RENATO TOZZOLI, GRAZIANO KODERMAZ SERVIZIO DI MEDICINA DI LABORATORIO OSPEDALE CIVILE, LATISANA (UD) SPOLETO, 08 MAGGIO 2009

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1 RENATO TOZZOLI, GRAZIANO KODERMAZ SERVIZIO DI MEDICINA DI LABORATORIO OSPEDALE CIVILE, LATISANA (UD) SPOLETO, 08 MAGGIO 2009

2 Cisteina di 3 gruppo (176) Unità ripetute ricche di leucina Cisteine di 2 gruppo ( ) Cisteine di 1 gruppo ( ) Dominio EGF simile Subunità A Peptide C Siti di clivaggio NH 2 Cisteine di 3 gruppo ( ) COOH Subunità B

3 Anticorpi anti-tshr: ad attività stimolante (TSAb), ad attività bloccante (TBAb), ad attività neutra I TRAb sono IgG a bassa concentrazione, oligoclonali, prevalentemente IgG2, dirette verso diversi epitopi Epitopi immunodominanti conformazionali, come piccoli (5-12 aa), discontinui e multipli punti di contatto sulla superficie del recettore per TSAb: regione aminoterminale (22-80), ma anche carbossiterminale ( ): domini A-E per TBAb: regione carbossiterminale (AA ): domini C-D per TSH: regione centrale (AA ): domini C-D-E

4 TSHR-subunit structure Ando T, et al. Endocrinology 2004;145:

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6 Autoanticorpi inibenti il legame del TSH (TBIAb) Metodi recettoriali di I generazione (RRA, ERA) TSHR porcini solubilizzati Metodi recettoriali di II generazione (RRA, LRA) TSHR umani ricombinanti Anticorpi monoclonali adesi Metodi recettoriali di III generazione (ELISA) TSHR umani purificati Anticorpi monoclonali M22 biotinilati Autoanticorpi stimolanti la funzione (TSAb) Metodi biologici cellule FRTL-5, CHO transfettate Produzione di AMP ciclico Autoanticorpi bloccanti l azione del TSH (TBAb) Metodi biologici cellule FRTL-5, CHO transfettate Produzione di AMP ciclico

7 II generazione III generazione

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9 MoAb RSR B2 murino ad attività bloccante (Sanders J, et al. Thyroid 2005) MoAb umano 5C9 ad attività bloccante (Sanders J, et al. Thyroid 2008) Da linfociti periferici di una paziente (27 anni), affetta da ipotiroidismo post-partum Cellule da eteroibridoma secernenti 5C9, ottenute per immortalizzazione dei linfociti con EBV e fusione con cellule di ibridoma murino IgG1 κ e in particolare il frammento Fab potente inibitore di TSH e MoAb M22 in CHO transfettate con TSHR MoAb M22 umano ad attività stimolante (Sanders J, et al. Lancet 2003) Da linfociti periferici di un paziente (19 aa) affetto da MG e T1D Cellule da eterpibridoma secernenti M22, ottenute per immortalizzazione dei linfociti con EBV e fusione con cellule di ibridoma murino IgG 1λ e in particolare il frammento Fab potenti stimolatori di camp in CHO trasfettate con TSHR

10 A: 5C9 binding B: RSR-B2 binding C: M22 binding

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13 Produttore Formato Tempo Coniugato Metodo Metodi ad automazione parziale Euroimmun Micropiastra 120 M22-biotinastreptavidina-perossidasi Radim Micropiastra 210 M22-biotinastreptavidina-perossidasi Pantec Micropiastra 210 M22-biotinastreptavidina-perossidasi Medipan Micropiastra 210 M22-biotinastreptavidina-perossidasi Roche (Elecsys- Modular) RAD 120 Microparticelle magnetiche Microparticelle magnetiche Metodi ad automazione totale ELISA ELISA ELISA ELISA 27 M22-rutenio CLIA 120 M22-fosfatasi alcalina (4-MUP) FIA

14 Sistema analitico automatico Particelle magnetiche Accesso continuo Metodo enzimatico fluorescente 120 campioni e 20 reagenti in linea

15 Random Access Device 120

16 Fluorescenza con fase solida a particelle magnetiche Accesso continuo 120 test/ora Walk away: 400 test 120 campioni in linea 20 reagenti in linea

17 Substrato: 4-metilumbelliferone-fosfato Fase solida: particelle magnetiche Ab o Ag coniugati con fosfatasi alcalina

18 Particelle paramagnetiche come fase solida Cristalli di magnetite (Fe 3 O 4 ) rivestiti di zirconia Diametro: 2-3 mm Superficie:100 cm 2 /g Alta capacità legante Separazione rapida ed efficiente Lunga stabilità Alta sensibilità Sospensione della fase solida in 3 secondi

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21 Casistica 19 Pazienti con morbo di Graves, attivo, non trattati (UTGD) 32 Pazienti con morbo di Graves, attivo, in trattamento (TGD) 6 Pazienti con morbo di Graves, trattati, in remissione (CRGD) 11 Pazienti con morbo di Graves, trattati, in recidiva (RGD) 18 Pazienti con tiroidite di Hashimoto (HT) 5 Pazienti con mixedema idiopatico (IM) 91 pazienti totali 119 controlli sani (HC)

22 50 45 Dynotest = 0.98 IU/l TRAb RAD120 Risposta (CV%) Lumitest = 0.98 IU/l Risposta (CV%) Dose (IU/L) Dose (IU/L)

23 GD Hyper-P Hyper-L Eu TGD

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25 TRAb IIIG Cut-off 1.0 % P/T Cut-off 1.5 % P/T Latisana 35.5 (54/152) 25.7 (39/152) Pordenone 26.3 (40/150) 18.7 (28/150) Totale 31.1 (94/302) 22.2 (67/302)

26 Radim Brahms

27 Il metodo automatico per il dosaggio di TRAb di IIIG Radim presenta: Praticità d uso Elevata precisione Elevata sensibilità Capacità di evidenziare la presenza di TRAb in circa 1/3 dei pazienti ipertiroidei Capacità di dosare esclusivamente i TSAb Superiore sensibilità clinica rispetto a TRAb IIG Specificità elevata, da confermare su pazienti non sani, non ipertiroidei

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