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1 Original article Comparison of two different red cell panels for automated detection of irregular antibodies Elisabetta Vitali, Nerina Muffatti, Erminia Ciapponi, Roberto Parolo, Claudio Velati Dipartimento di Medicina Trasfusionale e di Ematologia della Provincia di Sondrio Background. The aim of this study was to compare the sensitivity and specificity of two fully automated column agglutination test (CAT) systems, one employing a 3% screening panel and the other a 0.8% concentration of red cells. Materials and methods. Fifty-four frozen samples, containing 60 known irregular alloantibodies, were tested with an automatic system (AutoVue Ortho CD), both with the 3% and the 0.8% screening panels (Surgiscreen 3% and 0.8%, Ortho CD). The titre of each antibody was determined with specific cells of the two panels. Overall, 2,572 random samples were screened with AutoVue, 1,551 using the 3% screening panel and 1,021 with the 0.8% one. Results. All the known 54 samples reacted with the specific cells of the two panels. The reaction scores were higher with the 0.8 % system in 23 cases (43%) and with the 3% system in 6 cases (11%); in 25 samples (46%) the reaction score was the same with both panels. Fifty antibodies (83%) showed higher titres with the 0.8% cells and 10 (17%) with the 3% ones. Thirty-three of the 1,551 random samples (2.1%) reacted with the 3% panel and 22 out of 1,021 (2.3%) with the 0.8% panel. Thirteen of the 33 (0.8%) and 12 of the 22 (1.2%) positive results were not confirmed. Conclusions. The known antibodies were confirmed in all the samples with both methods. In 83 % of the cases the titre was higher with the 0.8% panel. Received: 18 February Accepted: 29 March 2004 Correspondence: Dott. Claudio Velati Dipartimento di Medicina Trasfusionale e di Ematologia della Provincia di Sondrio Via Stelvio Sondrio - Italy claudio.velati@katamail.com Da oltre un decennio 1 le tecniche di agglutinazione su microcolonna (Column Agglutination Technology, CAT) sono state introdotte nei laboratori di Immunoematologia e hanno progressivamente sostituito le tecniche tradizionali in provetta (Standard Tube Tests, STT) nell'esecuzione routinaria dei test immunoematologici: tipizzazione gruppoematica, test di Coombs Diretto e Indiretto (TCD e TCI) e le ricerche finalizzate all'identificazione anticorpale. Queste metodiche si sono dimostrate più vantaggiose rispetto alle tecniche tradizionali in provetta per la maggiore obiettività della lettura, la possibilità di conservare i risultati più a lungo, l'eliminazione dei classici tre lavaggi nei test all'antiglobulina e, soprattutto, la loro standardizzazione e facilità d'uso 2-5. Le CAT si sono inoltre rivelate più sensibili, rispetto alle STT, in particolare nello screening degli anticorpi irregolari di rilevante significato trasfusionale 6. La successiva introduzione di apparecchiature semiautomatiche e automatiche per l'esecuzione dei test pre-trasfusionali su microcolonna, ha ulteriormente incrementato il livello di standardizzazione di queste procedure 7,8. L'affidabilità e la standardizzazione indotte dalle tecniche di agglutinazione su microcolonna e dal loro utilizzo con sistemi automatici consente di limitare ai casi di effettiva necessità l'impiego di ricerche immunoematologiche tradizionali che, per la necessaria tecnologia manuale, richiedono molto tempo e personale da dedicare. Un tale risultato sarà maggiormente conseguito e sarà, al contempo, maggiormente garantita la necessaria sicurezza della trasfusione se la sensibilità e la specificità delle procedure adottate saranno più elevate. Per il sistema automatico AutoVue (AutoVue System, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA), che già aveva dato risultati affidabili con l'impiego di emazie test alla concentrazione del 3% 9,10 è stato proposto l'utilizzo di emazie test alla concentrazione dello 0,8% al fine di aumentare la sensibilità 125

2 E Vitali et al. The specificity study showed that both panels produced a similar percentage of false positive results. The 0.8% panel revealed higher titres of irregular antibodies, previously identified with the 3% panel, without lowering the specificity of the procedure. Key words: automation, red cell alloantibodies, Column Agglutination Technology Introduction Column agglutination technology (CAT) was introduced in Immunohaematology laboratories over a decade ago 1 and is gradually replacing the standard tube tests (STT) for routine immunohaematological investigations: blood group typing, direct and indirect Coombs' tests (DCT and ICT) and antibody detection. This technology has been demonstrated to have several advantages over traditional test-tube methods: more objective reading of results, the possibility of storing results for longer, elimination of the three classical washes in the antiglobulin tests, but above all, their standardisation and ease of use 2-5. Furthermore, column agglutination tests are more sensitive than STT, particularly in screening for transfusionally relevant irregular antibodies 6. The subsequent introduction of semiautomatic and automatic equipment for carrying out pre-transfusion tests on microcolumns has further raised the level of standardisation of these procedures 7,8. The reliability and standardisation of automated microcolumn agglutination techniques have allowed the traditional immunohaematological methods, which given the manual steps involved are very time-consuming and staff-intensive, to be limited to the few essential cases. This effect could be enhanced and at the same time stronger guarantees of the essential safety of transfusions could be made if the sensitivity and specificity of the procedures were higher. It has been proposed that the AutoVue automatic system (AutoVue System, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA), which already gives reliable results with delle procedure. Scopo di questo lavoro è stato il confronto delle prestazioni del sistema AutoVue, in termini di sensibilità e specificità, nell'impiego routinario dei pannelli eritrocitari alla concentrazione del 3% rispetto a quelli allo 0,8%. Materiali e metodi Nel nostro Centro la ricerca degli anticorpi irregolari anti-emazie nei donatori e nei riceventi viene effettuata, da alcuni anni, con procedura completamente automatica utilizzando il sistema AutoVue e schedine CAT BioVue contenenti siero di Coombs polispecifico della ditta Ortho- Clinical Diagnostics. Per due anni sono stati utilizzati per lo screening pannelli a 3 cellule con una concentrazione al 3 % di emazie. Successivamente e fino ad oggi sono stati utilizzati pannelli, della stessa ditta, ma ad una concentrazione di emazie dello 0,8%. I pannelli allo 0,8% non necessitano dell'aggiunta di LISS, in quanto già presente nella soluzione diluente, ed hanno una scadenza di una settimana più lunga rispetto a quelli al 3%. Preliminarmente all' introduzione in routine dei pannelli allo 0,8%, è stato effettuato uno studio di sensibilità utilizzando 54 campioni congelati a 80 C, 25 di siero e 29 di plasma, che erano risultati precedentemente positivi alla ricerca anticorpale, dimostrando la presenza di 60 anticorpi irregolari (Tabella I). I campioni sono stati scongelati a 37 C e testati su AutoVue utilizzando contemporaneamente il pannello al 3% e il pannello allo 0,8 %. Sono state quindi allestite diluizioni per raddoppio di ciascun campione, che sono state testate in parallelo (con procedura manuale e dallo stesso operatore) con cellule opportunamente scelte dei due pannelli, per la determinazione del titolo anticorpale. Dopo la valutazione dei risultati dello studio di sensibilità è stato impostato uno studio di specificità: campioni di plasma provenienti da donatori e riceventi sono stati sottoposti al test di screening per la ricerca degli anticorpi irregolari su AutoVue. Per campioni è stato utilizzato il pannello Surgiscreen al 3%, mentre per i restanti campioni è stato utilizzato il pannello Surgiscreen allo 0,8%. Sui campioni risultati positivi sono stati quindi effettuati, con procedura manuale, i test per l'identificazione Table I - Red cell antibody specificity of the samples examined Specificity D C E M K c k C w Le a Le b Jk a Jk b Fy a E E C s Tot. Jk b K Jk a D n samples

3 Automated screening for red cell antibodies Table II - Comparison between the scores obtained with the 3% and 0.8% red cell panels. Line A reports the number of samples for which the score resulted higher using the 3% red cell panels, line B reports the number of samples with a higher score using the 0.8% panels and line C the number of cases for which the scores were the same with both panels Specificity D C E M K c k C w Le a Le b Jk a Jk b Fy a E E C s Jk b K Jk a D A (11%) B (43%) C (46%) n samples Table III - Comparison between the titres obtained with the 3% and 0.8% red cell panels. Line A reports the number of antibodies showing a higher titre using 3% red cell panels, line B the number of antibodies with a higher titre using 0.8% panels and line C the number of cases for which the titres were the same with both panels Specificity D C E M K C k C w Le a Le b Jk a Jk b Fy a E C s A 0 B (83%) C (17%) n of antibodies test blood cells at a concentration of 3% 9,10 could be used with test cells at a concentration of 0.8% in order to increase the sensitivity of the procedure. The aim of this study was to compare the performance, in terms of sensitivity and specificity, of the AutoVue system with routine use of red cell panels at concentrations of 3% and 0.8%. Materials and methods For some years now the search for irregular antibodies to donor and recipient red blood cells has been carried out by a completely automated procedure using the AutoVue system and CAT BioVue cards containing polyclonal Coombs' sera from the Ortho-Clinical Diagnostics company. For two years a 3-cell screening panel with a 3% concentration of red blood cells had been used. Subsequently, panels from the same company, but at a blood cell concentration of 0.8% have been used. The 0.8% panels do not require addition of LISS, in that this is already present in the diluting solution and they have a shelf-life that is one week longer than that of the 3% panels. Before introducing 0.8% panels into routine use, we carried out a sensitivity study using 54 samples (25 of serum and 29 of plasma) frozen at 80 C, which had anticorpale (pannello a 11 cellule) e il titolo. L'interpretazione dei risultati sierologici è data dalla lettura automatica dello strumento che utilizza uno score che va da negativo a 4+. Per la lettura visiva dei risultati è stato utilizzato lo stesso score. Risultati Studio di sensibilità. Tutti i 54 campioni analizzati hanno reagito positivamente con le cellule specifiche dei due pannelli. 23 campioni, pari al 43% del totale, hanno dimostrato "scores" di reazione più elevati quando investigati con le emazie allo 0,8%, 6 campioni, pari all'11%, con le emazie al 3 %, mentre in 25 casi, pari al 46%, lo score di reazione è stato lo stesso con i due pannelli. Il confronto tra gli "scores" di reazione, ottenuti con i due pannelli e suddiviso per specificità anticorpale dei campioni testati è rappresentato nella tabella II. Per 50 anticorpi, pari all'83% dei casi, il titolo anticorpale è risultato più elevato con le emazie allo 0,8%, Per 10 anticorpi, pari al 17%, il titolo è risultato uguale con i due tipi di emazie, mentre in nessun caso il titolo è stato maggiore con le emazie del pannello al 3 % (Tabella III). In 7 casi il titolo ottenuto con le emazie allo 0,8 % è stato di almeno due diluizioni più elevato rispetto a quello ottenuto con il pannello al 3%. Studio di specificità. Dei campioni 127

4 E Vitali et al. Table IV - Specificity study results Red cell panel concentration Samples tested Reactive samples Not confirmed samples 3% 1, (2.1%) 13 (0.8%) 0.8% 1, (2.3%) 12 (1.2%) Total 2, previously been found to be positive for 60 irregular antibodies (Table I). The samples were thawed to 37 C and tested on the AutoVue using both the 3.0% and 0.8% panels, simultaneously. Doubling dilutions were then prepared of each sample and these were tested in parallel (with a manual procedure by the same person) with cells appropriately chosen from the two panels, in order to determine the antibody titre. After evaluating the results of the sensitivity study, a specificity analysis was performed: 2,572 plasma samples from donors and recipients underwent an AutoVue screening test to search for irregular antibodies. For 1,551 samples the Surgiscreen 3% panel was used, while the remaining 1,021 samples were tested using the Surgiscreen 0.8% panel. Samples that were positive then underwent manual testing to determine the identity of the antibody (11-cell panel) and its titre. The serological results were interpreted by automatic reading of the instrument, which uses a score from negative to 4+. The same score was applied for the visual reading. Results Sensitivity. All 54 samples analysed reacted positively with specific cells of the two panels. We found that 23 samples (43% of all the samples) showed a higher reaction score when investigated with the 0.8% panel, 6 samples (11%) reacted more strongly with the blood cells at a 3 % concentration, while 25 cases (46%) showed the same reaction score with both panels. Table II presents a comparison of the reaction scores obtained with the two panels, divided according to the antibody specificity of the samples tested. For 50 antibodies (83% of cases), the antibody titre was higher with 0.8% cells, whereas for 10 antibodies (17%) the titre was the same with the two panels of red cells. In no case was the titre higher with the 3% panel (Table III). In 7 cases the titre was measurable with the 0.8 % red cells at least two more dilutions than that possible with the 3% panel. Specificity. of the 1,551 samples tested with the 3 % panel, 33 (2.1%) were found to be positive. Of the 1,021 samples investigated with the 0.8% panel, 22 (2.3%) were indagati con il pannello al 3 %, 33, pari al 2,1% sono risultati positivi. Dei campioni indagati con il pannello allo 0,8% ne sono risultati positivi 22, pari al 2,3%. Il numero di campioni la cui positività non è stata confermata, è stato rispettivamente di 13 (0,8%) per il primo gruppo e di 12 (1,2%) per il secondo gruppo. I risultati dello studio di specificità sono illustrati nella tabella IV. Conclusioni L'utilizzo dei test classici in immunoematologia deve essere considerato un percorso necessario e irrinunciabile in tutti i casi complessi. L'introduzione di procedure automatiche o semi-automatiche a partire dagli anni '60 11,12 ha, però, teso a limitare, nelle procedure routinarie, l'errore "clericale" attraverso una standardizzazione delle metodologie, mentre l'introduzione delle tecniche di agglutinazione su colonna ha reso più sensibili ed affidabili le ricerche immunoematologiche. Uno specifico gruppo di lavoro della ISBT (International Society of Blood Transfusion) ha recentemente prodotto linee guida sulla validazione dei sistemi automatici nel Servizio Trasfusionale nelle quali viene chiaramente indicato che un sistema automatico è considerato critico se il suo uso è direttamente legato al processo decisionale inerente il sangue, la sua lavorazione, i test legati alla sua distribuzione a fini trasfusionali e viene utilizzato per gestire le informazioni correlate ai suddetti processi 13. Lo studio effettuato si inserisce, pertanto, in uno scenario che già vede introdotti l'automazione e il perfezionamento delle tecniche diagnostiche e che vede come obiettivo il miglior abbinamento della sensibilità e della specificità di tecnologie che sono già ad elevati livelli di affidabilità. Lo studio ha evidenziato che tutti gli anticorpi, precedentemente trovati e identificati, sono stati confermati con entrambe le metodiche. La sensibilità del pannello allo 0,8% sembra essere più elevata: infatti nell'83% dei casi il titolo eseguito utilizzando le emazie allo 0,8% è stato maggiore rispetto a quello ottenuto con le emazie al 3 % e in alcuni casi anche di due o più diluizioni. Anche gli score di reazione sono stati più 128

5 Automated screening for red cell antibodies positive. Thirteen samples (0.8%) in the first group and 12 (1.2%) in the second group were not confirmed to be positive. The results of the specificity study are illustrated in table IV. Conclusions Traditional tube tests are essential and unavoidable in all complex cases. Nevertheless, the introduction of automatic and semiautomatic procedures, starting back in the 1960s 11,12 has tended to limit clerical' errors in routine procedures through standardisation of methods, while the development of column agglutination techniques has made immunohaematological research more sensitive and reliable. A working group specifically established by the International Society of Blood Transfusion (ISBT) recently produced guidelines on the validation of automatic systems in Transfusion Services. These guidelines clearly indicated that an automated system is considered critical if its use is directly linked to the decisional processes concerning blood, product processing, the tests associated with issuing components for transfusion or if it is used to manage information related to the above mentioned processes 13. We, therefore, carried out our study in the context of current automated and refined diagnostic techniques with the intention of determining whether the already high levels of reliability of the technology could be combined with greater sensitivity and specificity. This study showed that all the previously found and identified antibodies were detected by both the panels. The 0.8% panel seemed to be more sensitive: in fact, in 83% of the cases, the titre measured using red blood cells at a concentration of 0.8% was higher than that recorded with blood cells at 3 % and in some cases reached two or more dilutions. Furthermore, for an equivalent antigenic dose on the specific cells, the reaction scores were higher with the 0.8% cell concentration. The specificity of the test was not significantly different according to whether the 3% or the 0.8% panel was used. This study does have the limitations of not having been carried out double blind and completely on the same samples. These drawbacks, particularly relevant to the specificity study, could be overcome by evaluating a larger number of samples which would give greater statistical significance to the preliminary observations reported here. elevati con le cellule allo 0,8 % a parità di dose antigenica rappresentata sulle specifiche cellule. I risultati relativi allo studio di specificità non sono significativamente diversi per i campioni testati con il pannello al 3% rispetto a quelli cimentati con il pannello allo 0,8%. Il lavoro, in particolar modo per ciò che concerne lo studio di specificità, presenta il limite di non essere stato effettuato in doppio cieco e integralmente sugli stessi campioni. A ciò può essere posto rimedio con una valutazione su un maggior numero di campioni che potrebbe dare maggior significato statistico alla preliminare osservazione fin qui effettuata. Riassunto Introduzione. Lo scopo dello studio è stato di confrontare la sensibilità e la specificità di due sistemi automatici, entrambi basati su metodiche di agglutinazione su colonna, ma che utilizzano pannelli cellulari con diversa concentrazione di emazie (3% e 0,8%). Materiali e metodi. 54 campioni congelati, contenenti 60 anticorpi irregolari, sono stati testati in parallelo con procedura automatica (Autovue Ortho CD) sia con il pannello di screening di emazie al 3%, sia con il pannello allo 0.8% (Surgiscreen 0,8% e 3% Ortho CD). Il titolo di ciascun campione è stato determinato con specifiche cellule dei due pannelli campioni random sono stati testati con Autovue, utilizzando il pannello al 3% e con il pannello allo 0,8%. Risultati. Tutti i 54 campioni già noti hanno reagito positivamente con le cellule specifiche dei due pannelli. In 23 casi, pari al 43% del totale, gli score di reazione sono stati più alti con il pannello allo 0,8%, in 6 casi (11%) con il pannello al 3% mentre in 25 casi (46%) lo score è stato lo stesso con i due pannelli. Il titolo anticorpale è stato più elevato con le emazie allo 0,8% per 50 anticorpi (83%), con le emazie al 3% per 10 anticorpi (17%). Dei 1551 campioni random esaminati con il pannello al 3%, 33 (2,1%) sono risultati positivi, mentre, dei 1021 esaminati con il pannello allo 0.8%, ne sono risultati positivi 22 (2,3%). I risultati non confermati sono stati rispettivamente 13/33 (0,8%) e 12/22 (1,2%). Conclusioni. Gli anticorpi già noti sono stati confermati in tutti i campioni con i due metodi. Con le cellule allo 0,8% sia gli score, sia i titoli anticorpali si sono rivelati più elevati. Lo studio di specificità non ha dato risultati significativamente diversi per i due sistemi. Parole chiave: automazione, anticorpi antieritrocitari, CAT 129

6 E Vitali et al. References 1) Lapierre Y, Rigal D, Adam J, et al. The gel test: a new way to detect red cell antigen-antibody reactions. Transfusion 1990; 30: ) Reis KJ, Chachowsi R, Cupido A, et al. Column agglutination technology: the antiglobulin test. Transfusion 1993; 33: ) South SF. Antibody screening and direct antiglobulin testing using BioVue column agglutination technology versus standard tube tests. Immunohematology 1993; 9: ) Pinkerton PH, Ward J, Chan R, Coovadia AS. An evaluation of a gel technique for antibody screening compared with conventional tube method. Transfus Med 1993; 3: ) Lamy B, Tissot C, Heyd C, Lamy C. Red cell antibody screening, red cell antibody identification and compatibility testing with the Column Agglutination Technology (CAT). The BioVue system. Transfus Clin Biol 1994; 1: ) Phillips PK, Whitton CM, Lavin F. The use of the antiglobulin "gel test" for antibody detection. Transfus Med 1992; 2: ) Coovadia AS, Armstrong C, Chan R, Pinkerton PH. Assessment of an instrument for automated reagent and specimen dispensing in blood banking. Transfus Sci 1997; 18: ) Screnock D, Polk T, Lindberg A, et al. Comparison of No type determined (NTD) rates between the Olympus PK7200 and PK7100 analyzers (abstract). Transfusion 1997; 37(Suppl): 26S. 9) McNeil C, Helmick WM, Ferrari A. A preliminary investigation into automatic blood grouping. Vox Sang 1963; 8: ) Weisbach V, Ziener A, Zimmermann R, et al. Comparison of the performance of four microtube column agglutination systems in the detection of red cell alloantibodies. Transfusion 1999; 39: ) Morelati F, Revelli N, Maffei LM, et al. Evaluation of a new automated instrument for pretransfusion testing. Transfusion 1998; 38: ) Matte C. Photométrie précise des réactions d agglutination sur plaque. Applications aux hémagglutinations. Rev Fr Transfus 1963; 6: ) ISBT Guidelines for validation and maintaining the validation state of automated systems in blood banking. The ISBT Validation Task Force. Vox Sang 2003; 85 (Suppl.1): S1-S

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