Fluorescent DNA probe. heat. Chromosomal DNA. Annealing: probe/dna

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1 Istituto di Anatomia e Istologia Patologica Facoltà di Medicina e Chirurgia Università degli Studi di Sassari La aplicación en diagnóstico del FISH: aspectos técnicos y modalidad de empleo La Habana - CUBA mayo 2004

2 Fluorescent in situ hybridization (F.I.S.H.) FISH is a technique that combines the traditional fluorescence microscopy with molecular biology methods (in situ hybridization)

3 Fluorescent DNA probe heat Chromosomal DNA Annealing: probe/dna

4 FISH: advantages vs other molecular techniques Visual control and morphology partially preserved Fast (24 hrs at maximum) Minor lab equipments Large number of probes and kits are now commercially available

5 Molecular abnormalities detectable by FISH Amplifications Deletions Traslocations

6 Sonde / Probes Alfoidi sequenze centromeriche altamente ripetute specifiche per cromosoma (CEP). 750 kb riconoscere e/o enumerare uno specifico cromosoma

7 Sonde / Probes Painting intero cromosoma o di grosse porzioni di esso (per es: braccio lungo o corto) studio e identificazione di rimaneggiamenti cromosomici complessi Telomeriche specifiche per sequenze cromosomiche terminali < 100kb

8 Sonde / Probes Sequenza unica consentono di studiare le modificazioni di un locus specifico (delezioni, amplificazioni, traslocazioni) 500bp / centinaia Kb sequenze altamente specifiche per il sito di ibridazione

9 FISH: Materiali 1) Vetrini silanizzati o a carica positiva 2) Piastra riscaldata ( C) 3) Vetrini coprioggetto (22mmx22mm) 4) Micropipette con puntali monouso 5) Timer 6) Microtomo 7) Cilindri graduati J Nath, K Jhonson Fluorescent in situ hybridization (FISH): DNA probe production and hybridization criteria. Biotech Histochem 1997

10 FISH: Materiali phmetro Bagni termostatati (37Cº e 82 Cº) Camera di ibridazione umidificata (HYBRITE) Coplin jars Microscopio a fluorescenza dotato di filtri dedicati J Nath, K Jhonson Fluorescent in situ hybridization (FISH): DNA probe production and hybridization criteria. Biotech Histochem 1997

11 FISH: allestimento dei preparati Preparazione dei vetrini Deparaffinazione Pretrattamento Trattamento con proteasi Post-fissazione Ibridazione Valutazione al microscopio a fluorescenza

12 Paraffin removal Lipid removal Protein digestion µ Xylene bath Detergent bath Proteinase K Pronase etc + + Probe incubation + + Washing Fluorescence microscope Humid chamber Controlled T

13 Preparazione dei vetrini da campioni fissati in formalina ed inclusi in paraffina. Tagliare sezioni dello spessore di 3-5 µm utilizzando un microtomo Porre le sezioni in un bagno protein free a 40 C Montare le sezioni sul vetrino silanizzato Asciugare i vetrini all aria Porre i vetrini in stufa a C overnight (deparaffinazione)

14 Pretrattamento dei vetrini: Deparaffinazione Immergere i vetrini in toluene (agente deparaffinante) per 10 min a temperatura ambiente. Tale operazione va eseguita due volte, cambiando ad ogni passaggio la soluzione. Deidratare i vetrini in EtOH al 100% per 5 min a temperatura ambiente. Ripetere per due volte. Asciugare i vetrini all aria o ponendoli su una piastra riscaldata a C. Porre i vetrini in soluzione di pretrattamento a 80 C per 30 minuti.

15 Incomplete paraffin removal

16 Pretrattamento dei vetrini: trattamento in soluzione di proteasi Immergere i vetrini in soluzione di proteasi a 37 C per minuti. Immergere i vetrini in Wash Buffer per 5 minuti. Tale operazione va ripetuta due volte. Asciugare i vetrini a C per 2-5 minuti.

17 Digestion There is not a common protocol!! time varies depending on different tissues Breast, prostate: 25 min Lymph node: min Pleura, peritoneum: 30 min Lung: min Citology (voided urine): 15 min

18 Poor digestion

19 Same case - optimal digestion

20 Pretrattamento dei vetrini: post-fissazione Immergere i vetrini in formalina neutra tamponata a temperatura ambiente per 10 min. La formalina neutra tamponata permette di mantenere la morfologia tissutale. Una eccessiva fissazione può determinare la formazione di legami che riducono l accessibilita della sonda al target. Immergere i vetrini in wash buffer per 5 min. L operazione deve essere eseguita due volte. Asciugare i vetrini su una piastra calda a C per 2-5 min.

21 Ibridazione Applicare la sonda sull area selezionata sul vetrino Porre un vetrino coprioggetto sull area selezionata e sigillare accuratamente con del mastice Bolle di aria possono interferire con l ibridazione Porre il vetrino nella camera di ibridazione deumidificata (HYBRITE )

22 Parametri che influenzano l ibridazione Temperatura : la temperatura di massima velocità di ibridazione è di 25 C. ph : in un range tra 5-9 la velocità di ibridazione è indipendente dal ph.

23 Parametri che influenzano l ibridazione Solventi organici : riducono la stabilità termica delle doppie eliche e permettono la denaturazione a temperature più basse (ad es: formammide). Cationi monovalenti (Na+) : interagiscono elettrostaticamente con il DNA a livello dei gruppi fosfato (la repulsione fra le due catene diminuisce con l aumentare della concentrazione salina)

24 Parametri che influenzano l ibridazione Concentrazione della sonda (rapporto diretto). Lunghezza della sonda : la velocità di rinaturazione è proporzionale al quadrato della lunghezza del frammento. Contenuto in G-C : la stabilità dell ibrido è direttamente proporzionale alla percentuale di G-C.

25 Lavaggi post-ibridazione Riscaldare in bagno termostatato a 72 ºC la soluzione di lavaggio post-ibridazione (2xSSC/0,3% NP-40) Rimuovere delicatamente il mastice dal vetrino Immergere i vetrini nella soluzione di lavaggio post- ibridazione a temperatura ambiente Dopo avere rimosso il vetrino coprioggetto, immergere i vetrini nella soluzione di lavaggio postibridazione a 72 ºC Asciugare i vetrini all aria in ambiente privo di luce. Applicare 10 µl di controcolorante DAPI sull area target ed applicare un coprioggetto

26 Valutazione del segnale Occorre valutare l adeguatezza del preparato utilizzando i seguenti parametri: Intensità del segnale della sonda: il segnale deve essere chiaro, distinto e facilmente valutabile. Segnale di fondo: deve essere omogeneamente scuro.

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28 Valutazione del segnale Utilizzare l obiettivo 25X per identificare l area di interesse Evitare le aree dove predomina la necrosi e dove i bordi nucleari sono indistinti Non considerare i segnali con intensità debole o le aree con segnale di fondo eccessivo

29 Suggerimenti e precauzioni In genere è opportuno processare non piu di otto vetrini, con un controllo positivo. Il vetrino di controllo deve essere processato contemporaneamente agli altri casi per poter valutare la corretta esecuzione e per valutare l accuratezza del segnale. Per poter identificare correttamente l area bersaglio, è bene disporre dello stesso caso di una sezione colorata con E/E.

30 Fish Applications Breast Prostate Lymph nodes Bladder Colon

32 Amplificazione Evento mutazionale che comporta l aumento del numero di copie di un determinato gene con conseguente aumento di attività del prodotto da esso codificato Principale meccanismo di attivazione degli oncogeni

33 Carcinoma della mammella: valutazione dello stato di HER-2/Neu Her 2/neu/c-erbB-2 appartiene alla famiglia dei recettori per i fattori di crescita. E un componente della via di trasduzione del segnale coinvolto nella crescita cellulare. La sua localizzazione extra-cellulare lo rende un possibile bersaglio farmacologico.

34 HER-2/Neu

35 Iperespressione/Amplificazione di Her2/neu: Rilevanza clinica Her-2/neu risulta amplificato/iperespresso nel 20-30% dei casi di carcinoma mammario. L amplificazione/iperespressione di HER2 è un evento precoce nello sviluppo del carcinoma della mammella. L amplificazione è fattore prognostico negativo in termini di OS e DFS (rischio 5,5; Press MF et al. J Clin Oncol, 1997); è marcatore di recidiva precoce (rischio 3,1).

36 Iperespressione/Amplificazione di Her2/neu: Rilevanza clinica Si correla positivamente con la risposta alla terapia antiblastica (taxani e antracicline) e negativamente con quella ormonale (tamoxifene) L iperespressione condiziona la somministrazione dell anticorpo monoclonale ricombinante rhumab-her2 (Trastuzumab) in associazione con le tradizionali terapie.

37 Iperespressione/Amplificazione di Her2/neu: Effetti in vitro Capacità trasformante. Chemioresistenza a farmaci antiblastici. Paclitaxel, Docetaxel Aumento o conferimento di capacità metastatica.

38 Valutazione dello stato di HER2/neu Attualmente sono disponibili numerosi sistemi per valutare lo stato di HER2/neu (Southern Blot, Dot Blot, PCR quantitativa). I più frequentemente utilizzati sono la dimostrazione dell iperespressione di HER2 mediante indagine immunoistochimica (IHC) e dell amplificazione mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH). Currently, no single assay is globally accepted as the gold standard for HER 2 testing., Bilous et al,mod Pathol 2003

39 Valutazione dello stato di HER2/neu I campioni sono inizialmente testati mediante IHC. I campioni con intensa positività per Her-2 (IHC 3+) sono elegibili per la terapia con Herceptin. I campioni IHC 2+ devono essere ritestati con altro metodo, preferibilmente con indagine FISH. Bilous M et al Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines Mod Pathol 2003.

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42 HER2/NEU EXPRESSION IHC - HercepTest 2+ 3+

43 Vysis (PathVysion) - Dakocytomation HER-2/DNA probes Permettono di valutare l amplificazione del gene HER-2 mediante FISH. Entrambe le metodiche prevedono l utilizzo di due sonde a DNA marcate con sostanze fluorescenti: HER-2 che identifica l intero gene HER-2 marcato con Spectrum Orange CEP 17 è marcato con Spectrum Green e si ibridizza con il DNA alfa-satellite localizzato in corrispondenza del centromero del cromosoma 17 (17p11.1-q11.1)

44 HER-2/NEU - FISH

45 HER2/NEU AMPLIFICATION Low Level High Level

46 Valutazione amplificazione HER 2 mediante FISH Amplificazione: Her-2/CEP 17 >2,2 Borderline: Her-2/CEP Non amplificato: Her-2/CEP 17 < 1.8 Zarbo, Hammond Conference summary, strategic science symposium. Arch Pathol Lab Med 2003

48 P53 deletion

50 sottrazione del proto-oncogene oncogene traslocato ai normali meccanismi di regolazione TRASLOCAZIONE CROMOSOMICA costituzione di un trascritto di fusione che porta alla sintesi di proteine chimeriche

51 Il meccanismo della traslocazione cromosomica è frequente nelle neoplasie del sistema emolinfopoietico: Leucemia Mieloide Cronica Linfoma di Burkitt t(9;22) t(8;14), t(8;22) Linfoma anaplastico a grandi cellule t(2;5) Linfoma mantellare Linfoma MALT Linfoma follicolare t(11;14) t(11;18), t(1;14) t(14;18)

52 LINFOMA FOLLICOLARE t(14;18)(q32;q21) la traslocazione comporta lo spostamento del gene BCL-2 (18q21) in corrispondenza del locus delle catene pesanti immunoglobuliniche (14q32) con conseguente iperespressione della BCL-2

53 T(14;18)(q32;q21) Iperespressione di bcl-2 Inibizione dell apoptosi Ulteriori alterazioni geniche Espansione clonale Stimolazione antigenica Trasformazione neoplastica

54 Il riconoscimento della iperespressione della BCL-2 e l identificazione della traslocazione t(14; 18) sono criteri di notevole importanza nella diagnosi differenziale in alcune forme di linfoma

55 Diffuse Large B-Cell Lymphomas Germinal centre B-like DLBCL Activated B-like DLBCL Alizadeh AA et al. Nature 403: , 2000

56 bcl-2 Gascoyne RD et al. Prognostic significance of bcl-2 protein expression and bcl-2 gene rearrangement in diffuse aggressive non-hodgkin,s Lymphoma. Blood 90: , 1997

57 F I S H Sonde per il cromosoma 18 (Orange) e per il cromosoma 14 (Green), complementari alle sequenze geniche ricercate con le quali formano degli ibridi visualizzabili al microscopio a fluorescenza.

58 BCL-2 FISH

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60 F I S H Visualizzazione al microscopio a fluorescenza Obiettivo 100 x ad immersione con filtro triplo Conta dei segnali di ibridazione in 200 nuclei integri Identificazione dei segnali di co-localizzazione Acquisizione dell Immagine Processazione ed analisi dell immagine Espressione in % del rapporto tra n di nuclei con segnali di co-localizzazione e n di nuclei totali

61 Il meccanismo della traslocazione cromosomica è frequente nelle neoplasie del sistema emolinfopoietico: Leucemia Mieloide Cronica Linfoma di Burkitt t(9;22) t(8;14), t(8;22) Linfoma anaplastico a grandi cellule t(2;5) Linfoma mantellare Linfoma MALT Linfoma follicolare t(11;14) t(11;18), t(1;14) t(14;18)

62 LARGE CELL LYMPHOMA CD30+ ALK Chromosome 2 breakpoint Separation of probes due to the chromosomal break

63 Valutazione dello stato di HER2/neu: Analisi quantitativa dell amplificazione di Her2 Dakocytomation

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