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1 Sede Amministrativa: Università degli Studi di Padova DIPARTIMENTO DI SCIENZE CHIRURGICHE E GASTROENTEROLOGICHE Scuola di Dottorato di Ricerca in BIOLOGIA E MEDICINA DELLA RIGENERAZIONE Indirizzo: SCIENZE EPATOLOGICHE E GASTROENTEROLOGICHE CICLO XXII Valutazione del ruolo delle cellule progenitrici epatiche e del microambiente cellulare e molecolare nel processo di rigenerazione e carcinogenesi epatica Direttore della Scuola : Ch.mo Prof. PierPaolo Parnigotto Coordinatore d indirizzo: Ch.mo Prof. Giacomo Carlo Sturniolo Supervisore: Dott.ssa. Patrizia Burra Dottorando: Debora Bizzaro

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3 Indice INDICE Sommario 5 Abstract 6 Abbreviazioni 7 1. Introduzione 1.1 Rigenerazione epatica Le cellule staminali adulte Cellule progenitrici epatiche La risposta duttulare Modelli animali di attivazione delle cellule progenitrici epatiche cellule progenitrici epatiche nelle patologie dell uomo Il microambiente La nicchia staminale Cellule stellate Cellule di Kupffer Infiammazione e rigenerazione Interferon gamma (INFγ) Tumor Necrosis Factor (TNF) Transforming Growth Factor β (TGF β) Interleuchina Infiammazione e cancerogenesi Cellule staminali tumorali Dimorfismo fisiopatologico del danno nei due sessi 27 2 Scopo dello studio 29 3 Materiali e metodi Modelli animali Primo esperimento di danno epatico acuto Secondo esperimento di danno epatico acuto Danno epatico cronico potenzialmente cancerogeno Analisi istologica Inclusione in paraffina Colorazione ematossilina-eosina Colorazione speciale Tricromica di Masson 38 3

4 Indice Colorazione PAS-D Immunoistochimica Immunofluorescenza Analisi bioumorali Analisi espressione genica Estrazione RNA totale Retrotrascrizione Real Time PCR Saggio di Griess Risultati Primo esperimento danno acuto Sopravvivenza Analisi della prima risposta al danno acuto Analisi della fase tardiva Secondo esperimento danno acuto Sopravvivenza Progressione del danno istologico Analisi del quadro infiammatorio Analisi della presenza di cellule stellate danno cronico potenzialmente cancerogeno Sopravvivenza ed esame macroscopico Quadro istologico Analisi bioumorali Valutazione dell effetto di CCl 4 e DEN in vitro Discussione Bibliografia 81 4

5 Sommario Sommario La rigenerazione epatica, processo fisiologico indispensabile per la normale omeostasi del fegato, è l evento finale di un complesso processo che implica l interazione di diversi tipi cellulari e segnali molecolari che compongono il microambiente del fegato. Tra i segnali molecolari hanno un ruolo fondamentale gli ormoni steroidei sessuali e le molecole infiammatorie. Lo scopo di questa ricerca è stato quello di valutare in un modello murino di danno epatico acuto (indotto con CCl 4 ) e cronico (indotto con DEN) le alterazioni molecolari e cellulari in animali di sesso maschile e di sesso femminile. È stata inoltre testata la Monocrotalina, un alcoloide che blocca la proliferazione degli epatociti. Negli animali trattati si è osservato un tasso di mortalità significativamente superiore rispetto ai non trattati, un quadro istologico più compromesso ed una maggiore attivazione delle cellule stellate, mentre non sono state riscontrate differenze significative circa l attivazione delle cellule progenitrici epatiche. Valutando la differenza della risposta tra sesso maschile e femminile, il presente studio ha rilevato un significativo dimorfismo che riguarda prevalentemente il tipo ed il grado della risposta infiammatoria suscitata dal danno indotto con il medesimo agente tossico. Nei topi di sesso femminile sembra esserci una predominanza di citochine di tipo Th1 (rappresentate dall IFNγ), mentre nei fegati degli animali di sesso maschile predomina l infiammazione di tipo Th2 (rappresentata da IL-4). È stato quindi evidenziato che gli animali dei due sessi rispondono attivando due vie di infiammazione diverse per lo stesso stimolo nocivo. Inoltre nei fegati degli animali di sesso maschile è stata riscontrata una sovraregolazione del TNFα che secondo una recente ipotesi sembra essere indotto dalla stimolazione dei recettori degli androgeni presenti sulle cellule di Kupffer. La produzione massiva di TNFα potrebbe spiegare la risoluzione più lenta del danno epatico negli animali di sesso maschile e al contempo l elevato numero di cellule macrofagiche presenti nell animale maschio. Dal presente studio è quindi emerso che in corso di rigenerazione epatica il microambiente epatico gioca un ruolo fondamentale ed in particolare è emersa l importanza della componente ormonale e infiammatoria e della loro interazione nell intero processo. Il ruolo che gli ormoni sessuali possono svolgere nel modulare la risposta infiammatoria e quindi la capacità rigenerativa può essere di fondamentale importanza per la valutazione clinica e terapeutica di diverse patologie infiammatorie che presentano dimorfismo sessuale. 5

6 Abstract ABSTRACT The liver regeneration, an essential process for physiological homeostasis of the liver, is the final event of a complex process that involves the interaction of different cellular and molecular signals of the hepatic microenvironment. The most important molecular signals are sex steroid hormones and inflammatory molecules. The aim of this research was to evaluate in a mouse model the molecular and cellular changes in response to acute (induced by CCl 4 ) and chronic (induced by DEN) hepatic injury. We also compared animals treated and not treated with Monocrotaline, an alkaloid that blocks the hepatocyte proliferation. Treated animals showed a significantly higher mortality rate, histology features were more impaired with a greater activation of stellate cells compared to non-treated animals, while there were no significant differences concerning the activation of liver progenitor cells. Regarding the gender difference, a significant dimorphism on the type and degree of the inflammatory response to a damage caused by the same toxic agent was seen in male and female. In female mice it appears to be a predominance of Th1-type cytokines (mainly IFNγ), while in male mice the dominant inflammation was Th2-type (IL-4). Animals of different gender responded by activating two different pathways of inflammation for the same noxa. Moreover, we found the upregulation of TNFα, according to a recent hypothesis, suggesting to be induced by the stimulation of androgen receptors on Kupffer cells in male livers. The massive production of TNFα could explain in male livers both the slower resolution of liver injury and the high number of Kupffer cells. This study showed that during liver regeneration, the hepatic microenvironment plays a crucial role and, in particular, highlighted the importance of hormonal and inflammatory components and their interaction throughout the process. The role that sex hormones may play in modulating the inflammatory response and thus the regenerative capacity may be of fundamental importance for the clinical evaluation and therapy of inflammatory diseases with sexual dimorphism. 6

7 Abbreviazioni ABBREVIAZIONI α-sma AAF CK CS CSC DEN DEPC DMEM dntp FBS IFN IL LPS mrna NO O/N PBS Real Time PCR SEM TA TGF Th Tm TNF α-smooth muscle actin Acetaminofluorene Citocheratina Cellula Staminale Cancer Stem Cell Dietilnitrosamina dietilpirocarbonato Dulbecco s modified Eagle Medium Deossiribonucleoside trifosfato Siero fetale bovino Interferone Interleuchina Lipopolisaccaride RNA messaggero Ossido Nitrico Over Night Phosphate buffered saline Real Time polymerase chain reaction Standard Error of the Mean Temperatura ambiente Transforming Growth Factor T helper Temperatura di melting Tumor Necrosis Factor 7

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9 Introduzione 1. INTRODUZIONE 1.1 Rigenerazione epatica La capacità del fegato di rigenerarsi è nota da epoca immemorabile come dimostra il mito di Edipo degli antichi greci, che racconta del titano Prometeo che coraggiosamente rubò il fuoco agli dei per donarlo agli uomini. Zeus, scoperto il furto, lo condannò a essere incatenato per l'eternità a una roccia sulle montagne del Caucaso e dispose che ogni giorno un'aquila gigante gli divorasse il fegato. Ogni notte però il suo fegato ricresceva, così che l'aquila potesse tornare a divorarlo il giorno seguente. Il fegato si caratterizza nei mammiferi, infatti, per la sua peculiare capacità di mantenere costanti le sue dimensioni, anche in seguito a danno epatico di grave entità che può conseguire alla resezione chirurgica od in seguito a danno tossico, ischemico o virale (Taub, 2004). La rigenerazione del fegato presumibilmente si è evoluta per proteggere gli animali allo stato selvatico dagli eventuali danni all organo determinati da intossicazioni con tossine alimentari dato che il fegato è il primo filtro per tutte le sostanze assorbite nel tratto gastrointestinale. La capacità rigenerativa del fegato è stata per la prima volta dimostrata da Higgins e Anderson nel 1931 in un modello sperimentale di epatectomia parziale (Higgins, 1931). In tale modello murino, alla rimozione chirurgica di 2/3 della massa epatica conseguiva una rapida crescita del fegato residuo con rigenerazione dell organo in circa una settimana dall intervento. La rigenerazione epatica è regolata da meccanismi molecolari ancora non del tutto conosciuti, ma è noto che il fegato è in grado di recuperare le sue dimensioni sia dopo perdita di massa che iperplasia. Il processo di rigenerazione può essere definito un fenomeno di tipo compensatorio dato che la massa finale del fegato che ha rigenerato è in funzione delle necessità dell organismo ed una volta che la massa originaria è stata ripristinata, la proliferazione delle cellule coinvolte cessa (Koniaris, 2003). 9

10 Introduzione Le principali cellule coinvolte nel processo di rigenerazione sono gli epatociti che si dispongono a formare la principale unità funzionale del fegato, il lobulo epatico (Mall, 1906). Il lobulo epatico ha forma esagonale delimitato ai vertici dalle triadi portali che sono costituite da una diramazione della vena porta, una diramazione dell arteria epatica ed in un dotto epatico tenuti strettamente uniti da degli epatociti che formano la cosiddetta lamina limitante (Fig. 1.1). Il sangue perfonde il lobulo dalla vena porta e dall arteria epatica attraverso i sinusoidi fino alla vena che si trova al centro del lobulo (vena centro lobulare). Triade portale Vena centrolobulare Fig. 1.1 Il lobulo epatico Il turn-over cellulare degli epatociti è relativamente lento, la vita media di un epatocita si aggira, infatti, intorno ai giorni (Bucher., 1971) e per tale motivo il fegato viene definito un organo stabile. In caso di danno epatico però, gli epatociti escono dalla fase G0 del ciclo cellulare ed iniziano a replicare al fine di recuperare la massa persa. Dopo epatectomia parziale, infatti, la proliferazione dei compartimenti principali epiteliali (epatociti e colangiociti), seguita dalla proliferazione delle cellule mesenchimali (cellule stellate), ripristina velocemente la massa epatica (Ponder, 1996). Nei roditori, il fegato può ripristinare il suo volume originale in seguito alla rimozione di 2/3 del parenchima epatico in circa 10 giorni. (Michalopoulos, 1997; Fausto, 2004). Condizioni di danno epatico cronico causato da farmaci, virus e tossine possono però ostacolare la proliferazione degli epatociti. In tali condizioni, è stato comprovato che un ruolo essenziale nella rigenerazione epatica è giocato da una 10

11 Introduzione popolazione di cellule staminali residenti nel fegato che prendono il nome di cellule progenitrici epatiche o cellule ovali nel modello murino, termini usati indistintamente a seguire nel testo. Tali cellule possono essere considerate vere e proprie cellule staminali adulte o somatiche. 1.2 Le cellule staminali adulte In base alle conoscenze attuali, in molti e forse in tutti gli organi dei mammiferi sono presenti delle cellule staminali adulte che intervengono nei normali processi di turn-over cellulare e nei processi di riparazione di un eventuale danno. In passato si riteneva che soltanto i tessuti soggetti a continuo ricambio (sangue ed epiteli) possedessero cellule staminali, necessarie per sostituire con nuove cellule differenziate le cellule perdute quotidianamente durante tutta la vita dell individuo. Oggi è stato dimostrato, in modo incontrovertibile, che cellule staminali sono presenti in molti organi e tessuti, tra cui il cervello (Reynolds, 1992), muscolo scheletrico (Quinn, 1984) e cuore (Beltrami, 2001). In genere, vi è un numero molto esiguo di cellule staminali in ogni tessuto, che si mantiene però stabile nel numero e nella qualità grazie alla particolare divisione cellulare delle cellule staminali la cosiddetta divisione asimmetrica. Quando una cellula si divide dà luogo, normalmente, a due cellule figlie identiche (divisione simmetrica). Nella divisione asimmetrica, invece, le cellule staminali generano una cellula identica alla cellula madre ed una più differenziata (progenitore di transito) capace di un numero limitato di cicli prima di dare origine a cellule mature del tessuto. In tal modo, indipendentemente dal numero di cicli asimmetrici compiuti, il numero di cellule staminali così generate rimane costante (Dominici, 2006) (FIG 1.2). 11

12 Introduzione CS Fig.1.2 Divisione asimmetrica CS CS Cellule progenitrici epatiche Nel fegato, l esistenza di cellule staminali era già stata postulata alla fine degli anni 50 quando Wilson e Leduc ebbero l impressione che le cellule dei colangioli distali dei dotti biliari fossero responsabili del ripristino della massa epatica di roditori dopo danno indotto mediante alterazioni nutrizionali (Leduc, 1954). Il primo studio che dimostra l'esistenza di piccole cellule epiteliali indifferenziate nel fegato adulto è stato effettuato da Farber (Farber, 1956), che trattò ratti con diverse sostanze cancerogene, come etionina e 2- e 3-metil-4- dimetilaminobenzene. In questi studi, Farber notò la proliferazione di cellule epiteliali poste nella regione periportale caratterizzate da scarso citoplasma basofilo e dal nucleo di forma ovale, alle quali diede la definizione di cellule ovali. Ulteriori evidenze bibliografiche di queste cellule si trovarono poi nel 1978 in uno studio effettuato da Shinozuka circa la risposta istologica ad una dieta deficiente in colina somministrata a ratti (Shinozuka., 1978). Le cellule progenitrici epatiche sono cellule staminali bi-potenti presenti sia nell uomo che negli animali capaci di differenziare in epatociti o colangiociti (cellule dei dotti biliari) in seguito a stimolo differenziativo adeguato (Libbrecht., 2002; Roskams, 2003). In particolare queste cellule intervengono quando la normale proliferazione degli epatociti è bloccata, 12

13 Introduzione condizione che si verifica in alcune patologie od in seguito alla somministrazione di sostanze tossiche. Tali cellule risiedono nei Canali di Hering che rappresentano la più piccola e periferica diramazione dell albero biliare, che mette in comunicazione i canalicoli biliari localizzati tra le superfici cellulari di due epatociti adiacenti con i dotti biliari interlobulari (Alison, 1996; Roskams, 2004). I canali di Hering possono quindi essere considerati a tutti gli effetti il collegamento anatomico e fisiologico tra gli epatociti ed il sistema biliare (Fig. 1.3). Fig. 1.3 Localizzazione delle principali cellule epatiche (da Gaudio, 2009) All analisi istologica le cellule progenitrici epatiche sono difficili da identificare esclusivamente dalla loro morfologia, mentre sono individuabili utilizzando specifici marcatori immunoistochimici tipici di epatociti e colangiociti maturi. Le cellule progenitrici epatiche risultano, infatti, positive alla marcatura con citocheratine (CK), in particolare CK7 e CK19, filamenti intermedi del citoscheletro presenti anche nei colangiociti; albumina e CK8 tipici invece degli epatociti maturi; alfa-fetoproteina tipica degli epatoblasti e CD133 e c-kit tipici marcatori delle cellule staminali ematopoietiche (Mancino, 2007; Shafritz, 2006). La presenza nelle cellule progenitrici epatiche di caratteristiche proprie delle cellule ematopoietiche midollari ha fatto emergere l ipotesi, non ancora confermata, che queste cellule possano derivare da cellule circolanti di origine midollare, ma al 13

14 Introduzione momento la loro origine non è ancora stata identificata con chiarezza (Petersen, 1999; Oh, 2007). Non del tutto chiaro e definito risulta essere anche il pattern di marcatori delle cellule progenitrici epatiche, che rimane ancora molto controverso. Tale considerazione potrebbe far pensare all esistenza di un pool eterogeneo di cellule diverse tra loro (Lowes, 2003) La risposta duttulare Come abbiamo visto, quando il danno epatico è tale da compromettere le capacità rigenerative degli stessi epatociti, viene attivato il compartimento di cellule staminali allocato a livello dei Canali di Hering, fisiologicamente presenti in stato quiescente (Alison, 1996). Questa risposta, chiamata risposta delle cellule ovali o nell uomo reazione duttulare, si esprime sia in un aumento della popolazione biliare che nella differenziazione epatocitaria (Gordon, 2000a; Gordon, 2000b). La risposta delle cellule ovali si può dividere in 4 fasi: attivazione, proliferazione, migrazione e differenziamento (Erker, 2008). Molteplici tipi cellulari sono presenti durante l'attivazione delle cellule progenitrici epatiche tra cui cellule epiteliali, ematopoietiche e mesenchimali. Ancora non è ben noto il pattern di informazioni molecolari coinvolte, né i tipi cellulari responsabili della secrezione e della ricezione di tali segnali. I segnali molecolari che fanno partire la cascata di attivazione delle cellule ovali possono agire sia direttamente, agendo sulla loro proliferazione, sia indirettamente tramite la stimolazione di cellule non endoteliali che a loro volta inviano segnali molecolari alle cellule progenitrici epatiche bersaglio. Sarà quindi indispensabile che gli studi futuri, oltre a descrivere la tipologia cellulare coinvolta nell attivazione delle cellule progenitrici epatiche, siano mirati ad esaminare i segnali molecolari coinvolti e la sequenza temporale con cui vengono inviati. 14

15 Introduzione In seguito all attivazione, le cellule ovali proliferano nella regione periportale e con la progressione del danno epatico migrano infiltrandosi nel parenchima lungo i canalicoli biliari. La differenziazione delle cellule progenitrici epatiche verso epatociti maturi o colangiociti è caratterizzata dalla comparsa di cellule con fenotipo intermedio, che rappresentano una trans-amplificazione della popolazione. In particolare, durante la differenziazione verso epatociti maturi, i progenitori danno luogo a epatociti intermedi, cellule poligonali con una dimensione intermedia tra quella delle cellule progenitrici epatiche e degli epatociti maturi e allo stesso modo, la differenziazione verso colangiociti determina la comparsa di colangiociti immaturi dalle caratteristiche istologiche intermedie. La maturazione delle cellule progenitrici epatiche verso la linea colangiocitaria potrebbe avvenire attraverso la differenziazione in piccoli e poi grandi colangiociti, che passano dal canale di Hering fino ai dotti biliari più grandi. Tali evidenze sono state riscontate solo nei roditori (Roskams, 2003; Mancino, 2007; Roskams, 2006; Paku, 2004). 1.3 Modelli animali di attivazione delle cellule progenitrici epatiche Wilson e Leduc (Leduc, 1958) furono i primi a descrivere l'attivazione di un compartimento di cellule staminali nel topo, dopo gravi lesioni indotte tramite la dieta. Successivamente, sono stati descritti vari modelli della cosiddetta "reazione delle cellule ovali" nei roditori. Questi modelli utilizzano principalmente potenziali agenti cancerogeni per inibire la proliferazione degli epatociti maturi seguiti dall induzione di un danno che stimola la rigenerazione. I principali metodi utilizzati per indurre la proliferazione delle cellule ovali negli animali sono: Dieta modificata deficiente in colina e con l aggiunta di etionina nell acqua di abbeveraggio (choline-deficient, ethionine-supplemented-cde diet) (Akhurst, 2001). Le cellule ovali appaiono circa al terzo giorno per poi espandersi 15

16 Introduzione rapidamente fino al 14 giorno di trattamento arrivando ad un plateau. Questo protocollo è tra i più utilizzati nel ratto e nel topo negli ultimi anni. somministrazione di 2-acetylaminofluorene (AAF), retrorsina oppure Monocrotalina seguita da stimoli mitogeni quali epatectomia parziale (PHx) o danno con epatotossine (come il tetracloruro di carbonio (CCl 4 ) e alcool allilico). L AAF (Alison, 1998), retrorsina (Laconi, 1999) e Monocrotalina (Song, 2004) vengono convertiti in metaboliti attivi con attività citotossica e antiproliferativa dal citocromo p450, tipico degli epatociti maturi. La bassa espressione del citocromo da parte delle cellule ovali le rende resistenti a questo effetto tossico e sono quindi in grado di proliferare. Il forte stimolo proliferativo indotto dall epatectomia o dalle epatotossine induce la proliferazione delle cellule ovali entro le 48 ore successive all intervento (Arai, 2004). somministrazione di 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-diidro-collidina (DCC) da 3 a 6 settimane. Gli eventi principali sono apoptosi e necrosi degli epatociti e in 3-4 settimane dopo l'inizio del trattamento si evidenzia il picco della proliferazione delle cellule ovali (Preisegger, 1999). Modelli animali di malattia del fegato grasso, come Ob/Ob-mice o PARP1 mice (- /-) sono caratterizzati da inibizione della replicazione degli epatociti maturi, causata dallo stress ossidativo, e mostrano un elevatissima risposta delle cellule ovali. (Roskams, 2003 Yang, 2004). 1.4 Cellule progenitrici epatiche nelle patologie del fegato umano La reazione duttulare ha una importante rilevanza clinica per la sua frequente comparsa in diverse malattie del fegato nell uomo. Quasi tutte le patologie epatiche sono infatti caratterizzate da un certo grado di danno, perdita o compromissione della rigenerazione degli epatociti e/o delle vie biliari a cui consegue l'attivazione delle cellule progenitrici epatiche. Tale attivazione viene descritta in varie condizioni tra cui insufficienza epatica fulminante, epatiti croniche virali, epatopatie alcoliche, steatosi epatica non alcolica, colangiopatie e patologie epatiche di natura 16

17 Introduzione ereditaria (Roskams, 1991, Roskams, 2003, Roskams, 2003a,; Falkowski, 2003; Roskams, 2003). La significativa attivazione delle cellule progenitrici epatiche che si osserva nelle fasi avanzate della maggior parte delle malattie epatiche croniche nell uomo può essere probabilmente ricondotto ad una progressiva perdita della capacità proliferativa degli epatociti per l accorciamento dei telomeri determinata dai molti anni o decenni di malattia (Wiemann, 2002; Marshall, 2005). Nelle patologie acute, invece, l importante proliferazione del comparto progenitore può essere ricondotta alla massiva necrosi degli epatociti e alla conseguente riparazione del danno mediante attivazione delle cellule progenitrici (Katoonizadeh, 2006). Tipicamente, l'attivazione delle cellule progenitrici epatiche correla positivamente con i parametri clinici di gravità della malattia, come il MELD ed il grado di fibrosi e può influenzare la prognosi di questa condizione patologica (Katoonizadeh ; 2006 Libbrecht, 2000). Esistono inoltre alcune malattie del fegato nelle quali l'attivazione delle cellule progenitrici epatiche non ha luogo. È il caso, ad esempio, dell ostruzione biliare extraepatica più comunemente causata da calcoli biliari. La proliferazione dei dotti che si verifica in questa condizione è fondamentalmente diversa dalla reazione dei dotti in altre malattie del fegato, in quanto è il risultato della proliferazione dei colangiociti maturi, senza il coinvolgimento delle cellule progenitrici. Al contrario, una partecipazione di primo piano delle cellule progenitrici epatiche è stata descritta in malattie croniche delle vie biliari come la cirrosi biliare primaria, anche se sono disponibili poche evidenze per quanto riguarda il loro ruolo durante l'evoluzione clinica e patologica di questa malattia (Roskams 2003). 17

18 Introduzione 1.5 Il microambiente Il microambiente cellulare può essere definito come l insieme dei componenti cellulari e molecolari che interagiscono con la cellula al fine di mantenerne l omeostasi. Il ruolo fondamentale svolto dal microambiente viene dimostrato, ad esempio nel fegato, dall osservazione che gli epatociti, che hanno un enorme potenziale di crescita in vivo, sono molto difficili da mantenere vitali e differenziati quando isolati e messi in coltura, a sottolineare l importanza delle cellule e dell ambiente extracellulare che li circonda fisiologicamente La nicchia staminale Il microambiente assume un ulteriore importanza quando si parla di cellule staminali o progenitrici. Per tale motivo si parla di nicchia staminale, che viene definita come il microambiente cellulare ed extracellulare che sostiene le cellule staminali e contribuisce a mantenere la loro capacità di auto-rinnovamento (Moore, 2006). La nicchia staminale gioca un ruolo fondamentale per mantenere lo stato di quiescenza, ma è in grado di fornire segnali di attivazione e proliferazione in caso di necessità (Zhang, 2008; Naveiras, 2006; Crosnier, 2006). Nel fegato, la nicchia delle cellule progenitrici epatiche si trova a livello dei canali di Hering e si compone di numerose cellule diverse, quali miofibroblasti e cellule stellate epatiche, cellule endoteliali, epatociti, colangiociti, cellule di Kupffer e cellule infiammatorie. Tutte queste cellule interagiscono tra loro e con le cellule progenitrici epatiche influenzandone i processi proliferativi e differenziativi attraverso numerosi segnali all'interno della nicchia (Alison, 2009). Di seguito vengono riportate le caratteristiche di due popolazioni cellulari indispensabili nella nicchia staminale delle cellule progenitrici epatiche: le cellule stellate e le cellule di Kupffer. 18

19 Introduzione Cellule stellate Le cellule stellate epatiche nel fegato normale costituiscono circa 1/3 della popolazione cellulare non parenchimale del fegato e rappresentano il 5-8% dell intera popolazione cellulare epatica (Geerts, 2001). Esse si localizzano a livello dello spazio perisinusiodale noto come spazio di Disse, a stretto contatto con gli epatociti e le cellule endoteliali che delimitano il sinusoide epatico. Ogni cellula presenta lunghe estroflessioni che si estendono dal corpo cellulare e avvolgono i sinusoidi, da qui il loro nome di cellule stellate. La principale caratteristica morfologica delle cellule stellate nel fegato normale è la presenza di goccioline lipidiche citoplasmatiche contenenti vitamina A, sotto forma di retinolo palmitato. Nel fegato normale, le cellule stellate sono descritte come in uno stato di quiescenza. In caso di danno epatico invece le cellule passano ad uno stato attivato caratterizzato da proliferazione cellulare, trasformazione in miofibroblasti con conseguente acquisizione di facoltà contrattili e la successiva chemiotassi. La quantità di vitamina A diminuisce progressivamente e inizia la sintesi e deposito di matrice extracellulare, responsabile della fibrosi e della cirrosi nel lungo termine. Le cellule stellate sono, infatti, la principale fonte cellulare epatica per la produzione di proteine della matrice extracellulare, come il collagene di tipo I, III e IV. Recenti studi hanno però sottolineato il ruolo importante che possono avere cellule estranee al fegato, quali le cellule staminali del midollo osseo (Russo, 2006). È ormai chiaro che vi è uno stretto scambio molecolare tra le cellule progenitrici e le cellule stellate epatiche (Santoni-Rugiu, 2005; Kuwahara, 2008; Sanchez-Munoz 2007). Le cellule stellate sono una fonte importante di fattori di crescita, come il TGFα (Transforming Growth Factor alpha) e l HGF (Hepatocyte Growth Factor). Le cellule progenitrici possono essere direttamente responsabili dell'attivazione delle cellule stellate o, viceversa, le cellule stellate attivate potrebbero favorire l'espansione delle progenitrici e guidare la loro differenziazione. Un recente studio su modelli animali di Van Hul (Van Hul, 2009) sembra indicare che le cellule progenitrici epatiche necessitino di una matrice di sostegno, presumibilmente rappresentata da miofibroblasti/cellule stellate, per la migrazione e l'ancoraggio, al 19

20 Introduzione fine di differenziare e ripopolare il fegato danneggiato. Questa osservazione rafforza l'ipotesi di un ruolo fondamentale della nicchia staminale nella proliferazione e differenziazione delle cellule progenitrici Cellule di Kupffer Le cellule di Kupffer costituiscono il 15% circa di tutte le cellule del fegato e si trovano ancorate ai sinusoidi. Sono cellule appartenenti al sistema monocitico/macrofagico ed il loro sviluppo inizia nel midollo osseo, con la genesi di promonociti e monoblasti e con la successiva maturazione in monociti del sangue periferico, completando la loro differenziazione in cellule di Kupffer una volta localizzati all interno del fegato (Gale, 1978; Naito, 1997). Le cellule di Kupffer risiedendo all'interno del lume dei sinusoidi del fegato, sono le prime cellule ad essere esposte al materiale assorbito dal tratto gastrointestinale (Mrass, 2006). Sono dotate di potere fagocitario verso elementi estranei come batteri e virus e fungono da cellule presentanti l antigene. Sono inoltre in grado di sintetizzare varie sostanze, tra cui citochine, ossido di azoto e intermedi reattivi dell'ossigeno. Questi fattori oltre ad autoregolare le stesse cellule di Kupffer, modulano l azione di altre cellule immunitarie e delle cellule epatiche (Seki, 2000). Le cellule di Kupffer sono, infatti, coinvolte nella patogenesi del danno epatico attraverso il rilascio di sostanze biologicamente attive che svolgono un ruolo chiave nella modulazione delle altre cellule. Le cellule di Kupffer attivate in seguito a contatto con sostanze pro-infiammatorie, come l LPS o prodotti batterici, secernono citochine pro-infiammatorie (TNF-α, IFN-α), chemochine (MCP-I, IL-8) e specie reattive dell'ossigeno e dell azoto che contribuiscono al danno epatico. In particolare, le cellule di Kupffer secernono chemochine per richiamare cellule infiammatorie circolanti e citochine quali l interleuchina-6 (IL6) e TNF-α, che attivano le cellule stellate che a loro volta secernono fattori di attivazione per gli epatociti ed in alcuni casi per le cellule progenitrici epatiche. In seguito a danno epatico le cellule di Kupffer sono inoltre responsabili dell attivazione di una 20

21 Introduzione risposta profibrogenica attraverso la produzione di TGF-β, metalloproteinasi della matrice, PDGF (piastrine-derived growth factor) e ROS (Tacke, 2009). L'attivazione sembra essere necessaria per il normale funzionamento fisiologico del fegato, come la rimozione o la tolleranza agli agenti patogeni, come pure in corso di danno epatico acuto (Wick, 2002) Comprendere il ruolo delle cellule di Kupffer in queste risposte diverse è una chiave per comprendere i meccanismi della fisiologia e patologia del fegato Infiammazione e rigenerazione La rigenerazione epatica è un processo molto complesso, che è accompagnato da una rete altamente controllata di segnali che comprende comunicazione intercellulare e intracellulare (FIG 1.4). Fig. 1.4 Complessa rete di segnali molecolari tra epatociti (HPC), cellule di Kupffer (KC), cellule ovali (OC) e cellule stellate (HSC) durante un danno epatico e conseguente rigenerazione (da Lowes, 2003) Le lesioni al fegato provocano cambiamenti significativi dell espressione e dell'attività di una serie di mediatori del segnale prodotti dalle cellule epatiche e 21

22 Introduzione delle cellule infiammatorie endogene (cellule di Kupffer) ed esogene (linfociti e cellule dell immunità innata). Tali segnali possono avere effetti opposti sulle cellule implicate nella rigenerazione quali gli epatociti e le cellule progenitrici epatiche. Uno dei temi emergenti, infatti, circa l attivazione delle cellule progenitrici epatiche è che le citochine infiammatorie hanno effetti opposti sugli epatociti e sulle cellule progenitrici Interferon gamma (IFNγ) L'IFN-γ viene liberato dalle cellule Natural Killer e dai linfociti T e ha come bersaglio gli stessi linfociti T, i linfociti B e i macrofagi; l' IFN-α viene liberato dai linfociti T e B ed agisce sulle cellule normali con azione antivirale. Diverse linee di ricerca hanno dimostrato l'importanza dell interferone gamma nel processo di attivazione delle cellule ovali. Topi transgenici con deficit di IFNγ hanno dimostrato avere una risposta delle cellule ovali attenuata (Sun, 2004). Al contrario, l'aggiunta di IFNγ e TNF (Tumor Necrosis Factor), fattori di crescita presenti anche durante lo sviluppo del fegato, determina l arresto della proliferazione degli epatociti in coltura, ma promuove l attivazione delle cellule ovali (Brooling, 2005) Tumor necrosis factor (TNFα) Il fattore di necrosi tumorale α (TNF α) è il principale iniziatore della risposta infiammatoria, agisce sui vasi della zona colpita aumentando la permeabilità vascolare, facilitando la fuoriuscita verso la zona dell'immunoglobuline, dei fattori del complemento, dei fattori chemiottatici, ecc. A livello epatico è stato dimostrato che l'inibizione del TNF indotta mediante somministrazione di desametasone inibisce totalmente la proliferazione delle cellule ovali in seguito a danno da AAF seguito da epatectomia parziale (Nagy 1998). 22

23 Introduzione Inoltre, studi in vitro hanno dimostrato che il TNF stimola la proliferazione di una linea cellulare immortalizzata di cellule ovali di origine murina (LE/6). Questi studi hanno sottolineato l'importanza della famiglia del TNF nella attivazione delle cellule ovali. Anche se una parte della produzione del TNF può essere attribuito alla infiltrazione di cellule infiammatorie, la maggior parte del TNF epatico prodotto durante la rigenerazione del fegato è derivante dalle cellule di Kupffer Transforming growth factor β (TGF β) Il TGF β è una molecola multifunzionale che svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo embrionale, nella genesi dei tumori, nella guarigione delle soluzioni di continuo, nei processi fibrotici e di recente è stata dimostrata anche un'attività immunoregolatrice di tale citochina. Il TGF β svolge nei processi infiammatori un'attività chemotattica per i monociti in un primo stadio, mentre in una fase successiva attiverebbe le stesse cellule per il rilascio di altri mediatori. A livello epatico è riportato che il TGFβ ha un effetto regolatore differenziale sugli epatociti maturi e sulle cellule ovali. Il TGFβ è, infatti, in grado di indurre l'apoptosi negli epatociti maturi, ma non sulle cellule ovali o sull epitelio biliare (Jung, 2008) Interleuchina 6 (IL-6) L IL-6 viene liberata da linfociti e macrofagi ed agisce sugli stessi linfocit T e linfociti B determinandone l attivazione. A livello epatico essa sembra regolare l'attivazione e la proliferazione delle cellule ovali, funzione evidenziata in topi knock-out per l IL-6 i quali mostrano una ridotta attivazione delle cellule progenitrici in risposta ad una dieta carente di colina (Matthews, 2004). Gli stessi dati sono stati confermati dopo aver somministrato desametasone in topi sottoposti ad epatectomia parziale (Nagy, 1998). 23

24 Introduzione 1.7 Infiammazione e cancerogenesi L infiammazione gioca un ruolo indispensabile nella rigenerazione epatica e più in generale nella risposta a danno epatico, ma è oramai noto che vi sono altri risvolti. L'infiammazione cronica è alla base di processi patologici per la maggior parte delle neoplasie umane. (Balkwill, 2001). Circa il 25% delle neoplasie sembra essere associato ad uno stato di infiammazione cronica in quasi tutti i distretti corporei (Perwez Hussain, 2007). Il ruolo dell'infiammazione nella cancerogenesi è stato per la prima volta proposto da Rudolf Virchow nel 1863, quando notò la presenza di leucociti nei tessuti neoplastici. Da quelle prime osservazioni molti altri studi hanno accumulato dati a sostegno della teoria che i tumori possono avere origine presso i siti di infezione o infiammazione cronica (Mueller, 2004). Infatti, nonostante la risposta infiammatoria sia una forma di difesa contro le infezioni o le lesioni e sia soprattutto un processo autolimitante, la risoluzione inadeguata di una risposta infiammatoria spesso conduce a varie malattie croniche tra cui potenzialmente anche il cancro (Jackson, 2006; Schottenfeld, 2006). Ad esempio, lo sviluppo di carcinomi dello stomaco, del fegato, della colecisti, della prostata e del pancreas è stata attribuita a infiammazione gastrica indotta da Helicobacter pylori, epatite cronica, colecistite, atrofia infiammatoria della prostata e pancreatite cronica, rispettivamente (Schottenfeld, 2006; Matsuzaki, 2007; Philpott, 2004). L'infiammazione cronica è coinvolta in tutte le fasi della carcinogenesi. L infiammazione agisce, infatti, come un fattore regolatore nell iniziazione determinando instabilità genomica causata dall eccessiva produzione di ROS (Perwez Hussain, 2007, Lu, 2006). L infiammazione agisce poi come regolatore fondamentale della promozione e progressione del tumore tramite diversi meccanismi tra cui l'accelerazione del ciclo cellulare e quindi della proliferazione cellulare, l'evasione dalla morte cellulare programmata o apoptosi e la stimolazione della neovascolarizzazione tumorale (Philip, 2004; Surh, 2001). Tra i principali attori molecolari coinvolti nell asse infiammazione-cancro, si annoverano citochine, chemochine, prostaglandine e NO. 24

25 Introduzione 1.8 Cellule staminali tumorali È noto che il cancro si sviluppa a partire da tessuti normali attraverso l'accumulo di alterazioni genetiche che agiscono di concerto per conferire fenotipi maligni. Ad oggi si conoscono molti geni che quando mutati sono responsabili della formazione e della progressione di tumori ma ancora non c è certezza per la maggior parte dei tumori umani circa l identità della popolazione cellulare che subisce tali eventi genetici. Le cellule differenziate, a lungo imputate come origine della massa tumorale presenterebbero delle caratteristiche incompatibili con tale ruolo. Ad esempio, le cellule differenziate, specialmente in alcuni distretti corporei come gli epiteli, raramente proliferano e vengono rapidamente sostituite, di conseguenza la probabilità che in una singola cellula si accumulino una serie di mutazioni necessarie per la formazione di un tumore è molto bassa. Inoltre, la maggior parte dei tumori sono eterogenei, composti da cellule che mostrano diversi gradi di differenziazione e di trasformazione, che rende difficile capire come una cellula ben differenziata sia in grado di dare luogo a molteplici tipi di cellule meno differenziate, anche considerando la possibilità che il processo di trasformazione induce un certo grado di dedifferenziamento. Al fine di spiegare queste incoerenze, negli ultimi anni si sta sempre più affermando la teoria delle Cancer Stem Cell (CSC), secondo la quale le cellule staminali sono ritenute all origine del processo neoplastico, date le proprie caratteristiche di self renewing illimitato e la loro emivita, superiore rispetto a tutte le altre cellule differenziate (Fig. 1.5). 25

26 Introduzione Fig. 1.5 Teorie sulla cancerogenesi. a) Teoria classica secondo la quale la massa tumorale nasce da cellule differenziate; b) Teoria delle cellule staminali tumorali (CSC) L implicazione più importante di questa teoria è la possibilità di sviluppare una terapia antiblastica che vada a colpire direttamente le cellule staminali alla base dello sviluppo neoplastico. Infatti, l inefficace targeting verso questa popolazione di cellule all'interno del tumore spiega fallimenti terapeutici e la ricorrenza di malattia (Al-Hajj, 2004). La maggior parte degli agenti chemioterapici citotossici presenta infatti come bersaglio le cellule in rapida proliferazione, suggerendo che le cellule staminali del cancro possono sopravvivere a tali trattamenti grazie al loro tasso di proliferazione molto più lento. Alcune importanti evidenze sperimentali sembrano confermare il coinvolgimento delle cellule ovali nel processo di trasformazione neoplastica anche nell epatocarcinoma, una delle neoplasie più diffuse nel mondo. Nonostante la presenza di cellule ovali durante il processo di carcinogenesi epatico sia ormai stabilita, non si conoscono ancora i meccanismi cellulari e molecolari con cui queste cellule partecipano al processo di trasformazione neoplastica, né la loro interazione con altre cellule tipiche del tessuto epatico (es. cellule stellate, fibroblasti, epatociti, ecc). 26

27 Introduzione 1.9. Dimorfismo fisiopatologico del danno epatico nei due sessi Nell uomo è nota una sostanziale differenza nell incidenza delle malattie epatiche croniche, in particolare dell HCC, nei maschi rispetto alle femmine. Si stima infatti che HCC è 3-5 volte più comune negli uomini che nelle donne (Bosch, 2004) e nell epatocarcinogenesi sperimentale, si sviluppa più frequentemente negli animali di sesso maschile rispetto a quelli di sesso femminile. Alla base di tale differenza si possono ricondurre nella specie umana cause prettamente di tipo sociologico (ad esempio maggior consumo di alcol e diverso stile di vita nell uomo rispetto alla donna) e di tipo fisiologico. La causa fisiologica principale è da ricercare nell azione svolta dagli ormoni sessuali, in particolare gli estrogeni. Il fegato è, infatti, un organo sensibile agli effetti degli estrogeni e le differenze nel livello di ormoni sessuali circolanti e nell espressione epatica dei recettori degli ormoni sessuali (Yokoyama, 2005), si ritiene che sia responsabile del dimorfismo nella fisiopatologia epatica nei due sessi. A questo proposito, numerosi studi sperimentali sono stati condotti per chiarire l'effetto degli ormoni sessuali in corso di danno epatico sia nel miglioramento, sia nel peggioramento della lesione epatica. È noto che gli ormoni estrogeni presentano una potente azione mitogena che favorisce la proliferazione cellulare. Accanto a questo concetto bisogna però considerare anche che il meccanismo responsabile della diversa risposta a stress epatici nei due sessi può essere ricondotto ad una diversa modulazione della risposta infiammatoria. Infatti, sebbene il meccanismo responsabile di un danno epatico è diverso per ogni tipo di stress che lo causa, ci sono meccanismi comuni, quali l'attivazione di processi infiammatori (Kershenobich, 2003), la sovrapproduzione di specie reattive dell'ossigeno (Takeyama, 1992) e le alterazioni del microcircolo (Vollmar, 1996). Inoltre, l'attivazione delle cellule di Kupffer (Tsukamoto, 2002) e l'aumento delle molecole di adesione per i leucociti (Ohki, 1998) sono stati proposti come possibili meccanismi. Gli estrogeni sono in grado di agire sui diversi tipi cellulari del fegato contribuendo a preservare la funzione epatica in condizioni di stress. Queste azioni 27

28 Introduzione comprendono la promozione del processo di rigenerazione degli epatociti, la riduzione delle citochine pro-infiammatorie e del rilascio di radicali dell ossigeno da parte delle cellule di Kupffer, l attenuazione della risposta contrattile e la produzione di collagene da parte delle cellule stellate epatiche, e l up-regulazione della ossido nitrico sintetasi endoteliale (enos) nelle cellule endoteliali (Yokoyama et al, 2005). Tuttavia, il preciso meccanismo responsabile di tali differenze tra maschi e femmine rimane ancora da stabilire con certezza. 28

29 Scopo dello studio 2. SCOPO DELLO STUDIO Obiettivo principale dello studio è stato la valutazione della diversa risposta cellulare, bioumorale e molecolare in topi di entrambi i sessi a danno epatico acuto e cronico, potenzialmente carcinogenico. È stato in particolare analizzato il ruolo delle cellule ovali e del microambiente cellulare e infiammatorio in corso di patologia epatica acuta e cronica e durante lo sviluppo dell epatocarcinoma in modelli in vivo. L analisi è stata condotta valutando la proliferazione delle cellule ovali e delle cellule stellate, valutando l entità della risposta infiammatoria e i valori degli indicatori bioumorali di funzionalità e necrosi epatica. La ricerca si è articolata pertanto nei seguenti punti: Analisi della risposta cellulare e molecolare conseguente all induzione di danno epatico, in animali maschi e femmine; Valutazione della presenza di cellule ovali in modelli murini di patologie epatiche acute, croniche e di natura neoplastica; Valutazione del coinvolgimento di altre cellule quali cellule stellate e cellule di Kupffer nel processo di danno epatico. 29

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31 Materiali e metodi 3. MATERIALI E METODI 3.1 Modelli animali Tutti gli esperimenti con animali sono stati condotti nel rispetto delle normative vigenti (L. 116/92). Per tutta la durata degli esperimenti gli animali hanno avuto libero accesso a cibo ed acqua e sono stati mantenuti a temperatura costante di 20 C e con cicli luce/buio di 12 ore. La stabulazione è stata mantenuta presso lo stabulario semi-barrierato con barriere SPF (Specific Pathogen Free) di Scienze Farmaceutiche dell Università di Padova. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi del ceppo Balb/c Primo esperimento di danno epatico acuto Il primo modello di danno epatico acuto chimicamente indotto è stato allestito al fine di indurre la proliferazione delle cellule ovali in topi Balb/c di 8 settimane all inizio del trattamento e di entrambi i sessi. A tal fine è stato modificato un protocollo classico di induzione che prevede lo stimolo che blocca la proliferazione degli epatociti endogeni, seguito da danno che induce la rigenerazione e quindi la proliferazione delle cellule progenitrici. Il blocco degli epatociti endogeni è stato indotto mediante somministrazione di due dosi da 50 mg/kg in soluzione fisiologica di Monocrotalina (Sigma-Aldrich) mediante iniezione intraperitoneale con intervallo di due settimane tra una dose e l altra. La Monocrotalina è un alcaloide pirrolizidinico derivato da numerose piante del genere Crotalaria che induce il blocco della proliferazione degli epatociti (FIG. 3.1). La Monocrotalina viene biotrasformata a livello epatico mediante ossidasi in 31

32 Materiali e metodi una forma bioattivata (Monocrotaline pirrolo) che agisce come agente alchilante di proteine e DNA interferendo quindi con il ciclo cellulare (Lamé, 2005, Butler, 1970). Fig. 3.1 Struttura chimica della Monocrotalina A 15 giorni dall ultima dose di Monocrotalina è stato indotto danno epatico acuto mediante somministrazione di singola dose di 0,75 ml/kg in olio d oliva di tetracloruro di carbonio (CCl 4, Sigma-Aldrich) mediante iniezione intraperitoneale. Il CCl 4 è un composto sintetico epatotossico che si accumula nel parenchima epatico dove subisce la trasformazione Citocromo P450 dipendente, che determina la formazione di un metabolita altamente reattivo, il radicale libero CCl 3. Questo provoca la perossidazione dei fosfolipidi delle membrane cellulari epatiche con conseguente necrosi a livello della zona III del lobulo epatico. Ne consegue una risposta infiammatoria inizialmente dovuta all attivazione delle cellule di Kupffer che secernono citochine, chemochine ed altri fattori pro-infiammatori, i quali, oltre ad avere effetti citotossici diretti, attraggono ed attivano altri monociti, neutrofili e linfociti dal torrente circolatorio che contribuiscono all instaurarsi del danno epatico. In tutti i gruppi di trattamento gli animali sono stati sacrificati a 24 ore e ad 8 giorni dall induzione del danno. Ad ogni end-point sono stati sacrificati 6 maschi (di cui 4 trattati e 2 controlli sani) e 6 femmine (4 trattate e 2 controlli sani). Tale modello animale di trattamento con Monocrotalina e CCl 4 (gruppo A) è stato confrontato con animali trattati esclusivamente con CCl 4 (Gruppo B) al fine di valutare l effettiva azione di blocco della proliferazione indotto dalla Monocrotalina. Anche in questo caso gli animali sono stati sacrificati a gruppi di 6 32

33 Materiali e metodi animali maschi e 6 femmine (4 trattati e 2 controlli per ogni gruppo) a 24 ore e 8 gironi dal danno. La valutazione di eventuali effetti indotti dalla sola Monocrotalina è stata effettuata su animali maschi e femmine trattati esclusivamente con Monocrotalina e sacrificati a 2 settimane dalla seconda e ultima somministrazione (Gruppo C). Nella Tabella 3.1 sono riassunti i gruppi di trattamento. Al momento del sacrificio tutti gli animali sono stati anestetizzati mediante anestesia gassosa (miscela di ossigeno e fluorene) ed è stato eseguito un prelievo ematico mediante puntura intracardiaca. Gli animali sono stati quindi sacrificati mediante dislocazione cervicale ed è stato prelevato il fegato processato poi per l inclusione in paraffina e le successive analisi istologiche. Tabella 3.1 Sintesi dei gruppi di trattamento del primo esperimento di danno acuto Gruppo Trattamento Sacrificio n trattati n controlli A Monocrotalina + CCl 4 24 ore 8 giorni B CCl 4 24 ore 8 giorni C Monocrotalina 2 dosi 15gg da ultima dose Secondo esperimento di danno epatico acuto Al fine di completare il quadro di progressione del danno e della conseguente riparazione e rigenerazione l esperimento è stato ripetuto in animali maschi e femmine trattati con unica dose di CCl 4 (0.75 ml/kg in olio d oliva) e sacrificati a 48 ore, 5 giorni, 8 giorni e 12 giorni dalla somministrazione. Ad ogni end-point sono stati sacrificati 6 maschi (di cui 4 trattati e 2 controlli sani) e 6 femmine (4 trattate e 2 controlli sani) per un totale di 48 animali. 33