili all anabolismo per operare la biosintesi delle macromolecole 27 I PRECURSORI BIOSINTETICI DEGLI AMMINOACIDI 28

15 SINTESI DELLE STRUTTURE CELLULARI A PARTIRE DA GLUCOSIO I precursori metabolici formati dalla glicolisi, dal ciclo dei TCA e dalle vie correlate entrano nelle vie biosintetiche che producono i monomeri o i mattoni di tutte le componenti cellulari. Ulteriori reazioni polimerizzano i monomeri per formare macromolecole che interagiscono per produrre le strutture che costituiscono la cellula batterica PROTOTROFIA e AUXOTROFIA CAPACITÀ DI SINTETIZZARE... un amminoacido... una base azotata... etc INCAPACITA DI SINTETIZZARE UN... amminoacido... una base azotata... etc... FABBISOGNO COLTURALE, NUTRIZIONALE 29 LA BIOSINTESI DELLE BASI AZOTATE 30