PCR (Polymerase chain reaction)

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1 PCR (Polymerase chain reaction) La PCR è un metodo di biologia molecolare che perette di amplificare una regione specifica di DNA mediante cicli ripetuti di replicazione a temperature differenti. E una tecnica molto specifica e sensibile. I principali componenti della PCR sono: - Double strand DNA, che contiene il frammento da amplificare; - Due primers (Forward e Reverse), che determinano l inizio e la fine della regione da amplificare. I primer di solito hanno una lunghezza tra 18 e 25 bp, dovrebbero avere un contenuto di G+C non inferiore al 50-60% e non devono avere una sequenza complementare per evitare che si appaino (dimerizzino) tra loro. Il Forward ha una sequenza identica alla sequenza 5-3 del frammento da amplificare. Il reverse invece, ha una sequenza complementare, cioè è costituito da una sequenza di basi complementari a quelle della sequenza target e con una direzione opposta DNA Polimerasi, che copia la regione da amplificare (si usano le DNA polimerasi di batteri termofili, che sono stabili ad elevate temperature; es. Taq Polimerasi isolata dal batterio Thermofilus aquaticus); - Nucleotidi (dntps deossiribonucleotidi trifosfati), forniscono le basi nucleotidiche per la sintesi di nuovo DNA; - Buffer composto da Tris-HCL, MgCL 2. che fornisce l ambiente chimico ideale per la DNA Polimerasi. Il Tris-HCl tampona il ph della reazione, mentre gli ioni Mg 2+ sono cofattori fondamentali per l attività della polimerasi. Il processo della PCR consta di tre steps principali che vengono ripetuti dalle 30 alle 40 volte, nella stessa provetta attraverso l utilizzo di un termociclatore. 1). Denaturazione del frammento che avviene a C, temperatura in grado di rompere i legami idrogeno che uniscono le due eliche di DNA 2). Ibridazione o Annealing a C: Ciascun primer si appaia all estremità 3 del frammento del DNA stampo, definendo il tratto da amplificare. 3). Estensione a C (Elongation): La temperatura di elongation dipende dalla DNA Polimerasi. Durante l estensione, la Polimerasi sintetizza un nuovo filamento di DNA in direzione 5-3 a partire dall estremità libera del primer appaiato alla sequenza bersaglio. Il risultato sono 2 copie di DNA a doppio filamento. Poiché il DNA sintetizzato ad ogni ciclo funge da stampo per la sintesi del ciclo successivo, la

2 successione dei cicli comporta un aumento esponenziale del numero delle copie di DNA. Il DNA amplificato viene sottoposto a corsa elettroforetica Volt in gel di agarosio. L amplificazione di geni target è definita da tre fasi: Fase esponenziale (tutti i reagenti sono presenti) Fase lineare (alcuni reagenti iniziano a terminare) Plateau (tutti reagenti terminano) Il processo di duplicazione non procede all infinito, esso è limitato da: - Quantità dei primers primers, dntp, MgCl2, Buffer - Attività della Taq polimerasi polimerasi - Reannealing dei filamenti dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti VANTAGGI: - Sensibilità e rapidità - Analisi simultanea di molti campioni - Analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione - Analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o fissato. SVANTAGGI: - Sensibilità (rischio di contaminazioni-falsi positivi) - Efficienza variabile di amplificazione a seconda della sequenza - Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto delle coppie di oligonucleotidi di innesco (primers) Può sintetizzare frammenti relativamente corti (< 5000 bp). - la sintesi è imprecisa e può introdurre errori nella sequenza (la Taq pol non possiede attività 3 ->5 esonucleasica) La PCR può essere utilizzata in un ampia varietà di analisi tra cui: - Genetic fingerprinting (usata in medicina legale) - Test di paternità; - Studi di evoluzione e filogenesi;

3 - Identificazione di malattie ereditarie; - Identificazione di malattie virali; - Clonaggio di un gene; - Analisi di DNA antico; - Genotipizzazione di specifiche mutazioni e polimorfismi. Il campione si sottopone al numero di cicli stabiliti, alla fine della reazione un aliquota si sottopone ad elettroforesi su gel agorosio per verificare: 1. la lunghezza dell amplificato (controllo del peso la lunghezza dell amplificato (controllo del peso molecolare in bp mediante ladder) 2. L assenza di frammenti aspecifici 3. La quantità di amplificato ottenuto (proporzionale all intensità della banda) ELETTROFORESI in gel di Agarosio: L elettroforesi in gel di agarosio consente di separare molecole cariche (DNA, RNA, proteine) grazie all applicazione di un campo elettrico, in base alle dimensioni (500 bp a 2Kb). Il gel funziona da «setaccio molecolare»: le molecole piccole, infatti migrano attraverso l agarosio più velocemente di quelle grandi. A ph neutro, il DNA è carico negativamente grazie alla presenza dei gruppi fosfato; poiché le cariche opposte si attraggono, i frammenti di DNA migrano verso il polo positivo del campo elettrico, quindi il DNA, carico ( ) a ph neutro, migra verso il polo positivo (anodo). Dopo un certo intervallo di tempo si interrompe la corrente elettrica e si esamina la distanza percorsa dai frammenti; per visualizzare il DNA si usa un colorante che diventa fluorescente quando viene esposto alla luce ultravioletta L agarosio è un polisaccaride estratto da un alga marina, costituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6- anidro L-galattosio. L' agarosio è sciolto in opportuno tampone (TBE o TAE) e fatto gelificare su un supporto di vetro o di plastica. Si crea così una matrice gelatinosa, che dipende dalla concentrazione dell agarosio, le cui maglie permettono la separazione di macromolecole a diverso PM. In linea di massima il range di concentrazione varia tra lo 0,3% - 2%.. Le quantità di agarosio e di tampone determinano la porosità del gel, quindi si stabiliscono in base al peso molecolare della banda di DNA attesa. Parametri che influenzano la velocità di migrazione DIMENSIONE DEL DNA Le molecole lineari di dsdna migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi. Le molecole più grandi sono sottoposte a maggiori forze di attrito, e inoltre incontrano maggiore ostacolo nel trovare una via attraverso i pori del gel rispetto alle molecole più piccole. CONCENTRAZIONE DI AGAROSIO NEL GEL la sua concentrazione determina il potere risolutivo del gel. CONFORMAZIONE DEL DNA: un DNA superavvolto, lineare e circolare ha velocità di migrazione diversa anche se di dimensione uguale:

4 - La forma SUPERAVVOLTA corre più veloce perché è più compatta; - La forma CIRCOLARE corre più lenta perché è la più ingombrante e fa più fatica a muoversi all interno dei pori del gel; - La forma LINEARE si colloca a metà (la forma lineare è quella che si ritrova come prodotto nella PCR). VOLTAGGIO APPLICATO_ PRESENZA DI BROMURO DI ETIDIO Colorante fluorescente (intercalante) che si intercala tra le basi planari della doppia elica di DNA. Se esposto a luce ultravioletta diventa fluorescente e permette di visualizzare le bande di DNA che hanno migrato sul gel. La fluorescenza emessa è proporzionale alla quantità del campione. Assorbimento a 254 nm (U.V.) ed emissione nel visibile (590 nm) COMPOSIZIONE (FORZA IONICA) DEL BUFFER Il tampone è una soluzione salina che serve: a condurre la corrente elettrica e a controllare il ph durante l elettroforesi (Tris, che consente il mantenimento di un valore costante di ph della soluzione. A o B sta per acido Borico o Acetico che forniscono l appropriata forza ionica al tampone. EDTA, che chela i cationi divalenti, come il magnesio) Come preparare un gel d agarosio Scioglere l agarosio in polvere in una soluzione tampone a 100 C Aggiungere l etidio di bromuro alla soluzione di agarosio sciolto Versare la soluzione di agarosio, evitando di formare bolle, nella vaschetta per elettroforesi, inserire il pettine per i pozzetti. I pozzetti si formano quando, una volta solidificato il gel, viene tolto il pettine. Lasciare solidificare il gel a temperatura ambiente per circa 15min. Quando è solidificato i gel diventa opaco. Una volta solidificato il gel inserire il supporto con il gel nella vaschetta per elettroforesi, versare il Tampone TBE 1x nella camera di corsa Togliere lentamente il pettine, tenendosi perpendicolare rispetto al gel, senza rompere i pozzetti Caricare i campioni, in un pozzetto laterale caricare il marker di DNA a peso molecolare noto. Chiudere la cameretta Avviare la corsa, applicando il voltaggio.

5 Reverse trascriptase-pcr RT-PCR La reazione di retro-trascrizione (trascrittasi inversa) consente la produzione di cdna ( DNA complementare) a partire da una molecola di mrna (RNA messaggero). L enzima che catalizza questa reazione è la trascrittasi inversa, una DNA polimerasi RNA-dipendente con attività 5-3, identificato inizialmente nei retrovirus eucariotico, AMV avian myeloblastosis virus, M-MuLV Moloney leukemia virus murino ed anche in altri. Il prodotto di retro trascrizione, cdna, può essere in seguito amplificato mediante PCR classica oppure utilizzato per valutare l espressione genica di un gene specifico mediante qrt-pcr (quantitative real time PCR). Prima di retro-trascrivere il cdna, si tratta mrna con DNAse per eliminare ogni tracce di DNA genomico che potrebbe dare falsi positivi. I principali componenti per effettuare una RT-PCR sono: - mrna precedentemente estratto - enzima DNA polimerasi RNA-dipendente, detto comunemente trascrittasi inversa o retrotrascrittasi. - Deossiribonucleotidi trifosfato (dntps). - Soluzione tampone - ioni bivalenti Mg 2+, che fungono da cofattori per la polimerasi. - Oligo dt, sequenze oligonucleotidiche di Timina in grado di legarsi alla coda di polya dell RNA e fungere da innesco per l inizio della retro trascrizione. Real Time PCR La real time-pcr, definita anche quantitative real time-pcr (qrt-pcr), è una tecnica che consente l amplificazione e la quantizzazione in tempo reale del cdna target man mano che esso si forma, e non alla fine della reazione come nella PCR classica. Questa tecnica associa amplificazione e quantizzazione in un unica reazione e si basa sugli stessi steps di una classica PCR. Utilizza marcatori fluorescenti, i quali emettendo un segnale fluorescente permettono Il calcolo della quantità di DNA dei campioni determinando il ciclo della PCR, ciclo soglia (threshold cycle Ct) in cui si osserva un significativo incremento di fluorescenza al di sopra del basale. Il Ct è strettamente correlato al numero di copie iniziali del target quindi un numero iniziale di copie pari al doppio anticipa il Ct di un ciclo; un numero iniziale di copie pari alla metà posticipa il Ct di un ciclo.

6 In una reazione di real-time PCR, la fluorescenza aumenta in proporzione all accumulo dei prodotti di PCR. Il numero dei cicli necessari affinché un campione raggiunga il suo Ct è inversamente proporzionale al numero di copie target presente inizialmente. Per valutare la quantità fluorescenza emessa ad ogni ciclo, è possibile monitorare la reazione di PCR durante la fase esponenziale, dove il primo aumento significativo dei prodotti di PCR correlano con l aumento iniziale del cdna target. Il segnale fluorescente può essere dato da diversi fluorocromi, come il SYBR Green, oppure da sonde, quali le TaqMan. Il SYBR Green è un colorante fluorescente che lega il DNA a doppio filamento. L'eccitazione massima è a 494 nm, mentre l'emissione massima è a 521 nm. L'intensità del segnale emesso aumenta durante il procedere della PCR a causa dell'accumularsi dei prodotti di amplificazione. L'utilizzo delle sonde costituisce un metodo di rivelazione altamente specifico e sensibile. Le sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di interesse, sono marcate con molecole fluorescenti e devono essere disegnate in una regione del DNA compresa tra i due primers, pertanto i prodotti aspecifici della PCR non verranno rivelati. La sonda TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare. La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all interno del frammento amplificato nella reazione di PCR e presenta all estremità 5 un fluoroforo Reporter ed all estremità 3 una molecola Quencher. 5 REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza 3 QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q. L aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati. Nel corso dell amplificazione la sonda viene distrutta mediante idrolisi dall attività esonucleasica 5-3 specifica per il doppio filamento associata alla Taq polimerasi. Questo risulta in un aumento del segnale fluorescente dovuto all abolizione dell effetto di "quenching" che dipende dalla vicinanza. In altre parole una volta legata alla sequenza, la sonda resta lì immobile senza emettere nessun segnale. Quando la polimerasi comincia la fase di estensione del primer, l'attività 5' nucleasica dell'enzima degrada la sonda, questo porta al rilascio del fluorocromo, il quale non essendo più vicino alla molecola "Quencer" emette una fluorescenza, per cui i prodotti di amplificazione sono direttamente proporzionali al segnale di amplificazione. I campioni possono essere quantizzati in modo:

7 - Assoluto: necessita di standard di cui si conosce la concentrazione nota (virus, DNA plasmidico, RNA) Amplificando in parallelo ai campioni a concentrazione non nota gli standard a concentrazione nota a diverse diluizioni, è possibile ottenere una retta di regressione (curva di taratura o curva standard). Conoscendo il valore del Ct, la concentrazione dei campioni non noti si può ricavare interpolazione ponendo il Ct in ordinata e la concentrazione iniziale in ascissa. Il sistema consente di valutare l efficienza di amplificazione mediante tre punti: Slope indica il numero dei cicli che intercorrono tra due diluizioni dello standard che differiscono per 1 log. Coeff. Correlazione (R): esprime le correlazione esistenti tra i diversi segmenti che compongono la retta di regressione. Intercetta nell asse X: definisce il numero di cicli necessari per rilevare una copia di DNA target. - Relativa: la quantificazione viene effettuata paragonando i Ct per determinare il cambiamento di espressione di un gene target in un campione rispetto ad un altro e necessita di controlli endogeni (gene housekeeping) non di una curva standard. Per ogni esperimento di quantificazione relativa è necessario un : target: sequenza di DNA da analizzare calibratore: il campione da usare come riferimento per l analisi comparativa controllo endogeno: un gene espresso costitutivamente in tutti i campioni analizzati, necessario per normalizzare i dati rispetto alla quantità di DNA caricato e a variazioni di efficienza della reazione. COMPONENTI DELLA REAZIONE: 1) DNA target 2) DNA polimerasi 3) Due oligonucleotidi 4) dntps 5) Probe fluorescente Real-Time PCR: applicazioni: - Quantificazione virale - Quantificazione dell espressione genica - Efficacia della terapia farmacologica - Misura dei danni al DNA - Controllo di qualità e validazione dei saggi - Genotyping

8 - Malattia minima residua (MRD) IMMUNOFLUORESCENZA L immunofluorescenza, come l immunoistochimica, è un metodo altamente specifico per la rilevazione di determinati antigeni presenti nel tessuto o nelle cellule da esaminare, mediante l uso di anticorpi specifici. Gli anticorpi monoclonali sono in grado di legarsi solo alla proteina di interesse con elevata specificità. L'interazione anticorpo-antigene è detectabile utilizzando un fluorocromo coniugato all'anticorpo e può essere visualizzata mediante microscopia a fluorescenza. Il fluorocromo consente di visualizzare la distribuzione dell antigene nel campione tramite un microscopio a fluorescenza (per es. microscopi a fluorescenza e confocali). Si distinguono due metodi di IF a seconda che il fluoroforo sia coniugato all'anticorpo primario o secondario: IF diretta: utilizza un singolo anticorpo diretto contro l antigene selezionato (noto come anticorpo primario). L'anticorpo è direttamente coniugato a un fluoroforo. (fluorocromi, ad es. FITC, l'isotiocianato di fluoresceina, TRITC l isotiocianato di tetrametilrodamina) IF indiretta: utilizza due anticorpi. L'anticorpo primario non è coniugato e per la rilevazione si utilizza un anticorpo secondario coniugato al fluoroforo diretto contro l'anticorpo primario. Vantaggi: Rapidità Semplicità Economicità Versatilità Svantaggi : Operatore-dipendenza Lettura interpretativa Tessuti di difficile reperimento Microscopio a fluorescenza

9 Dosaggio immunoenzimatico (ELISA) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), conosciuto anche come dosaggio immunoenzimatico, è una tecnica biochimica utilizzata principalmente in immunologia per rilevare la presenza di un anticorpo o un antigene in un campione. E una tecnica utile anche per quanto riguarda la produzione di anticorpi monoconali nello screening di ibridomi. Sfrutta la capacità delle superfici di plastica di adsorbire quantità piccole ma rivelabili di proteine. Si tratta di un saggio in fase solida effettuato su piastre da micro dosaggio, ogni piastra contiene 96 pozzetti e permette di saggiare contemporaneamente un elevato numero di campioni. I tests ELISA rappresentano un mezzo fondamentale per l industria farmaceutica, con applicazioni nella scoperta di farmaci, negli studi con modelli animali, nei trials clinici. Drug discovery: nelle industrie farmaceutiche più di molecole sono testate di routine con kit ELISA nelle fasi iniziali dello screen per identificare molecole promettenti. Food science industry: i kit ELISA vengono utilizzati per analizzare le tossine nel cibo. Negli ultimi anni l utilizzo della tecnica ELISA si è sempre più diffuso anche nei laboratori di ricerca. In particolare è utilizzata per: - Determinare presenza e concentrazione di un antigene nel campione da testare; - Determinare presenza e concentrazione di un anticorpo nel campione da testare; - Determinare presenza e concentrazione di citochine secrete, sia in vivo nel plasma che in vitro in medium La sensibilità di questa tecnica dipende da 4 fattori: 1. numero di molecole di anticorpo legato alla fase solida; 2. avidità dell anticorpo per l antigene; 3. avidità dell anticorpo detection per l antigene; 4. attività specifica dell anticorpo detection. Limite: informazioni solo sulla presenza/concentrazione di una molecola, ma non sulle sue proprietà biochimiche (es peso molecolare, localizzazione cellulare, ecc). Si possono utilizzare diversi metodi: Metodo Diretto: consente di dosare un antigene. L anticorpo primario che deve essere marcato con un enzima indicatore. Si fa reagire una soluzione di un anticorpo specifico marcato con un antigene ancorato ad una fase solida. Dopo aver lavato, si aggiunge il substrato dell'enzima. In questa tecnica, l'attività enzimatica misurata sarà direttamente proporzionale alla quantità di antigene presente. Metodo Indiretto: Serve per dosare un anticorpo, anziché un antigene. E l anticorpo secondario ad essere coniugato all enzima. Il materiale da dosare (ad es. un siero umano contenente IgG) viene fatto reagire con l apposito antigene legato ad una fase solida. Dopo reazione del siero con l antigene immobilizzato, il materiale che non si è legato viene rimosso mediante lavaggio. Si aggiunge poi un anticorpo con un enzima. Si lava di nuovo e si aggiunge substrato dell enzima: l attività misurata sarà direttamente proporzionale alla quantità di anticorpo specifico presente nel campione analizzato.

10 Caratteristiche: - è veloce ed accurato; - permette di determinare: - la presenza di anticorpi contro l antigene immobilizzato; - la quantità di immunoglobuline presenti, grazie all utilizzo di controlli positivi presenti in concentrazioni note. Metodo competitivo : si fa reagire una quantità nota di antigene marcato con un enzima e una quantità ignota dello stesso antigene libero, con uno specifico anticorpo legato ad una fase solida. Sul sito di legame dell'anticorpo si crea competizione tra l'antigene marcato e quello "freddo", cioè non marcato. Dopo aver lavato il complesso con tampone, si aggiunge il substrato dell'enzima e si misura l'attività enzimatica. In condizioni standard, l'attività enzimatica misurata è proporzionale alla frazione di antigene marcato presente nella miscela. La differenza tra questo valore e quello di un campione in cui si è omesso l'antigene libero rappresenta la misura della concentrazione di antigene nel campione ignoto. Metodo del doppio anticorpo (sandwich): si fa reagire una soluzione ignota di antigene con un anticorpo specifico legato ad una fase solida, si lava e si aggiunge un secondo anticorpo; questo anticorpo dovrà essere policlonale opp monoclonale in grado di legarsi ad un diverso epitopo dell'antigene. Dopo un secondo lavaggio si aggiunge il substrato dell'enzima. L'attività enzimatica dosata in condizioni standard, sarà direttamente proporzionale alla quantità di antigene presente. Caratteristiche: - E una tecnica veloce ed accurata; - utilizzando l antigene purificato (se disponibile) come standard, permette di determinare la quantità assoluta dell antigene nel campione analizzato. - richiede due anticorpi che riconoscono epitopi diversi sull antigene - Questo risultato può essere raggiunto sia utilizzando due anticorpi monoclonali con diversa specificità, o anticorpi policlonali Vantaggi: Elevato grado di specificità Svantaggi: non tutti gli anticorpi possono essere utilizzati Il metodo più utilizzato per la rivelazione dell avvenuto legame antigene anticorpo consiste nella coniugazione dell anticorpo secondario con una molecola che può essere direttamente rivelata. Anticorpi coniugati ad enzimi: vengono utilizzati enzimi in grado di convertire un substrato incolore in un prodotto colorato. - Alkaline phosphatase: per anticorpi coniugati alla fosfatasi alcalina si usa in genere il substrato p- nitrophenylphosphate (pnpp), che sviluppa un intenso colore giallo misurabile a nm. - Peroxidase: per gli anticorpi coniugati alla perossidasi si possono scegliere diversi substrati, tra i più utilizzati: 2,2-azinodiethyl-benzthiazoline sulfonate (ABTS), che sviluppa un colore blu-verde misurabile a nm. o-phenylene diamine (OPD), sviluppa un colore arancio scuro misurabile a 492 nm.

11 Caratteristiche dei substrati: - stabile - sicuro, non tossico - poco costoso Un comune obiettivo che si vuole raggiungere con il test ELISA è quello di stimare la concentrazione di una molecola in una preparazione test. Questo è possibile confrontando la risposta con quella ottenuta con una preparazione standard che contiene concentrazioni note della molecola. Il test viene eseguito diluendo progressivamente sia la preparazione standard (concentrazione nota) sia la preparazione test (concentrazione sconosciuta). Si ottiene una curva standard utilizzata per determinare la concentrazione della molecola nella preparazione test. La quantità di segnale generato dal legame del secondo anticorpo è proporzionale alla quantità di antigene presente nel campione testato. La quantificazione può essere ottenuta generando una curva standard e comparando l attività ottenuta con il campione a quella ottenuta sulla curva standard. Dosaggio immunometrico (CLIA) Chemiluminescent immuno Assay (CLIA) è una tecnica immunoenzimatica di ultima generazione comparsa nei primi anni novanta e permette di determinare la concentrazione di un campione in base alla quantità di luce emessa inseguito ad una reazione chimica, in cui l'antigene o l'anticorpo sono etichettati con una molecola in grado di emettere luce durante la reazione chimica. Questa luce viene utilizzato per misurare la formazione del complesso antigene anticorpo e quindi la quantità all interno del campione in analisi. A differenza dell ELISA, la tecnologia CLIA consente una riduzione dei tempi di analisi (30-45 minuti). CLIA è stato applicato in diversi campi, tra cui il monitoraggio ambientale, diagnosi clinica, sicurezza alimentare e analisi farmaceutica. E una tecnica: - che permette un'analisi selettiva, sensibile, rapida e semplice. - analizzare un numero di campioni maggiore rispetto ad un ELISA - completamente automatizzata, riducendo gli errori operatori dipendente L utilizzo di enzimi che marcano specifici substrati, con elevata attività è una delle caratteristiche di questa tecnologia. I enzimi più utilizzati sono HRP e ALP. Viene utilizzata nella routine di laboratorio per dosaggio di ormoni, marcatori tumorali, diagnosi di malattie autoimmuni etc.

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