Laboratorio di Tecniche Microscopiche AA Lezione 28 Marzo 2008 Ore 11-13

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1 Laboratorio di Tecniche Microscopiche AA Lezione 28 Marzo 2008 Ore

2 Continuiamo il discorso sulla fluorescenza ricordando alcuni fra i più comuni utilizzi dei fluorocromi Istochimica Molecole fluorescenti con proprietà che le rendono utilizzabili come coloranti Abbiamo visto i coloranti nucleari

3 Istochimica I fluorocromi possono essere usati per marcare molecole con affinità particolari Abbiamo visto le lectine Altro esempio: la falloidina

4 Immunoistochimica I fluorocromi possono essere usati per marcare anticorpi

5 Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) Nucleotidi fluorescenti possono essere usati per le sonde

6 Molecole in grado di diventare fluorescenti solo quando legate a determinati ioni

7 Completiamo il discorso accennando ad un paio di utilizzi particolari delle proprietà delle molecole fluorescenti FRAP*, quando il photobleaching** diventa utile... * Fluorescence Recovery After Photobleaching ** fotodecadimento dovuto all esposizione alla luce (i fotoni danneggiano la molecola) e all ossidazione

8 Il fluoroforo in una piccola zona target viene intenzionalmente bleachato e monitorando il ritorno di fluorescenza si può quantificare il tasso di diffusione laterale (le molecole attorno marcate con fluoroforo non bleachato si muovono). Si monitorano in questo modo spazi di pochi micron.

9 FRET*, quando il quenching** diventa utile... * Fluorescence Resonance Energy Transfer ** Il fluorocromo cede la sua energia in modo non radiativo ad un altra molecola vicina

10 Le interazioni tra molecole avvengono a distanza di pochi Angstrom. Questo tipo di colocalizzazione non può essere messo in evidenza con un microscopio ottico il cui limite di risoluzione è 200 nm. Durante la FRET un primo fluoroforo viene eccitato con la sua giusta lambda di eccitazione, se il secondo fluoroforo è sufficientemente vicino avviene un passaggio di energia tra le due molecole senza radiazione luminosa.

11 In pratica, se eccitando il fluorocromo A, in alcuni punti del campione vediamo emettere il fluorocromo B Allora le due molecole marcate con fluorocromo A e con fluorocromo B sono davvero molto vicine, nella possibilità di interagire tra loro, e si dicono COLOCALIZZATE

12 Vediamo velocemente alcuni altri tipi di microscopio Stereomicroscopio Microscopio elettronico a trasmissione Microscopio elettronico a scansione

13 Lo stereomicroscopio (o binoculare) Permette un ingrandimento massimo di 40X (quindi il potere di risoluzione è di circa 5 µm Non vuol dire che è utile per studiare strutture di 5 micron!!!) - La luce è incidente sulla struttura da osservare -

14 Posso utilizzare lo stereomicroscopio per osservare strutture in toto. Pieghe intestinali (ordine di grandezza: centinaia di micron) Gonadi femminili di un pesce

15 Una mosca Ampolla del Lorenzini

16 Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) Il limite di risoluzione di questo strumento è di 0,2 nm Un fascio di elettroni attraversa il campione e viene proiettato su uno schermo che trasforma in toni di grigio il numero di elettroni da cui viene colpito. Condensatore, Obiettivo e Proiettore non sono costituiti da lenti e fonti luminose, ma da campi magnetici, che hanno lo scopo di deviare le traiettorie degli elettroni.

17 I campioni devono essere molto più sottili di quelli per il microscopio ottico a luce trasmessa

18 Fissazione possibile anche con glutaraldeide o altri fissativi forti Effetti delle fissazione sulla reattività antigenica 4 % paraformaldeide 1 % glutaraldeide

19 Inclusione in resina e taglio all ultramicrotomo (sezioni da micron a 60 nm) Sezioni semifini Sezioni fini

20 Non vengono usati coloranti ma sostanze dense agli elettroni semplicemente per dare contrasto o anche per marcare anticorpi

21 Nucleosomi

22 IL MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE (SEM) limite di risoluzione 5 nm

23 Nel SEM (ed in genere nella microscopia elettronica) viene sfruttata l interazione l di un fascio di e - con il campione per ricavare informazioni sul campione stesso come nel microscopio luce a riflessione viene utilizzato un fascio di fotoni

24 Il SEM è costituito da quattro parti principali Un sistema che produce il pennello di e- e Un campione dove l interazione l col fascio di e- e produce l informazione l Un sistema rivelatore che raccoglie gli e- e portatori d informazione d Un sistema di presentazione che colloca sequenzialmente l informazione nell immagine

25 Non vengono registrati gli e - che attraversano il campione bensì quelli secondari che sono emessi a seguito dell urto del fascio di e - contro di esso Essi sono attirati da un collettore e l intensit intensità del segnale prodotto dal collettore è proporzionale al numero di e- e secondari che lo raggiungono

26 La caratteristica preminente delle immagini ottenute con il SEM è l eccezionale tridimensionalità

27 I campioni biologici devono subire due processi prima di poter essere osservati al SEM. La disidratazione - (Etanoli e altre sostanze molto volatili oppure Critical Point) La doratura cioè il ricoprimento del campione con un sottilissimo strato d oro d ottenuto tramite vapori Questi trattamenti sono ben sopportati da strutture abbastanza rigide e poco idratate mentre rischiano di rovinare la morfologia di strutture delicate. Per ovviare a questo problema almeno in parte si possono trattare i campioni con sostanze che li induriscano e comunque trattarli con estrema attenzione.

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31 - Ciglia e microvilli -

32 Esempi di scelte poco felici: 1) Il SEM per vedere cose che si possono distinguere benissimo con uno stereomicroscopio 2) Il TEM per cercare le apoptosi in un tessuto

33 Dimensioni µm 20 X 30 µm 20 µm 1X2 µm 1X5 µm nm 25 nm 7 nm 2 nm

34 FISSAZIONE CHIMICA FISSAZIONE A FREDDO DISIDRATAZIONE E/O E/O CRITICAL POINT POINT INCLUSIONE IN IN PARAFFINA INCLUSIONE IN IN RESINA INCLUSIONE IN IN OCT OCT TAGLIO AL AL MICROTOMO TAGLIO ALL ULTRA- MICROTOMO TAGLIO AL AL CRIOSTATO SPARAFFINATURA ELIMINAZIONE DELLA DELLA RESINA CONTRASTO O IMMUNOGOLD EVENTUALE POST-FISSAZIONE DORATURA DISIDRATAZIONE E CHIUSURA IN IN BALSAMO COLORAZIONE O IMMUNO- ISTOCHIMICA CHIUSURA CON CON MEZZO ACQUOSO SEM SEM MICROSCOPIO OTTICO A LUCE LUCE TRASMESSA MICROSCOPIO A EPIFLUORESCENZA MICROSCOPIO CONFOCALE TEM TEM

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