ISTRUZIONI COLONNE IMMUNOAFFINITA PER AFLATOSSINE (WIDE) NEOCOLUMN FOR AFLATOXIN (COD 8043) (rev. 05/08)

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1 ISTRUZIONI COLONNE IMMUNOAFFINITA PER AFLATOSSINE (WIDE) NEOCOLUMN FOR AFLATOXIN (COD 8043) (rev. 05/08) Materiali forniti: 50 colonne d immunoaffinità 1 adattatore per siringa libretto istruzioni Materiali richiesti ma non forniti: Bilancia Macinino Centrifuga o carta da filtro Solventi (grado HPLC) Acqua distillata (grado HPLC) Tampone PBS Acido acetico Serbatoio da siringa in vetro da 50 ml Siringa da 5 ml Kobra cell o altro derivatizzatore post colonna Dati di recupero: Soluzione std 10 ppb di aflatossina B1 recupero 98% Soluzione std 10 ppb di aflatossina B2 recupero 101% Soluzione std 10 ppb di aflatossina G1 recupero 90% Soluzione std 10 ppb di aflatossina G2 recupero 96% Soluzione std 10ppb mix di aflatossine B1 103%; B2 100%; G1 99%; G2 82% Capacità di carico: 100 ng CAMPIONI DI MAIS POSITIVIZZATI A DIVERSI LIVELLI DI B1 1.0 ppb recupero 0.92+/ ppb recupero / ppb recupero 6.52+/-0.12 CAMPIONI DI FICHI POSITIVIZZATI A DIVERSI LIVELLI DI B1: 1.5 ppb recupero 1.43+/ ppb recupero 4.4+/ ppb recupero 7.84+/-0.34 CAMPIONI DI PISTACCHI POSITIVIZZATI A DIVERSI LIVELLI DI AFLATOSSINE TOT: B1 B2 G1 G2 Spike (ppb) Recupero (%) CAMPIONI DI POLVERE DI CURRY POSITIVIZZATI A DIVERSI LIVELLI DI AFLA TOT: B1 B2 G1 G2 Spike (ppb) Recupero (%) Ricetta per tampone PBS: Sciogliere in un litro di acqua: g di NaCl g di KCl g Na2HPO4

2 - 0.2 g KH2HPO4 - Aggiustare il ph a con HCL o NaOH Procedura di decontaminazione: Immergere i materiali che necessitano di essere decontaminati prima e dopo l analisi, in una soluzione di ipoclorito di sodio al 5% per 30 min, quindi per altri 30 min in una soluzione 5% v/v di acetone. Dopo ciò i materiali risultano decontaminati e possono essere lavati con normale procedura. Conservazione: Conservare le colonne tra 2-8 C. Shelf Life 18 mesi dalla produzione Prima di usare controllare che la colonna non si sia asciugata e che sia presente il tampone al di sopra del gel. Tampone di eluizione: Il tampone di eluizione e l eluizione utilizzati dipendono dal metodo utilizzato per la quantificazione dell aflatossina (HPLC o ELISA) QUANTIFICAZIONE per HPLC: L Eluition buffer (EB) usato è MeOH 100% grado HPLC, per ogni colonna sono necessari 2 ml di EB. ELUIZIONE per HPLC: Eluire lentamente (velocità 1-2 gocce per sec.) l aflatossina facendo passare 2 ml di EB in colonna, raccogliere in provetta di vetro ambrata. Far passare altri 2 ml di acqua a grado HPLC alla velocità di 5.0 ml/min, raccogliere completamente l acqua forzando aria nella colonna; raccogliere nella stessa vial utilizzata precedentemente. Volume totale 4 ml QUANTIFICAZIONE per ELISA: L Eluition buffer (EB) usato è MeOH 100% grado HPLC, per ogni colonna sono necessari 7 ml di EB ELUIZIONE per ELISA: Eluire lentamente (velocità 1-2 gocce per sec.) l aflatossina facendo passare 7 ml di EB in colonna, raccogliere in provetta di vetro ambrata. Far passare altri 3 ml di acqua a grado HPLC alla velocità di 5.0 ml/min, raccogliere completamente l acqua forzando aria nella colonna; raccogliere nella stessa vial utilizzata precedentemente. Volume totale 10 ml La soluzione contenuta nella vial ha una concentrazione di MeOH pari al 70%, la soluzione è pronta per essere testata nel saggio ELISA. PROCEDURE DI ESTRAZIONE MAIS, CEREALI E MANGIMI: 1. Macinare il campione finemente (consistenza del caffè macinato) 2. Pesare 50 g di campione macinato e aggiungervi 5 g di NaCl 3. Trasferire il campione con NaCl in un macinino con 100 ml di Metanolo 80% 4. Miscelare ad alta velocità per 1 minuto 6. Aggiungere 40 ml di PBS a 10 ml di campione filtrato 7. Se si osserva del precipitato, filtrare attraverso carta a microfibra di vetro (Whatman GF/A o ) 8. Rimuovere il tappo superiore della colonna e allentare il tappo inferiore 9. Far uscire il tampone di conservazione, riposizionare il tappo inferiore

3 10. Applicare una siringa di vetro da 50 ml alla colonna utilizzando l'adattatore 11. Caricare 20 ml di estratto diluito pari a 2 g del campione originale 12. Rimuovere il tappo inferiore della colonna, se necessario applicare una pressione per iniziare un flusso di 1,5-2 ml /min (o gravità). Assicurarsi che non si formino bolle nella colonna. 14. Rimuovere la siringa di vetro e l'adattatore. Aggiungere 2 ml di MeOH al 25% quindi riattaccare adattatore e siringa. 15. Aggiungere, nella siringa, 20 ml di metanolo 25% rimuovere il tappo all estremità inferiore della colonna e lasciar defluire. ARACHIDI E NOCI: 1. Macinare il campione brevemente (20-30 secondi) fino a ottenere un composto fine, facendo attenzione a evitare che si impasti a causa del rilascio di olio dovuto al riscaldamento 2. Pesare 25 g di campione macinato e aggiungervi 5 g di NaCl. 3. Trasferire il campione con NaCl in un macinino contenente 125 ml di Metanolo al 60% 4. Macinare ad alta velocità per 1 minuto 6. Aggiungere 20 ml di PBS a 20 ml di campione filtrato 7. Se si osserva del precipitato, filtrare attraverso carta a microfibra di vetro (Whatman GF/A ) 8. Rimuovere il tappo superiore e allentare il tappo inferiore della colonna 9. Far uscire il tampone di conservazione, chiudere la colonna con il tappo inferiore 10. Applicare una siringa di vetro da 50 ml alla colonna utilizzando l'adattatore 11. Aggiungere 20 ml del campione diluito in PBS 12. Rimuovere il tappo inferiore se necessario applicare una pressione per iniziare un flusso di 1,5-2 ml /min (o gravità). Assicurarsi che non si formino bolle nella colonna 14. Rimuovere la siringa di vetro e l'adattatore. Aggiungere 2 ml metanolo al 25% quindi riattaccare l adattatore e il serbatoio di vetro. 15. Aggiungere 20 ml di metanolo 25%, al serbatoio in vetro, rimuovere il tappo all estremità inferiore lasciar defluire il lavaggio FICHI E FRUTTA SECCA: 1. Sminuzzare il campione 2. Pesare 25 gr di campione sminuzzato e aggiungervi 5 g di NaCl 3. Trasferire il campione con NaCl in un macinino con 125 ml di Metanolo /bicarbonato [700 ml MeOH in 300 ml di 1% (w/v) Bicarbonato di Sodio] 4. Macinare ad alta velocità per 1 minuto 6. Aggiungere 20 ml di PBS a 20 ml di campione filtrato 7. Se si osserva del precipitato, filtrare attraverso carta a microfibra di vetro (Whatman GF/A o ) 8. Rimuovere il tappo superiore e allentare il tappo inferiore della colonna 9. Far uscire il tampone di conservazione, riposizionare il tappo inferiore 10. Applicare una siringa di vetro da 50 ml alla colonna utilizzando l'adattatore 11. Caricare 20 ml di campione estratto nel serbatoio in vetro

4 12. Rimuovere il tappo inferiore se necessario applicare una pressione per iniziare un flusso di 1,5-2 ml /min (o gravità). Assicurarsi che non si formino bolle nella colonna 14. Rimuovere la siringa di vetro e l'adattatore. Aggiungere 2 ml metanolo al 25% quindi riattaccare l adattatore e il serbatoio in vetro 15. Aggiungere 20 ml di metanolo 25% nel serbatoio, rimuovere il tappo all estremità inferiore e lasciar defluire il lavaggio. SPEZIE: 1. Macinare finemente il campione 2. Pesare 25 g di campione macinato e aggiungervi 5 gr di NaCl. 3. Trasferire il campione con NaCl in un macinino contenente 125 ml di Metanolo al 70% 4. Miscelare ad alta velocità per 1 minuto 6. Aggiungere 20 ml di PBS a 20 ml di campione filtrato 7. Se si osserva del precipitato, filtrare attraverso carta a microfibra di vetro (Whatman GF/A o ) 8. Rimuovere il tappo superiore e allentare il tappo inferiore della colonna 9. Far uscire il tampone di conservazione, rimettere il tappo inferiore 10. Applicare una siringa di vetro da 50 ml alla colonna utilizzando l'adattatore 11. Caricare 20 ml di campione estratto nel serbatoio in vetro 12. Rimuovere il tappo inferiore se necessario applicare una pressione per iniziare un flusso di 1,5-2 ml /min (o gravità). Assicurarsi che non si formino bolle nella colonna. 14. Rimuovere la siringa di vetro e l'adattatore. Aggiungere 2 ml metanolo al 25% quindi riattaccare l adattatore e il serbatoio in vetro 15. Aggiungere 20 ml di metanolo 25% nel serbatoio, rimuovere il tappo all estremità inferiore e lasciar defluire il lavaggio CONDIZIONI HPLC Derivatizzazione post-colonna con soluzione di iodio: sciogliere 450 mg di iodio cristallino in 1 L di acqua grado HPLC. Miscelare finché non è completamente disciolto, circa un ora. Conservare al buoi e ricordarsi di filtrare sempre prima di iniettarla in HPLC. Per l uso con Kobra cell Controllo della temperatura: Mantenere le colonne analitiche e le colonne di controllo a 40 C Colonne Analitiche Spherisorb ODS2 dimensioni: 5µm Minimo 15 cm x 4.6mm Raccomandati 25 cm x 5 mm

5 Colonna di controllo Spherisorb ODS2 dimensioni particelle: 5µm Fase Mobile 600 ml acqua dd contenente 0,119g di KBr 47,6 µl HNO3 90% ACS reagent) 200 ml Metanolo HPLC grade 200 ml Acetonitrile HPLC grade Pompa HPLC 0,75 ml/minuto Detector Fluorescenza Eccitazione = 360 nm, Emissione = 440 nm Volume di iniezione: 100 µl Standard Aflatossine: Gli standard sono disponibili in soluzione presso SUPELCO (Sigma-Aldrich) sia come aflatossine individuali a 3 µg/ml (cod U, 46324U, 46325U, 46326U) che come mix di aflatossine a 1 µg/ml B1; G1 e 3 µg/ml B2 e G2. (cod 46300U) Preparare la curva standard come sottodescritto: Per il mix di aflatossine cod 46300U: preparare una diluizione 1:10 dello stock, aggiungere 25 µl dello stock a 225 µl di metanolo HPLC grade quindi mescolare bene Pipettare i volumi dati in tabella in una provetta di vetro e portare a secco con Azoto Standard (B1, G1) Standard (B2, G2) Volume stock (µl) Volume slz1:10 (µl) 50 ppb 15 ppb ppb 7.5 ppb ppb 3.0 ppb 50 5 ppb 1.5 ppb 25 1 ppb 0.3 ppb 5 Ad ogni provetta aggiungere 1 ml di fase mobile. Chiudere le provette e agitare su vortex. Lasciar sedimentare per 30 min e agitare nuovamente Per le aflatossine singole: diluire ogni aflatossina con metanolo per ottenere una soluzione stock di 1000 ng/ml per ogni tossina Pipettare 100 µl della soluzione stock 1000 ng/ml di Afla B1 e G1 in una provetta pulita Aggiungere a questa 30 µl della soluzione B2 e G ng/ml. Aggiungere a questa 1740 µl di fase mobile Mescolare bene per ottenere una concentrazione 100 ppb di B1 e G1, B2 e G2 sarà 30 ppb. Usando questa soluzione stock a 100 ppb preparare una curva standard come riportato in tabella: Volume slz stock Volume fase mobile Standard (B1, G1) Standard (B2, G2) 100 ppb (µl) 50 ppb 15 ppb 500 µl ppb 7.5 ppb 250 µl ppb 3.0 ppb 100 µl ppb 1.5 ppb 50 µl ppb 0.3 ppb 10 µl 990

6 Aflatossine singole in forma cristallina: Le aflatossine B1, B2, G1, G2, in forma cristallina possono essere acquistate sul catalogo Sigma cod A6636 (B1); A9887 (B2); A0138(G1), A0236(G2). Risospendere in soluzione benzene-acetonitrile (98:2 v/v) e lasciare a temperatura ambiente per tutta la notte in modo da ottenere una soluzione stock 1mg/mL. Queste soluzioni possono essere conservate a 20 C per due anni. Diluire 50 µl di ogni soluzione stock con 5 ml di metanolo100% (HPLC grade) Misurare l assorbanza di ogni soluzione usando uno spettrofotometro U.V. a 362nm; bianco soluzione di metanolo. Effettuare le letture in triplo, calcolare la media. La concentrazione reale di aflatossine è data dalla seguente equazione: Conc (ng/ml) = A362 x 1000 Coeff Coefficiente: - B1 = B2 = G1 = G2 = Calcolare la concentrazione di ogni soluzione preparata e diluire ogni soluzione con metanolo100% (HPLC grade) per ottenere soluzioni 1000 ng/ml Preparazione curva standard delle varie aflatossine, per calcolare la concentrazione dei campioni tenendo conto del fatto che 1g del campione iniziale è eluito in un volume finale di 2mL. Pipettare 100 µl delle soluzioni 1000 ng/ml di B1 e G1 in una provetta di vetro ed aggiungervi 30 µl delle soluzioni 1000 ng/ml di B2 e G2. A questa aggiungere 1740 µl di fase mobile, miscelare bene in modo da ottenere una soluzione avente concentrazione pari a 100 ppb per B1 e G1, 30 ppb per B2 e G2. Usare i volumi indicati in tabella per preparare la curva standard Volume slz stock Volume fase mobile Standard (B1, G1) Standard (B2, G2) 100 ppb (µl) 50 ppb 15 ppb 500 µl ppb 7.5 ppb 250 µl ppb 3.0 ppb 100 µl ppb 1.5 ppb 50 µl ppb 0.3 ppb 10 µl 990 QUANTIFICAZIONE PER HPLC: Iniettare 100 µl di ogni soluzione standard e campione nel HPLC. L ordine di eluizione è il seguente: G2, G1, B2, B1. Le presenti istruzioni non sostituiscono le originali del kit che devono essere lette prima di effettuare l analisi.