METODI GENETICI NELLA IDENTIFICAZIONE DI

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1 METODI GENETICI NELLA IDENTIFICAZIONE DI CIANOBATTERI Susanna Vichi, Simonetta Gemma, Emanuela Testai Dip. Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Istituto Superiore di Sanità, Roma Convegno Cianobatteri ISS 15 novembre 2007

2 Identificazione di cianobatteri nella metodica tradizionale : analisi morfologica osservazione al microscopio Limiti: soggettività dell operatore nell interpretazione della morfologia delle cellule impossibilità di discriminare tra specie tossiche e non Necessita la combinazione con saggi chimici, biochimici o enzimatici sulle tossine L APPROCCIO GENETICO nel monitoraggio ambientale permette di seguire il fenomeno delle fioriture it sin dalle fasi più precoci attraverso identificazione tassonomica ed eventuale rilevazione di ceppi potenzialmente tossici.

3 APPROCCI MOLECOLARI COMUNI NELLA DETERMINAZIONE DI CIANOBATTERI. Campione ambientale Real-time PCR Estrazione DNA/RNA RT-PCR RFLP PCR DGGE Bioinformatica (Sequenziamento, Allineamento)

4 LA BIOINFORMATICA COME POTENTE STRUMENTO NELLA IDENTIFICAZIONE DI POPOLAZIONI IN CAMPIONI AMBIENTALI PCR Sequenziamento Programmi di allineamento di sequenze (BLAST) Confronto con banche dati; Ricerca del best match Si risale all organismo; Si ipotizzano relazioni filogenetiche

5 CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI CIANOBATTERI: 1. Definizione TASSONOMICA degli individui (genere, specie, ceppo) 2. Definizione di specifiche SONDE MOLECOLARI per l identificazione di specie tossiche

6 1. Definizione TASSONOMICA e analisi filogenetica di campioni ambientali (a livello di genere, specie, e, ceppo): - Amplificazione all interno del gene per l rrna 16S: Primers universali PCR Analisi RFLP disegnati in regioni ben conservate - Amplificazione dell INTERGENIC SPACER nell operone FICOCIANINA (regione potenzialmente ad alta variabilità) PC-IGS cpcb cpca cpcc cpcd cpce 2 biline α e β 3 peptidi linker - Amplificazione di altri marcatori (geni nif, per trna)

7 Es: Ricerca di Planktothrix mediante amplificazione del marker PC-IGS Campioni ambientali eterogenei DNA amplificazione della regione PC-IGS come marcatore genere-specfico di Planktothrix ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO Lane 1 = assenza di Planktothrix Lane 2, 3, 4 = Planktothrix Lane 5 = bianco Lane 6 = ladder

8 2. Definizione di specifiche SONDE MOLECOLARI per la ricerca di specie tossiche all interno di un campione ambientale L identificazione di eventuali specie tossiche si realizza mediante la ricerca di specifici i geni marker (mcy),) raggruppati in cluster, che codificano per grandi complessi multienzimatici (NRPS o Peptide Sintetasi Non Ribosomali) coinvolti nella biosintesi delle Microcistine. Cluster mcy per la biosintesi delle microcistine (Planktothrix genera). Raggruppa 9 geni che codificano per diversi domini del complesso multienzimatico della MICROCISTINA SINTETASI kb mcyt mcyd mcye mcyg mcyh mcya mcyb mcyc mcyj = Peptide Sintetasi = Polichetide Sintasi = Modifica = Trasporto Ortologhi dei geni mcy sono stati trovati in altre specie di Cianobatteri tossici inclusi Microcistis, Nostoc, Anabaena, Nodularia.

9 Nel cluster mcy possono essere presenti delezioni anche estese in grado di alterare la funzionalità del prodotto proteico Es: Ricerca di microcistine in relazione alla presenza di marcatori mcy in colture di P. agardhii e P. rubescens (modified from S. Mbedi et al., 2005). Ceppo microcistina mcyt mcytd mcya mcyb mcye P. agardhii HUB076/A P. agardhii LAN P. agardhii Max P. agardhii Max P. agardhii Max P. rubescens BL P. rubescens BL P. rubescens HUB = falsi positivi - = falsi negativi

10 Es.: Ricerca e quantificazione di genotipi tossici di P. Rubescens nelle acque del lago di Gerosa mediante Real time PCR (qpcr). Campione ambientale Cellule su filtro 0,2 µm; Conservazione a -20 C Estrazione DNA (fenolo:cloroformio:alcool isoamilico) Taq Nuclease Assay (o saggio Taqman): Amplificazione all interno dei loci Pc (per la definizione tassonomica) e mcyb (come marcatore di tossicità). Coppia di primers specifici + sonda fluorescente Emissione di fluorescenza durante la reazione di PCR strettamente correlata numero di copie target presenti inizialmente.

11 RISULTATI (1 anno di rilevamenti): novembre 2006: picco conc. cell. bassa conc. microcistine dicembre 2006: bassa conc. cell. picco conc. microcistine November (surface) December (surface) Microcystins ELISA 1,28 2,04 (µg/l) LC/MS 0, ,4 Cells n. (10 6 ) 44 3,7 mcyb vs Pc (%) qpcr 31% 63,7% Lo sfasamento tra il numero degli individui e la produzione della microcistina può essere parzialmente spiegato con una variazione della percentuale degli individui tossici rispetto a quelli non tossici.

12 USO DI METODOLOGIE MOLECOLARI NELLA CARATTERIZZAZIONE DI CIANOBATTERI: VANTAGGI Rapidi e relativamente economici Alta specificità e sensibilità Permettono di discriminare tra ceppi morfologicamente identici Consentono il diretto utilizzo del campione ambientale, senza dover necessariamente allestire una coltura cellulare Saggi qualitativi / quantitativi / di espressione (PCR) (qpcr) (RT-PCR) Permettono di risalire all organismo produttore della tossina Non richiedono processamento immediato del campione, che può essere conservato nel tempo

13 USO DI METODOLOGIE MOLECOLARI NELLA CARATTERIZZAZIONE DI CIANOBATTERI: LIMITI Non possono essere applicati sempre database di sequenza ancora lacunosi per alcune specie difficoltà nel disegno di primers efficaci Variabilità di sequenza intra-specie rischio di sottostimare la popolazione se i primers scelti non sono disegnati entro regioni ben conservate Possono dare falsi negativi o falsi positivi se i geni marker non sono opportunamente scelti Danno una stima del DNA totale, non permettono discriminare tra cellule vive e morte