Telomere terminal transferase: telomerase

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1 Telomere terminal transferase: telomerase

2 UNO DEI MAGGIORI QUESITI DI BIOLOGIA DEGLI ULTIMI 25 ANNI: come i cromosomi possono essere copiati completamente durante le divisioni cellulari e come vengono protetti dalla degradazione? 5 ottobre 2009 NOBEL per la Medicina a Elizabeth H. Blackburn, Carol W. Greider e Jack W. Szostak. Hanno messo in luce: -Il ruolo dei telomeri ; - l enzima che ne consente la formazione e il mantenimento: la Telomerasi.

3 I telomeri HJ Muller (1938): In Drosophila melanogaster non si ritrovano cromosomi senza estremità dopo frammentazione con raggix. I cromosomi senza telomeri venivano degradati. B.McClintock (1940): nel mais i cromosomi rotti tendono a riunirsi formando dicentrici o anelli. Cromosomi senza telomeri sono appiccicosi. Definizione: Struttura cromosomica specializzata che protegge le estremità dei cromosomi lineari.

4 Le sequenze telomeriche sono ripetizioni di brevi unità di sequenze. Macronucleo dei Ciliati (Tetrahymena) TTGGGG Macronucleo dei Ciliati (Oxytricha) TTTTGGGG Minicromosoma del Trypanosoma TAGGG rdna delle muffe mucillaginose (Dictyostelium) TAGGG Cromosoma di lievito (Saccharomyces) TG1-3. (ripetizioni imperfette) Cromosoma di pianta (Arabidopsis) TTTAGGG Cromosoma umano e vertebrati TTAGGG

5 Formula generale delle sequenze ripetute: Cn (A / T)m x (T / A)mGn con n=1-8 e m=1-4 Il numero di ripetizioni e variabile nelle diverse specie bp nei nei Ciliati (Tetrahymena e Oxytricha), 300 bp in S.cerevisiae bp nell uomo, fino a bp nel topo. In ogni specie la lunghezza dei telomeri e mantenuta entro un determinato intervallo di lunghezza quindi esiste un omeostasi tra perdita e acquisto di unita ripetute ai telomeri. Per questo motivo la lunghezza dei telomeri deve essere regolata.

6 Il problema della replicazione La DNA polimerasi ha attività pol. 5-3 quindi solo il filamento leading sarà copiato direttamente nella direzione 5-3 grazie ad un innesco ad RNA che permette il lavoro della polimerasi; Sul filamento lagging si formeranno tanti primer ad RNA e i cosiddetti frammenti di Okazaki, poi ricuciti dopo la rimozione degli inneschi. L ultimo primer però, una volta rimosso, non può essere sostituito: Ne consegue che ad ogni replicazione, una breve sequenza viene persa ad ogni estremità.

7 Se il meccanismo di replicazione del DNA agisse da solo sui cromosomi, dopo numerose divisioni la perdita di DNA sarebbe significativa e porterebbe tutte le cellule alla senescenza.

8 Tetrahymena come organismo modello. La prima sequenza telomerica identificata fu quella di un protozoo ciliato, Tetrahymena termophila, grazie al suo caratteristico dimorfismo nucleare : - Possiede un micronucleo (2n) che rappresenta la linea germinale, deputato alla riproduzione e alla formazione del macronucleo; - Possiede un macronucleo somatico in cui sono contenute sequenze duplicate in molte copie in molecole lineari brevi che vengono attivamente espresse; - Il vantaggio di utilizzare Tetrahymena sta proprio nel suo macronucleo poiché possiede oltre telomeri. Ripetizione in tandem da 20 a 70 volte della sequenza (direzione centromero-telomero) 5 TTGGGG 3

9 Obiettivo della Greider nel suo lavoro di tesi: - Identificare l entità molecolare responsabile della replicazione delle estremità cromosomali. Le basi su cui lavorare: Quando le molecole lineari di DNA derivate dai protozoi ciliati (es. le ripetizioni di TTTTGG di Tetrahymena) venivano propagate e replicate nel lievito Sacc.Cerevisiae, le ripetizioni telomeriche di lievito venivano aggiunte sulle estremità delle ripetizioni di Tetrahymena (Szostak e Blackburn, 1982).

10 Saggio dell attività di sintesi dei telomeri di Greider e Blackburn (1985) Si utilizza: - estratto cellulare di Tetrahymena; - (TTGGGG)4 come primer per saggiare l attività di allungamento; - Varie combinazioni di α-32p-dntp e dntp non marcati. Il saggio consiste di incubazione a 30 C, estrazione con fenolo e precipitazione in etanolo, infine viene analizzato con elettroforesi su gel di poliacrilammide 6% C è un attività negli estratti che aggiunge DNA con un pattern di ripetizione di 6 basi; sono aggiunte oltre le 30 ripetizioni.

11 Il pattern di ripetizione di 6 basi fu osservato solo con α-32p-dgtp e gli altri 3 dntp non marcati (linea 3) oppure con α-32p-dgtp più dttp non marcato (linea 6). α-32p-dgtp non viene incorporato in un pattern di ripetizione a 6 basi in assenza di dttp (linea 8). Nessuna ripetizione viene sintetizzata in assenza di oligomero (linea 13-16). La possibilità di sintesi attraverso l autoinnesco e lo slittamento dello stampo è eliminata dall assenza di incorporazione marcata quando α-32p-dctp e datp sono aggiunti all estratto (linea 2 e 5). Sostituendo l estratto con il frammento Klenow della DNA pol I di E.Coli si osservano poche ripetizioni (linea 9-12).

12 Un ricercatore sempre nel laboratorio della Blackburn aveva scoperto che le sequenze telomeriche erano in grado di ripiegarsi su se stesse con della interazioni fra basi di tipo non Watson-Crick, quindi poteva trattarsi ancora una volta della DNA polimerasi normale che vedeva queste sequenze ripiegate come primers per la sua attività. Erano necessari altri esperimenti... Gli estratti vengono trattati con la nucleasi micrococcale in un caso e con l aphidicolin in un altro caso per verificare se l attività di allungamento fosse compromessa. L allungamento è indipendente sia dal DNA endogeno che dalla DNA polimerasi endogena.

13 Furono verificati inoltre: Gli effetti che si avevano variando la concentrazione di dttp. Ciò permise di confermare, insieme ad altri esperimenti, che solo dgtp e dttp sono richiesti per l allungamento ripetuto e suggerirono che alte concentrazioni di altri dntp competono con il dttp. Le minime concentrazioni richieste per l allungamento sono: - dgtp < 0,1 um - dttp >1 um

14 L attività è presente maggiormente per le cellule durante lo sviluppo macronucleare (quando un ampio numero di telomeri è formato e vanno incontro a parecchi cicli di replicazione), piuttosto che durante le divisioni vegetative.

15 Ulteriori caratteristiche furono messe in evidenza: 1. Rapido aumento dell incorporazione della marcatura; 2. Alta affinità col substrato; 3. Suscettibilità alla temperatura e alla proteinasi K. L attività di allungamento ha proprietà enzimatiche! Questi risultati, pubblicati nell importante lavoro del 1985, portarono alla conclusione che esiste un enzima, una terminal transferasi del telomero poi da loro chiamata telomerasi, che addiziona esanucleotidi ai telomeri dei cromosomi.

16 I telomeri quindi sono riforniti dalla Telomerasi che mantiene le estremità dei cromosomi dopo ogni divisione cellulare.

17 Telomerasi E una ribonucleoproteina che aggiunge ripetizioni alle sequenze telomeriche quindi è il maggior regolatore della lunghezza telomerica. Consiste di due componenti principali: htert ( Human Telomerase Reverse Transcriptase) - una subunità di 270 Kd con attività di trascrittasi inversa conosciuta come trascrittasi inversa telomerasica. hterc ( Human Telomerase RNA component) - una molecola di RNA conosciuta come il componente ad RNA della telomerasi lunga 450 nucleotidi che serve da stampo per la sintesi di nuove ripetizioni telomeriche.

18 Ci sono inoltre 3 classi di proteine associate alla telomerasi: Est1p, trovata inizialmente nel lievito, interagisce con una proteina che lega l estremità telomerica di lievito, la Cdc13p; questa interazione sembra che richiami la telomerasi sull estremità cromosomica e la attivi; l omologa di Est1p nell uomo si chiama EST1A. Altra subunità trovata nel lievito è la Est3p, allo stesso modo importante per l attività telomerasica in vivo ma non in vitro, con una funzione non ancora chiara. Una classe a parte è data dall eterodimero Ku, responsabile dell unione delle estremità non omologhe di cromosomi rotti; si lega ad hterc e promuove l allungamento telomerico incappucciando estremità rotte con DNA telomerico. Infine abbiamo proteine per l assemblaggio e la maturazione della telomerasi come le Sm assimilabili alle snrnps coinvolte nello splicing dell RNA.

19 La hterc possiede un dominio per le snornps (small nucleolar RNP) e sembra essere maturato nel nucleolo; lega Diskerina e altre snornps. Difetti nell RNA o nella proteina Diskerina che interrompono questa maturazione possono portare ad una malattia umana nota come Diskeratosi congenita, un grave disordine che porta ad invecchiamento precoce in giovane età.

20 Come agisce la Telomerasi

21 Dove agisce? La telomerasi è attiva solo in alcuni tessuti Mentre nei ciliati e in S.cerevisiae la telomerasi e sempre attiva, negli eucarioti superiori e attiva solo in alcuni tessuti: Cellule germinali Cellule staminali Cellule embrionali Le cellule somatiche differenziate non hanno telomerasi e vanno incontro a senescenza duplicativa che e associata con un diminuzione della lunghezza dei telomeri. Il 90% dei tumori presentano attivazione della telomerasi.

22 Regolazione della Telomerasi Dipende dall espressione genica di htert: -C è un repressore non identificato codificato sul cromosoma 3 che controlla la trascrizione di htert portando al silenziamento genico; -Esistono 3 soppressori tumorali che agiscono come regolatori negativi della trascrizione di htert : - Mad1, un repressore di c-myc; -TGF-β, agisce attraverso SIP1; - Menin, si lega direttamente al promotore di htert; NB: Alcune cellule mancano di attività telomerasica ma ha lo stesso un alto livello di trascrizione di htert; durante lo splicing alternativo vengono saltati alcuni esoni quindi si ottiene un enzima inattivo.

23 La regolazione della lunghezza dei telomeri oltre che dalla regolazione della telomerasi dipende anche dall accessibilità del telomero alla telomerasi stessa. Proteine che legano il telomero: Nel lievito, Proteine che legano il dsdna telomerico come Rap1p agiscono legando Rif1p e Rif2p per formare una struttura della cromatina chiusa, prevenendo l accesso della telomerasi. Nell uomo, Proteine che legano il dsdna telomerico sono TRF1 e TRF2, agiscono con un meccanismo simile a quello per il lievito; TRF1 (telomeric repeat binding factor1) ha dei siti di legame per TIN2 mentre TRF2 lega hrap1.

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25 Nell uomo, la proteina POT1 (Protection of Telomeres) si è visto agisca come repressore della telomerasi legando la coda di ssdna al 3 impedendo così il legame della regione ad RNA della telomerasi Le code di ssdna telomerico possono inoltre prevenire il legame della telomerasi formando una struttura a quartetto di G che appartengono a ripetizioni diverse. Strutture di questo tipo non sono state riscontrate in cellule di mammifero.

26 Il modello a loop del telomero I telomeri possono formare una struttura chiamata T loop quando tutto il DNA telomerico si ripiega in forma circolare. Quando l estremità 3 a singola elica che protude invade la porzione del telomero a doppia elica appaiandosi con un elica e spiazzando l altra otteniamo il D loop (displachment loop).

27 Il T-loop protegge le estremità cromosomiche da nucleasi e da attività cellulari che possono essere dannose per la sua integrità, come dall attacco di proteine coinvolte nella riparazione. Le proteine di legame per il dsdna come TRF1 e TRF2 potrebbero esercitare i loro effetti nella regolazione della lunghezza del telomero in parte modulando la formazione del T-loop.

28 La stabilità del t-loop è quindi determinata: - Dalla lunghezza delle sequenze telomeriche; - Dalle proteine che legano il dsdna telomerico; - Dalle proteine di riparazione presenti al telomero (legano alcuni siti presenti sulla proteina TRF2 formando un particolare complesso proteico).

29 Proprietà dei telomeri Il ruolo dei telomeri è quello di stabilizzare le estremità cromosomiche lineari formando, quello che viene definito, un cappuccio protettivo che impedisce la possibilità di riarrangiamenti intra- ed intercromosomici. I telomeri devono possedere delle proprietà specifiche per permettere una replicazione completa della molecola di DNA lineare; Contribuiscono alla localizzazione dei cromosomi nel nucleo tramite l associazione con la membrana nucleare.

30 Telomerasi e senescenza La lunghezza dei telomeri è un indice del numero di divisioni a cui una cellula può andare incontro, come esposto dall Hayflick Limit: Le cellule umane normali hanno una limitata capacità di dividersi, al fine della quale diventano senescenti. La disponibilità di htert ha permesso di verificare direttamente la correlazione tra telomerasi e senescenza cellulare: -Quando htert è inserito in fibroblasti o in cellule epiteliali retiniche aumenta enormemente il loro ciclo vitale: non si sviluppano anomalie cromosomiche e non diventano cancerose, mostrano solo mancanza di senescenza replicativa. -Cellule epiteliali mammarie e cheratinociti, invece, oltre ad htert, necessitano dell inattivazione della via del soppressore tumorale Rb/p16, per estendere il loro ciclo vitale.

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32 p53 e la senescenza Le cellule telomerasi-negative (cellule normali) presentano senescenza replicativa; a quel punto, la cellula smette di dividersi. Questo arresto nella crescita è innescato da p53, che viene di solito attivato in risposta a un danno al DNA. Caso normale) senescenza cellulare Più importante dell accorciamento del telomero è probabilmente la perdita del cappello del telomero. Le estremità del DNA cromosomale sono quindi esposte e riconosciute dalla cellula come una rottura del doppio filamento, che viene percepito come un danno al DNA, scatenando il checkpoint mediato da p53, che causa un arresto della crescita e l ingresso in senescenza. Caso raro) cancro Se però una rara cellula nella popolazione ha acquistato una mutazione in p53 o in checkpoints del ciclo-cellulare può ignorare questo segnale e continuare a dividersi entrando in un ciclo di rottura-fusione-ponte che causa un massiccio danno cromosomale / instabilità cromosomica.

33 Alcune cellule possono sopravvivere riattivando la telomerasi, che arresta il ciclo catastrofico e ripristina una sufficiente stabilità cromosomica per la sopravvivenza cellulare. Queste cellule danneggiate possono accumulare ulteriori mutazioni e condurre al cancro.

34 Ad ogni modo la senescenza cellulare è importante, prima che la cellula accumuli numerose mutazioni per diventare cancerosa, così l arresto della crescita indotto dai telomeri corti è automaticamente un potente meccanismo anti-tumorale.

35 Telomerasi e cancro 90% dei tipi di cancro umano mostra riattivazione della telomerasi per mantenere la lunghezza dei telomeri. Generalmente il meccanismo per la trasformazione di cellule umane in coltura coinvolge generalmente 3 passaggi: 1. Attivazione della proliferazione; 2. Inattivazione dei soppressori tumorali p53 e Rb; 3. Attivazione della telomerasi con l espressione di htert. NB: non sempre è necessario l ultimo passaggio (in alcuni casi può essere anche inattivato un repressore di htert come Menin al posto dell espressione di htert).

36 Tessuti tumorali mostrano elevati livelli di htert

37 Ad ogni modo la telomerasi rappresenta un importane target sia per le diagnosi del cancro sia per lo sviluppo farmaceutico di agenti terapeutici anti-cancro.

38 La terapia anti-telomerasica:?? - Può essere un trattamento opzionale contro il cancro in combinazione con la chirurgia, trattamento con raggi e chemioterapia, quando il carico di tumore è minimo; - Può essere usata per le micro-metastasi per prevenire quindi il ritorno del cancro; - Deve avere un basso profilo di tossicità per le cellule trattate (i relativi farmaci devono essere facilmente somministrabili); - Deve essere discontinua in modo da non intaccare le cellule staminali e le cellule riproduttive evitando di distruggere la loro funzione (dopo che le cellule cancerose sono morte).

39 Tecniche di citogenetica molecolare Chromosome Painting grazie all uso di sonde che ibridano interi cromosomi, permette di identificare i cromosomi in cellule in metafase ed in interfase. La marcatura fluorescente di uno specifico cromosoma, permette di identificare ogni tipo di riarrangiamento tra questo cromosoma ed il resto del genoma.

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42 Q FISH Quantitative Fluorescence in situ Hybridization è una FISH quantitativa, negli ultimi anni utilizzata per la misura della lunghezza telomerica. Si basa sull uso di sonde telomeriche di PNA (Peptide Nucleic Acid) fluorescenti specifiche per alcune sequenze (es.ttaggg nell uomo). I valori di fluorescenza telomerica, che possono essere studiati per ogni singolo telomero, sono proporzionali alla lunghezza di tali strutture.

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44 CONCLUSIONI Lo studio dei telomeri è importantissimo per le sue implicazioni nel cancro umano; La scoperta della telomerasi ha risolto il problema della replicazione delle estremità cromosomali; Resta di capire come l enzima e le sue proteine associate interagiscano per mantenere la lunghezza del telomero.