SEROTONINA ( 5-IDROSSITRIPTAMINA ) SIERICA IN FLUORIMETRIA - FAST Codice Z15110
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1 SEROTONINA ( 5-IDROSSITRIPTAMINA ) SIERICA IN FLUORIMETRIA - FAST Codice Z15110 BIOCHIMICA La Serotonina (PM=176,22) è un composto biologico che presenta, come unità strutturale, il gruppo indolico. Deriva dalla biotrasformazione (idrossilazione e decarbossilazione) dell'aminoacido Triptofano, e tale gruppo viene chiamato triptaminico. Il metabolismo inizia con la trasformazione del Triptofano in 5-Idrossitriptofano ad opera della triptofano-idrossilasi e prosegue con la successiva decarbossilazione che porta alla formazione della 5-Idrossitriptamina ( Serotonina ); questa viene deaminata ossidativamente a livello del fegato ad opera della MonoAminoOssidasi (MAO) e trasformata in Acido 5-Idrossiindolacetico che viene eliminato con le urine sia in forma libera che coniugato con l Acido glucuronico (fig. 1). Nel sangue la Serotonina è veicolata dalle piastrine. NH 2 HO NH 2 CH 2 CH COOH CH 2 CH COOH CO 2 N H N H triptofano 5-idrossi-triptofano HO NH 2 HO CH 2 CH 2 NH 3 CH 2 COOH O 2 N H N H 5-idrossi-triptamina ac. 5-idrossi-indol-acetico Figura 1: Metabolismo del triptofano. PATOLOGIA La Serotonina è una ammina dotata di importanti e molteplici effetti biologici; stimola la contrazione della muscolatura liscia del tubo gastroenterico, dei bronchi, della vescica, dei vasi sanguigni, oltre che essere coinvolta nella funzione cerebrale e nel meccanismo dell'emostasi. Al riversamento in circolo di elevate quantità di Serotonina è dovuta una serie di alterazioni di meccanismi funzionali e di alterazioni anatomiche che, nel loro insieme, formano il quadro della sindrome da carcinoide; disturbi intestinali, circolatori, cutanei (flush), senso di calore, tachicardia, fenomeni asmatici, cefalee e nel tempo si può instaurare una sclerosi delle valvole semilunari polmonari e della tricuspide. La diagnosi di "sindrome carcinoide" si basa, oltre che sulla sintomatologia clinica, sulla dimostrazione di un aumento nel sangue della Serotonina e di una aumentata eliminazione urinaria di Acido 5-Idrossiindolacetico. CHIMICA E DOSAGGIO MEDIANTE TECNICA HPLC La Serotonina è isolabile con difficoltà dal siero mediante estrazione liquido-liquido e le rese estrattive non sono mai quantitative; si può isolare con colonne clean-up ma tali metodi sono lunghi e complessi. Il presente metodo consente di purificare in modo semplice e completo la Serotonina trattando il siero con un deproteinizzante organico e, dopo aver aggiunto uno stabilizzante, determinarla in modo quantitativo in HPLC. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N 001 Serotonina sierica in Fluorimetria - FAST Marzo
2 CARATTERISTICHE DEL KIT Principio del Metodo : La Serotonina o 5-Idrossitriptamina o 5 HT viene isolata trattando il siero con opportuno precipitante. Dopo l aggiunta di una soluzione stabilizzante, 10 µl vengono direttamente iniettati in HPLC. Recupero del Metodo : >98 % Sensibilità Analitica (LLOD) : Minima Concentrazione Analizzabile (LLOQ): Linearità del Metodo : Valori di Normalità nel Siero: 3 µg/l 10 µg/l 2, µg/l µg/l Accuratezza intra serie (errore relativo %) : Ci Cs 50 µg/l 150 µg/l 7,2% 3,5% Accuratezza inter serie (errore relativo %) : Ci Cs 50 µg/l 150 µg/l 10,0% 3,8% Riproducibilità intra serie (coefficiente di variazione %) : Cl Cm Cs 40 µg/l 100 µg/l 200 µg/l 8,2% 5,5% 2,7% Riproducibilità inter serie (coefficiente di variazione %) : Cl Cm Cs 40 µg/l 100 µg/ml 200 µg/ml 10,8% 6,7% 3,1% Coefficiente di correlazione R 2 + Dev Std 0, ,0021 Contenuto della confezione : Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a Temperatura Ambiente ( 20 C). Il Calibratore è stabile 36 mesi a 2 8 C. Reagente A - Soluzione deproteinizzante con Standard Interno, 1 x 40 ml Reagente B - Soluzione stabilizzante, 1 x 20 ml Reagente C Soluzione Test, 1 x 5 ml Stoccare a 2-8 C Reagente D - Calibratore liofilo, 1 x 2 ml Vedi Avvertenze Reagente M - Fase mobile, 3 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta: Strumento HPLC isocratico con loop da 10 µl Detector Fluorimetrico λ ex =285 nm λ em =344 nm 2
3 Modalità di prelievo ematico e conservazione del siero : Prelevare 7 ml di sangue venoso in una provetta senza anticoagulante e senza gel. Centrifugare subito dopo a rpm per 5 minuti. Separare il siero e stoccarlo in congelatore a -20 C fino al momento dell analisi. Stabile oltre 2 mesi. NOTA : Se arriva in Laboratorio un campione di sangue prelevato con anticoagulante lo si può comunque analizzare avendo cura di centrifugarlo a < 150 rpm o lasciandolo decantare spontaneamente. Questo perché la 5 HT è contenuta in massima parte nelle piastrine, le quali rimangono sospese nel plasma solo se il plasma viene centrifugato ad una velocità inferiore a 150 rpm. Fase pre-analitica : Scongelare velocemente il campione di siero e analizzarlo immediatamente. AVVERTENZA : Poiché la Serotonina è contenuta quasi esclusivamente nelle piastrine, si potrebbero avere falsi valori patologici in caso di grande aumento o grande diminuzione delle piastrine circolanti. Per ovviare a queste eventualità è buona norma determinare il contenuto delle piastrine nel campione di siero e rapportare il valore di concentrazione della Serotonina al reale contenuto delle piastrine circolanti. 3
4 PROCEDURA PREANALITICA Preparazione dello Soluzione Test In una provetta pipettare : 900 µl di H 2 O di grado HPLC 100 µl di Reagente C Soluzione Test INIEZIONE : Iniettare 10 l della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Verificare che la Sol. Test abbia tempi di ritenzione simili a quelli riportati in fig. 2. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Importante : Questa Soluzione così ottenuta non deve essere usata come calibratore PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Preparazione dei Campioni, dello Standard e dei Controlli Dispensare in provette idonee da centrifuga in sequenza : Bianco Calibratore Campione Acqua di grado HPLC 200 µl Reagente D Calibratore liofilo 200 µl Campione 200 µl Reagente A Sol. Deproteinizzante + Standard interno 400 µl 400 µl 400 µl Attenzione: si consiglia di deproteinizzare direttamente sul Vortex per almeno 10 secondi FASE 2 : Centrifugare a rpm per 10 minuti FASE 3: Prelevare 200 µl di sovranatante limpido e aggiungere 200 µl di Reagente B Sol. stabilizzante Al vortex per 10 secondi N.B.: il campione così preparato è stabile 3 giorni a 2-8 C INIEZIONE : Iniettare 10 µl del sovranatante nel Cromatografo HPLC e attendere la stampa del cromatogramma. Release N 001 Serotonina sierica in Fluorimetria - FAST Marzo
5 REAGENTE C : SOLUZIONE TEST SEROTONINA SIERICA - Avvertenze SEROTONINA circa µg/l REAGENTE D : CALIBRATORE LIOFILO - Lotto n 005 SEROTONINA Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema HPLC. Aggiungere esattamente 2 ml di H 2O e agitare delicatamente per 15 minuti fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Conservazione e stabilità : i Calibratori liofili sono stabili 36 mesi dalla data di preparazione se conservati a 2 8 C. Almeno 7 giorni se conservati a 2 8 C e 1 mese a -20 C una volta ricostituiti. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 1 x 2 ml Precauzioni : questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. 174,5 µg/l PARAMETRI DEL DETECTOR FLUORIMETRICO λ 285 nm λ 344 nm GAIN 1 x 100 PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare il sistema completo POROSHELL 120 EC-C18 (50 x 4,6 mm, 2,7 µ) è tassativo l uso del Prefiltri Javelin (1 x 10 pz), cod. S CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova POROSHELL 120 EC-C18 (50 x 4,6 mm, 2,7 µ). Disconnettere il detector Fluorimetrico e far passare 30 ml di una soluzione di H2O : Metanolo (20 : 80 v / v) al flusso di 1,0 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Far passare 30 ml di una soluzione di H 2O : Metanolo (80 : 20 v / v) al flusso di 1,0 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1 ml/minuto e scaricare i primi 20 ml. Al termine, iniettare il test chimico e verificare la congruità della separazione. NON è possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA Disconnettere il detector. Flussare 15 ml di H2O : Acetonitrile o Metanolo (80 : 20 v / v) al flusso di 1,0 ml/minuto e scaricare. Flussare una soluzione di H2O : Acetonitrile o Metanolo (30 : 70 v / v) per 30 minuti scaricandola. Si raccomanda di eseguire il lavaggio della Colonna Analitica alla fine di ogni seduta analitica. La colonna va stoccata in una soluzione di H2O : Acetonitrile o Metanolo (30 : 70 v / v) LAVAGGIO AGO INIEZIONE PARAMETRI HPLC Lavare con una soluzione di Acqua / Etanolo o Metanolo o Acetonitrile (80 : 20 v/v). LOOP 10 µl Flusso di lavoro consigliato 1,0 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 130 bar 5
6 ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z15016 Calibratore sierico per Serotonina 4 x 2 ml Z15017 Controllo sierico per Serotonina-Livello 1 5 x 2 ml Z15018 Controllo sierico per Serotonina-Livello 2 5 x 2 ml Z15019 Controllo sierico per Serotonina-Livelli 1 e 2 2 x 5 x 2 ml Z Colonna Analitica Poroshell 120-EC-C 18 (50 x 4,6mm 2,7 um) 1 PZ S Prefiltri Javelin 1 x 10 PZ S29307U Vial di vetro a volume ridotto da 1,5 ml a 15 ul + tappini 1 x 100 PZ 6
7 SEROTONINA SIERICA ( Cromatogrammi di Riferimento ) Fig. 2 Soluzione Test Fig. 3 Calibratore sierico liofilo R.T Serotonina R.T Standard Interno R.T Serotonina 174,5 µg/l 7
8 SEROTONINA SIERICA ( Cromatogrammi di Riferimento ) Fig. 4 Controllo sierico liofilo livello 1 Fig. 5 Controllo sierico liofilo livello 2 R.T Standard Interno R.T Standard Interno R.T Serotonina 101,7 µg/l R.T Serotonina 253,9 µg/l 8
SEROTONINA ( 5-IDROSSITRIPTAMINA ) SIERICA IN FLUORIMETRIA Codice Z15010
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