Cor o t r e t e C os o t s it i uzi uz o i na U f f i f c i io i o S ta t mpa L g e ge e s ulla f e f c e o c ndazione e a ssist s ita

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1 La diagnosi pre-impianto Claudia Livi Centro DEMETRA Firenze Corte Costituzionale Ufficio Stampa Legge sulla fecondazione assistita La Corte ha dichiarato l illegittimità costituzionale dell art. 14, comma 2, della legge 19 febbraio 2004, n. 40, limitatamente alle parole ad un unico e contemporaneo impianto, comunque non superiore a tre. La Corte ha altresì dichiarato l illegittimità costituzionale del comma 3 del medesimo articolo nella parte in cui non prevede che il trasferimento degli embrioni, da realizzare non appena possibile, come previsto in tale norma, debba essere effettuato senza pregiudizio della salute della donna. La Corte ha dichiarato inammissibili, per difetto di rilevanza nei giudizi principali, le questioni di legittimità costituzionale degli articoli 6, comma 3, e 14, commi 1 e 4. Scoglio processuale Stabilire se la PGD fosse ammissibile all interno del sistema delineato dalla legge n.40 Se la Corte avesse ritenuto ancora controversa l ammissibilità della PGD, avrebbe dunque dovuto dichiarare l inammissibilità della questione per incompletezza del themadecidendum: : così argomentando, la questione si sarebbe dovuta sollevare anche sull art. 13. La Corte costituzionale, allora, non pronunciandosi sul punto, ammette implicitamente che il presupposto del giudizio, e cioè l ammissibilità della diagnosi preimpianto, sia indiscutibile. Possiamo quindi affermare, alla luce del presupposto della decisione, che oggi è lecito ricorrere alla PGD quando ciò sia necessario per far conoscere ai genitori lo stato degli embrioni e, di conseguenza, per tutelare la salute psico-fisica della donna COS E LA PGD? Si intende l insieme di quelle procedure che consentono di diagnosticare una malattia genetica nell embrione, prima del suo impianto nell utero materno. Per molte coppie la PGD offre una alternativa più accettabile rispetto alla diagnosi prenatale e all interruzione di una gravidanza già avviata AMCI San Miniato 1

2 Cos e la PGD? E una tecnica che si e sviluppata per pazienti a rischio di trasmettere una anomalia genetica ai loro bambini La PGD può essere applicata alle malattie monogeniche per le quali sia possibile l analisi molecolare basata sull amplificazione enzimatica in vitro del DNA. Cio comprende: a) malattie autosomiche recessive (beta talassemia, fibrosi cistica, etc.) b) malattie autosomiche dominanti (distrofia miotonica) c) malattie legate alla X (Distrofia Muscolare Duchenne, X-Fragile, emofilia) d) Portatori di traslocazioni bilanciate che siano ad alto rischio fallimento di impianto e aborti ripetuti Classificazione dellapgd in base al tipodi cellula analizzata 1^ Globulo Polare (1PB) Diagnosi Pre-Concepimento (prima delle fecondazione) per coppie con problemi etici 1^ e 2^ Globulo Polare (1PB+2PB) analisi sequenziale Embrioni allo stadio di clivaggio (day-3): Blastomeri Blastocisti Quando eseguire l analisi del GP? Solo per le mutazioni di origine materna e per le aneuploidie Il primo GP viene rimosso tra le 36 e le 42 ore post-hcg (= fino a 6 ore dopo il prelievo ovocitario) E preferibile rimuovere i due GP in sequenza (= day 0 day 1) per poter diagnosticare rimaneggiamenti fra il primo ed il secondo GP ESHRE PGD Consortium, Human Reproduction2010 Biopsia del globulo polare Biopsia dell embrione Biopsia della blastocisti Evita la manipolazione e la selezione degli embrioni e quindi i problemi etico-giuridici ad essa collegati Presenta pero un rischio di errore diagnostico molto elevato, che si riduce se viene seguita dall analisi del II Globulo polare Il II Globulo polare viene pero prodotto dopo la fecondazione, quindi ripresenta i limiti etici della PGD AMCI San Miniato 2

3 Biopsia del globulo polare Biopsia dell embrione Biopsia della blastocisti Biopsia del blastomero Il 90% di tutti i cicli riportati dall ESHRE PGD Consortium si riferiscono alla biopsia del blastomero Il prelievo viene effettuato in Day3 ( = embrione a 6-8 cellule) Si escludono gli embrioni di cattiva qualita, che generalmente non consentono una diagnosi certa La diagnosi si esegue con la tecnica della PCR, che permette di amplificare la quantita esigua di DNA presente in una cellula Biopsia del globulo polare Biopsia dell embrione Biopsia della blastocisti Viene effettuata nella mattina del 5-6 giorno post-inseminazione E minore il rischio di mosaicismo Possono essere rimosse molte piu cellule E tecnicamente piu facile Si riduce il numero di embrioni da biopsiare, poiche non tutti raggiungono questo stadio Non influisce negativamente sull impianto e sullo sviluppo dell embrione Milano, Congresso SIGO 2010 AMCI San Miniato 3

4 PGS: premesse L evoluzione della PGS: l Array-CGH (Comparative Genomic Hybridization) La PGD non fornisce info sufficienti sull assetto cromosomico, uno degli aspetti piu importanti della vitalita dell embrione Le anomalie del numero di cromosomi ( aneuploidie) sono molto frequenti negli ovociti e negli embrioni, e aumentano marcatamente con l avanzare dell eta materna Oltre i 40 anni, la proporzione degli ovociti aneuploidi supera il 50% Gli embrioni prodotti da ovociti anomali hanno aneuploidie in tutte le cellule e si sa che questi embrioni hanno una scarsa probabilita di dar luogo a gravidanze evolutive ( >60% degli AS nel primo trimestre) Array-CGH: tecnica innovativa che consente l analisi dell intero assetto cromosomico dell embrione. Tale procedura permette di identificare anomalie cromosomiche di tipo numerico (aneuploidie) a carico dei 22 autosomi (cromosomi dal nr. 1 al nr. 22) e dei cromosomi sessuali (X e Y). E possibile inoltre evidenziare variazioni del contenuto di piccole porzioni cromosomiche, come amplificazioni (duplicazioni), delezioni e traslocazioni sbilanciate. Per gentile conc. Lab. GENOMA - Roma 24 chromosomes aneuploidy screening NORMAL Per gentile conc. Lab. GENOMA - Roma AMCI San Miniato 4

5 Blastocyst biopsy 24 chromosomes aneuploidy screening: -1, -4, -8, -9, -16, -19, Per gentile conc. Lab. GENOMA - Roma Per gentile conc. Lab. GENOMA - Roma Un barlume di speranza Wells 2008: - Studiati pz con fallimenti di impianto - Effettuata biopsia al 5 giorno - Embrioni vitrificati - CGH 24 cromosomi = - Screening totale di tutti i cromosomi - IR circa del 70% Non PGS vs PGS in età materna avanzata Età materna >38 aa Gravidanza Aborto spontaneo No PGS Congelamento di tutte le blastocisti e successivo trasferimento PGS con arraycgh Congelamento di tutte le blastocisti e successivo trasferimento 33% 28% 50% 10% Safe Fertility and Genetics, PGDIS 2013 Istanbul AMCI San Miniato 5

6 Pre-implantation geneticscreening (PGS) Età materna avanzata : pazienti con età uguale o superiore a 38 anni,, in cui la riduzione della potenzialità riproduttiva con il progredire dell età potrebbe essere attribuita ad elevate percentuali di embrioni con aneuploidie cromosomiche. Ripetuti fallimenti d impianto : pazienti che hanno avuto un fallimento in tre o più cicli di trattamento FIVET o ICSI. Abortività ricorrente : pazienti nella cui storia riproduttiva si annoverano tre o più aborti spontanei, non dovuti a cause meccaniche quali patologie dell utero (fibromi, malformazioni congenite, etc.), o altri fattori (es. difetti della coagulazione, autoimmunità, traslocazioni cromosomiche, etc.). Mosaicismo cromosomico : pazienti con un cariotipo alterato a causa della presenza di linee cellulari a mosaico a carico dei cromosomi sessuali o gonosomi. Infertilità maschile grave : pazienti azoospermici o OAT che devono ricorrere al prelievo di spermatozoi dalle vie seminali mediante le tecniche microchirurgiche di MESA e TESE e che hanno fallito almeno un ciclo ICSI in precedenza. Verlinsky e Kuliev, 2010 Effectof D3 biopsyand blastocyst biopsy PGS vs PGD Implantation rate Cleavage stage Biopsy Not Blastocyst Biopsy Not 31% 53% 52% 54% P<0.05 (42% reduction) N.S. PGDIS Istanbul 2013 AMCI San Miniato 6

7 Array-CGH, biopsia della blastocisti e vitrificazione: risultati clinici Cicli Età materna n. di cicli falliti Embrioni trasf. Impianti (+ sacco gest.) CGH % Controllo % P=< Stadiobiopsia Nessun risultato: D3 vs D5 Embrioni non diagnosticati RangeCentri (>20 cicli di biopsie) Cleavage 3,2 1% - 5% Blastocisti 2,3 0% - 18% Schoolcraftet al (2010) Fertil Steril, 94:170 Con esperienza Meno esperti Gutierrez-Mateo (Fertil Steril 2011): Dati Reprogenetics su 9049 embrioni Un bilanciamento.. Ogni passaggio ha un costo per l outcome Fattori positivi Fattori negativi % di impianto Scarsa risposta alla stimolazione Numero di embrioni Qualità degli embrioni Recettività endometriale Embriologinon formati (l embrione biopsiato risente maggiormente delle condizioni del lab) Biopsia (una tecnica non adeguata ha costi maggiori) Timing biopsia (costi diversi a stadi diversi) Analisi (unaanalisi analisi modesta fa perdere buoni embrioni) Transfer (fresco vs congelato) PGD/PGS 2014 (Centro Demetra) Totale cicli 53 Età media 35,2 Totale ovociti 485 Totale MII 350 Fertilizzazione 254 Clivaggio 245 % formazione blastocisti da clivati 55% = 135 Totale embryo transfer 15 Gravidanze/transfer 7 AMCI San Miniato 7

8 Centri che effettuano PGD/PGS in Italia Conclusioni Coppie con problemi genetici +/- infertilita - Figlio con malattia (RR:25%) - Un partner affetto (RR:50%) La PGD e una soluzione!!! La PGS e una soluzione? Coppie infertili che si sottopongono a cicli IVF/ICSI: - Partner femminile oltre 38 anni - Cicli ripetutamente falliti - Aborti ricorrenti Inoltre, alcune regioni hanno individuato o cercato di individuare in una ottica di ottimizzazione nella distribuzione delle risorse criteri di selezione delle pazienti: - Eta - Numero di cicli AMCI San Miniato 8

9 AMCI San Miniato 9