ACIDO IPPURICO, ACIDI o-m-p-metilippurici e CREATININA URINARI in UV Codice Z07510

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1 BIOCHIMICA ACIDO IPPURICO, ACIDI o-m-p-metilippurici e CREATININA URINARI in UV Codice Z07510 La determinazione dell Acido Ippurico urinario viene impiegata per il monitoraggio biologico dei soggetti esposti a Toluene. Infatti il Toluene viene trasformato dall organismo prevalentemente in Acido Benzoico il quale, dopo coniugazione con Glicina, viene eliminato con le urine come Acido Ippurico. (fig.1) Fig. 1 : Biotrasformazione del toluene in vivo La determinazione degli Acidi o-m-p-metilippurici viene impiegata per il monitoraggio biologico dei soggetti esposti a miscele di o-m-p-xilene. Infatti lo Xilene, presente nei formulati commerciali come miscela dei tre isomeri o-m-p, viene trasformato dall organismo in miscela di Acidi o-m-p-metil-benzoici i quali, dopo coniugazione con la Glicina, vengono eliminati come miscela di Acidi o-m-p-metil-ippurici con le urine. (fig. 2) Fig. 2 : Biotrasformazione dello Xilene in vivo EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N 007 Ac. Ippurico/Metilippurici e Creatinina urinari in UV Marzo

2 La creatina (dal greco kreas = carne) o metil-glico-ciamina è un componente del metabolismo intermedio che si forma nel fegato in quantità quasi costante, secondo una reazione che coinvolge gli aminoacidi glicina, arginina e metionina, e successivamente depositata per circa il 95% nei muscoli. La sintesi della creatina avviene a partire dagli aminoacidi glicina e arginina, con il contributo della S-adenosil-metionina e mediante la catalisi operata da alcuni enzimi (amidinotransferasi, metiltransferasi) localizzati a livello epatico, pancreatico e renale. Dopo essere stata fosforilata a fosfocreatina, la molecola viene convertita irreversibilmente e non-enzimaticamente in creatinina e, quindi, escreta con le urine. In tal caso, il turnover di trasformazione della creatina in creatinina è di circa l'1.6% al giorno. La creatina di origine alimentare è contenuta principalmente nella carne, mentre solo in tracce è presente in alcuni vegetali. Nel caso di una dieta priva di creatina, come avviene ad esempio nei soggetti vegetariani, il fabbisogno giornaliero è coperto dalla sola sintesi endogena e l eliminazione urinaria della creatinina risulta molto limitata. Heintz e Pettenkofer evidenziarono nelle urine una sostanza che poi Lieberg confermò essere la creatinina. Sulla base dell osservazione che l escrezione urinaria della creatinina era correlata all entità della massa muscolare, fu ipotizzato che la creatinina fosse un diretto prodotto di metabolizzazione dalla creatina localizzata nei muscoli. Non tutta la creatina somministrata all animale o all uomo si ritrova nelle urine, suggerendo che parte della creatina può essere trattenuta dall organismo a scopi plastici o energetici. 2

3 CARATTERISTICHE DEL METODO Principio del Metodo: L Acido Ippurico, gli Acidi o-m-p-metil-ippurici e la Creatinina vengono analizzati previa diluizione con una soluzione diluente e successiva aggiunta di una soluzione stabilizzante. La soluzione così ottenuta viene iniettata direttamente in HPLC. Recupero del Metodo : 100% Sensibilità del Metodo : 0,2 mg/l CV : Acido Ippurico 3,24% Acidi Metilippurici 3,02% Valori accettabili in soggetti non esposti : Ac. Ippurico: < 1500 mg/l Ac. o-m-p-metilippurici totali: < 1 mg/l Creatinina circa 1000 mg/l Valori accettabili in urine di fine turno : Ac. Ippurico: < 1600 mg/l Ac. o-m-p-metilippurici totali: < 1500 mg/l Range dinamico del metodo : Riferimento: G Ital Med Lav Erg 2002;24:3 Suppl. 0, mg/l Contenuto della confezione : Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a Temperatura Ambiente ( 20 C ). Reagente A Soluzione diluente, 1 x 200 ml Reagente B Soluzione Stabilizzante, 1 x 50 ml Reagente C Standard chimico/sol.test Ippurici, 1 x 10 ml Vedi Avvertenze Reagente D Standard chimico/sol. Test Creatinina, 1 x 10 ml Vedi Avvertenze Reagente M Fase mobile, 4 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale Strumento HPLC isocratico con loop da 50 µl. Detector spettrofotometrico UV/VIS λ=236 nm Registratore di cromatogrammi Autocampionatore. Computer gestionale Modalità per il prelievo urinario: Fase preanalitica All inizio del turno lavorativo settimanale e alla fine del medesimo è consigliato raccogliere 10 ml di urine in una provetta e inviarle al Laboratorio. Centrifugare a 4000 rpm per 5 minuti. Stabile 4 settimane a 2-8 C o 6 mesi a 20 C. 3

4 PROCEDURA PREANALITICA Preparazione della Soluzione Test In una provetta pipettare : 990 µl di Acqua grado HPLC 10 µl di Reagente C Sol. Test Ippurici o 10 µl di Reagente D Sol. Test Creatinina INIEZIONE : Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Verificare che la Sol. Test abbia tempi di ritenzione simili a quelli riportati in fig. 3. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Importante : Questa Soluzione così ottenuta non deve essere usata come calibratore PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Preparazione dei campioni. In provette da centrifuga idonee dispensare in sequenza : Bianco Standard Campione Acqua di grado HPLC 0,02 ml Reagente C Std chimico Ippurici 0,02 ml Reagente D Std chimico Creatinina 0,02 ml Campione 0,02 ml Reagente A Sol. diluente 1,8 ml 1,8 ml 1,8 ml Reagente B Sol. stabilizzante 0,5 ml 0,48 ml 0,5 ml Al vortex per 10 secondi FASE 2 : Centrifugare a rpm per 5 minuti. N.B.: il campione così preparato è stabile 3 giorni a 2-8 C INIEZIONE : Iniettare 50 µl del sovranatante nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma Release N 007 Ac. Ippurico/Metilippurici e Creatinina urinari in UV Marzo

5 ACIDO IPPURICO, ACIDI o-m-p- METIL IPPURICI e CREATININA URINARI - Avvertenze REAGENTE C : STANDARD CHIMICO IPPURICO+ISOMERI/SOLUZIONE TEST Acido IPPURICO Acido o-metil IPPURICO Acido m-metil IPPURICO Acido p-metil IPPURICO mg/l mg/l 500 mg/l 500 mg/l REAGENTE D : STANDARD CHIMICO CREATININA/SOLUZIONE TEST CREATININA mg/l PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO λ GAIN TEMPO DI INTEGRAZIONE 236 nm 0,01 AUFS 10 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ, è tassativo l uso del Metaguard - Guard Column (1 x 3 pz), cod. ZA600MG e del Metasaver Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA6005. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ. Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) e successivamente 30 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Filtrare la fase mobile con pompa da vuoto e filtro idoneo da 0,22 µ o 0,45 µ. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di fase. Con questo kit NON è consigliabile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H 2 O e scaricare. Flussare una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 30 ml di H 2 O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP 50 µl Flusso di lavoro consigliato 1,2 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 80 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 3394 / 3395 / 3396 ATTENUAZIONE 8 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE 5

6 ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z07520 Standard chimico per 4 parametri + Creatinina urinaria 2 x 5 ml Z06016 Calibratore multiparametrico per 6 parametri urinari 4 x 5 ml Z06017 Controllo multiparametrico per 6 parametri urinari- Livello 1 5 x 5 ml Z06018 Controllo multiparametrico per 6 parametri urinari- Livello 2 5 x 5 ml Z06019 Controllo multiparametrico per 6 parametri urinari- Livelli 1,2 2 x 5 x 5 ml ZFM15960E Colonna Analitica Genesis C 18 (150 x 4,6mm -4 um) 1 PZ ZA600MG Metaguard Guard Column 1 x 3 PZ ZA6005 Metasaver Precolumn Filter 0.5 um 1 x 10 PZ S Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 144 PZ 6

7 ACIDO IPPURICO/ACIDI o-m-p- METIL IPPURICI e CREATININA URINARI (Cromatogrammi di riferimento) Fig. 3: Soluzione Test Fig. 4: Campione di urina arricchito R.T Acido Ippurico 1000 mg/l R.T Acido Ippurico 240,00 mg/l R.T Acido o-metilippurico 1000 mg/l R.T Acido o-metilippurico 83,30 mg/l R.T Creatinina 1000 mg/l R.T Creatinina 833,00 mg/l R.T Acidi m-p-metilippurici 1000 mg/l R.T Acidi m-p-metilippurici 79,50 mg/l 7

8 ACIDO IPPURICO/ACIDI o-m-p- METIL IPPURICI e CREATININA URINARI (Cromatogrammi di riferimento) Fig. 5: Controllo liofilo urinario livello 1 Fig. 6: Controllo liofilo urinario livello 2 R.T Acido Ippurico 678,60 mg/l R.T Acido Ippurico 1044,00 mg/l R.T Acido o-metilippurico 33,30 mg/l R.T Acido o-metilippurico 100,00 mg/l R.T Creatinina 583,00 mg/l R.T Creatinina 450,00 mg/l R.T Acidi m-p-metilippurici 68,00 mg/l R.T Acidi m-p-metilippurici 182,00 mg/l 8