IL RUOLO DELL APLOINSUFFICIENZA DI CHIBBY NELLA PERSISTENZA DELLE CELLULE STAMINALI DELLA LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA

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1 ALMA MATER STUDIORUM UNIVERSITA DI BOLOGNA FACOLTA DI MEDICINA E CHIRURGIA IL RUOLO DELL APLOINSUFFICIENZA DI CHIBBY NELLA PERSISTENZA DELLE CELLULE STAMINALI DELLA LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA Presenta: Manuela Mancini III Workshop in ematologia traslazionale, Perugia maggio 2011

2 CASCATA WNT/β-CATENINA Il pathway Wnt/β-catenina svolge un ruolo determinante in una varietà di processi biologici: sviluppo embrionale, auto-mantenimento del compartimento staminale, omeostasi dei tessuti adulti. Alterazioni che interessano questa cascata del segnale sono implicate nella patogenesi di molteplici malattie tra cui il cancro. Wnt/β-catenina è pertanto un asse del segnale di particolare interesse nell ambito di ricerca della target therapy antitumorale.

3 BETA CATENINA β-catenina è un componente chiave della cascata e svolge il ruolo di coattivatore trascrizionale. Prunier C, Hocevar BA, Howe PH. Growth Factors. 2004

4 è una famiglia di proteine altamente conservata in grado di legare più di 200 partner diversi. Li Z, Liu JY, Zhang JT. Am J Transl Res Il ruolo fisiologico del legame tra le proteine ed i suoi partner è quello di compartimentalizzarli alternativamente nel citoplasma o nel nucleo in base alle necessità della cellula.

5 CHIBBY Chibby è una proteina di 14.5kDa composta da 126 amminoacidi codificata dal gene C22orf2 sul cromosoma 22q13.1. Ne esistono due isoforme: una più frequentemente espressa e una meno, caratterizzata dalla presenza di un esone in più. CBY1 variant 1b 1 96 CDS 1147 CBY1 variant 1a 1 96 CDS F La funzione di Chibby è quella di antagonizzare β-catenina attraverso un duplice meccanismo: diretta interazione con il dominio di attivazione C-term della β-catenina con i fattori di trascrizione Tcf/Lef REPRESSIONE TRASCRIZIONALE mediando il legame con che ne determina la fuoriuscita dal nucleo. R Li FQ, Mofunanya A, Harris K, Takemaru K. J Cell Biol. 2008

6 Chibby e β-catenina, previa fosforilazione da parte di Akt, formano con la famiglia di proteine un complesso stabile trimolecolare che trasloca nel compartimento citoplasmatico, sopprimendo l attività trascrizionale della β-catenina. CITOPLASMA NUCLEO P P

7 LA LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA (LMC) La leucemia mieloide cronica è una sindrome mieloproliferativa cronica, caratterizzata dall abnorme espansione di cellule prevalentemente della serie granulocitopoietica. L evento patogeneticamente rilevante della LMC è la formazione del cromosoma Philadelphia, originato dalla traslocazione reciproca [t (9; 22) (q34; q11)]. Deininger M. Nat Rev Clin Oncol. 2011

8 BACKGROUND Il potenziale oncogenetico della β-catenina costitutivamente attivata, rende Chibby un oncosopressore sotto-espresso in vari tipi di tumore. La vicinanza di Chibby (22q13) al punto di rottura su Bcr (22q11) e il suo ruolo di antagonista della β-catenina hanno suggerito l ipotesi di partenza del nostro lavoro: NELLA LMC è PLAUSIBILE CHE SI REALIZZI UNA DELEZIONE DI UN ALLELE DEL GENE CHIBBY IN SEGUITO ALLA TRASLOCAZIONE RECIPROCA E BILANCIATA [t (9; 22) (q34; q11)], CHE Dà ORIGINE AL CROMOSOMA PHILADELPHIA E AL GENE DI FUSIONE: BCR-ABL OBIETTIVO DELLO STUDIO 1) Definire l impatto di tale delezione nella prognosi della malattia. 2) Confrontare l espressione di Chibby in cellule provenienti da pazienti in fase cronica all esordio della malattia con cellule provenienti da pazienti in crisi blastica.

9 RISULTATI CHIBBY ACTINA AF9/11 AF1/12 AF14/12 PZ2 PZ3 PZ4 PZ10 PZ11 PZ13 % DENSITà 100,000 50,000 ANALISI DENSITOMETRICA DEL WESTERN BLOT DI CHIBBY PZ2 ESORDIO CML PZ3 ESORDIO CML PZ4 ESORDIO CML PZ10 ESORDIO CML PZ11 ESORDIO CML PZ13 ESORDIO CML 0,000

10 CHIBBY ACTINA CHIBBY AF9/11 AF1/12 AF14/12 PZ5 PZ6 PZ7 PZ8 PZ9 PZ5 ESORDIO CML PZ6 ESORDIO CML PZ7 ESORDIO CML PZ8 ESORDIO CML PZ9 ESORDIO CML ACTINA AF9/11 AF1/12 AF14/12 PZ15 PZ16 PZ17 PZ18 PZ15 LAL PH+ ESORDIO PZ16 LAL PH+ T315I PZ17 LAL PH+ PZ18 LAL PH+ 100,000 ANALISI DENSITOMETRICA DEL WESTERN BLOT DI CHIBBY ANALISI DENSITOMETRICA DEL WESTERN BLOT DI CHIBBY 100,000 AF9/11 AF1/12 AF14/12 PZ5 PZ6 PZ7 PZ8 PZ9 AF9/11 AF1/12 AF14/12 PZ15 PZ16 PZ17 PZ18 % DENSITà 50,000 % DENSITà 50,000 0,000 0,000

11 CHIBBY ACTINA AF9/11 AF1/12 PZ6 PZ7 PZ5 PZ20 PZ21 PZ22 PZ5 CML ESORDIO PZ6 CML ESORDIO PZ7 CML ESORDIO PZ20 CML ESORDIO PZ21 CML ESORDIO PZ22 CML ESORDIO CHIBBY ACTINA AF9/11 AF1/12 PZ23 PZ24 PZ25 PZ26 PZ27 PZ28 PZ23 CML CB IMRES PZ24 CML CB T315I PZ25 LAL PH+ IMRES PZ26 LAL PH+ ESORDIO PZ27 LAL PH+ ESORDIO PZ28 LAL PH+ IMRES 100,000 ANALISI DENSITOMETRICA DEL WESTERN BLOT DI CHIBBY AF9/11 AF1/12 PZ6 PZ7 PZ5 PZ20 PZ21 PZ22 % DENSITà 50,000 0,000

12 CHIBBY ACTINA AF1/12 PZ30 PZ34 PZ35 PZ36 PZ37 PZ39 PZ31 PZ32 PZ33 PZ38 ANALISI DENSITOMETRICA DEL WESTERN BLOT DI CHIBBY 100 PT30 ESORDIO PT34 ESORDIO PT35 ESORDIO PT37 ESORDIO IM RES PT39 ESORDIO IM RES PT31 CB PT32 CB PT33 CB PT38 CB % DENSITà 50 CHIBBY PROTEINA AF1/12 PZ30 PZ36 PZ37 PZ39 PZ31 PZ32 PZ33 PZ38 0

13 ESPRESSIONE DI CHIBBY IN CELLULE CD34+ CHIBBY ACTIN CHIBBY cdna AF1 MNC AF1 CD34+ AF2 MNC AF2 CD34- AF2 CD34+ AF3 MNC AF3 CD34- AF3 CD34+ PZ45 CD34+ PZ46 CD34+

14 CONCLUSIONI La mancata espressione della proteina chibby è un evento coinvolto sia nella patogenesi che nella progressione delle leucemie Ph positive; La traslocazione reciproca t(9;22), da cui origina il riarrangiamento Bcr-Abl della LMC e della maggioranza di LAL dell adulto, può coinvolgere una regione a valle del punto di rottura di Bcr, contenente il gene Chibby generando un aploinsufficienza dello stesso.

15 LAVORI IN CORSO Comprovare la putativa aploinsufficienza di Chibby nelle cellule leucemiche mediante la tecnica di Fluorescence in situ Hybridization (FISH); Verificare il ruolo di Chibby nella patogenesi e progressione della malattia transfettando linee cellulari di LMC (K562) con un costrutto codificante per il gene WT.

16 FISH (Fluorescence in situ Hybridization) CBY BCR CBY BCR CBY

17 CLONAGGIO CLONAGGIO DI CHIBBY NEL DI CHIBBY VETTORE pcdna3.1 CBY1 408 bp

18 PROSPETTIVE FUTURE Verificare se l espressione indotta del gene chibby possa, in modelli cellulari e animali, indurre maggiore responsività ai farmaci attualmente in uso nella terapia della LMC; Indagare se e come, il legame tra chibby e possa condizionare la stabilità di Chibby.

19 PROF. MARIA ALESSANDRA SANTUCCI DR MICHELA ALUIGI DR ELISA LEO DR ENRICA BORSI DR NICOLETTA TESTONI DR SIMONA LUATTI DR CARMEN BALDAZZI DR GIULIA MARZOCCHI DR FAUSTO CASTAGNETTI

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