Fosfolipidi. molecole anfipatiche. fosfatidilcolina sfingomielina. fosfatidilserina fosfatidiletanolamina. idrofoba

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1 Fosfolipidi molecole anfipatiche fosfatidilcolina sfingomielina idrofoba fosfatidilserina fosfatidiletanolamina

2 Allelomorfi o geni alleli o alleli: geni alternativi ognuno dei quali occupa un determinato locus su un cromosoma. Quando i due loci di una coppia di cromosomi sono occupati da geni identici la persona viene definita omozigote per quel gene e l antigene da essi controllato viene prodotto in dose doppia: effetto dose. Quando i due loci sono occupati da geni differenti la persona viene definita eterozigote ed ogni antigene viene prodotto in dose singola. eterozigosi omozigosi

3 Fenotipo: espressione visiva dei caratteri di una persona o il risultato di alcuni esami (occhi azzurri, gambe lunghe, capelli biondi, sangue di gruppo A ecc.). Genotipo: costituzione genetica della persona che produce i caratteri ereditari. Non è dimostrabile direttamente ma può essere solo dedotto e come ogni deduzione comporta un possibile errore; viene perciò definito come genotipo probabile. Gene: dominante, recessivo, amorfo, codominante.

4 Fenotipo Genotipi A AA A0 B BB B0 AB AB Geni A e H B e H AB e H H

5 I geni che presiedono alla sintesi di proteine sono detti geni strutturali e talvolta hanno la necessità di una azione preventiva da parte di altri geni strutturali Galattosio N-acetilglucosamina Galattosio

6 Sistema AB0 tre alleli fondamentali: A, B, 0 cromosoma sede dei loci: 9 il gene 0 non produce alcun antigene dimostrabile ed è perciò detto amorfo i geni A e B sono dominanti rispetto al gene 0 ma codominanti tra loro; è necessaria la preventiva azione del gene H; gli antigeni prodotti sono stabili per tutta la vita e sono presenti anche in alcuni liquidi organici qualora il soggetto abbia in forma omozigote od eterozigote il gene secretore Se (Se/Se o Se/se). L omozigosi se/se comporta la non secrezione degli antigeni.

7 Il gene H ed il suo allele h (cromosoma 19) vengono ereditati indipendentemente dagli alleli A, B e 0; nel raro caso in cui non viene ereditato nessun gene H, e pertanto il genotipo è h/h, non viene prodotta alcuna catena precursore e pertanto i geni A e/o B, pur se presenti, non possono estrinsecare la loro azione. Si configura in tal caso il rarissimo fenotipo 0 Bombay indicato come AB0 null o anche 0 h. I soggetti, se in possesso del gene Se possono esprimere l antigene A e/o B nelle secrezioni. è dominante rispetto al suo allele h e pertanto è espresso sia in forma omozigote (H/H) che eterozigote (H/h);

8 Talvolta vengono ereditate delle varianti dei geni A e B evidenziabili per una diversa reattività dell antigene dovuta alla differenza della transferasi prodotta. Ciò porta alla classificazione dei soggetti in ulteriori sottogruppi. Circa 80% dei soggetti A è del sottogruppo A 1 il restante è A 2. La transferasi dell A 2 si è mostrata meno efficace nel convertire le catene H in catene A. A1 A2

9 G. Assali 2010 modificata

10 Come definire il gruppo ABO N.B. Se il soggetto ha espresso sui suoi globuli rossi un determinato antigene ha presente nel plasma l anticorpo naturale (IgM) diretto verso quello mancante. Test diretto si cimentano globuli rossi del soggetto con anti sieri specifici. Test indiretto si cimenta siero o plasma del soggetto con globuli rossi noti.

11 Test diretto globuli rossi del soggetto con anti sieri naturali ottenuti da persone A, B e 0 o monoclonali. A B AB Test indiretto o di Simonin- Michon plasma del soggetto con globuli rossi noti. A1 A2 B ESITO % A 41 B AB 4 La reazione è svelata dall agglutinazione.

12 Anti- A Anti- B Anti- Rh

13 Tecniche vetrino- piastra 1 gt. antisiero + 1 gt. di sangue; provetta micropiastra schedina 2 gtt. di antisiero + 1 gt. di emazie sospese al 5% in sol. fis.; come da indicazione della ditta fornitrice del sistema; come da indicazione della ditta fornitrice del sistema. ABO fine

14 Falsi negativi errata identificazione mancata aggiunta di antisiero errato rapporto antisiero-cellule centrifugazione insufficiente mancata evidenza di emolisi debole espressione degli antigeni pazienti affetti da malattie ematiche siero di neonati Cause di errore Tecnici Emazie Siero basso tasso di IgM (anziani, immunodep.) trapianto di midollo con AB0 diverso plasma-exchange (diluizione) Falsi positivi errata identificazione contaminazione degli antisieri errato rapporto antisiero-cellule centrifugazione eccessiva vetreria sporca attività B acquisita impilamento trapianto di midollo con AB0 diverso

15 In data ci è pervenuto, dal centro unico di prelievo di Muraglia, il campione di sangue di P.L., nata il , con richiesta di gruppo sanguigno. Il campione è risultato A Rh negativo. Nell archiviare il dato il sistema ci ha allertato di una incongruenza. La paziente risultava in precedenza tipizzata a Fano come AB Rh negativo. Abbiamo attivato tutte le verifiche del caso: analisi delle precedenti reazioni, peraltro effettuate con strumentazione automatica e trasferimento telematico degli esiti senza interposizione umana, ed interrogato il personale amministrativo che aveva preso in carico la richiesta, per accertarci della corretta identificazione del paziente all atto del prelievo. L impiegata ricordava bene che la paziente era senza documento di riconoscimento che noi chiediamo sempre di allegare, in copia, alla richiesta di gruppo. Correttamente ci aveva contattato per sapere come comportarsi e le abbiamo detto di segnalare la mancanza del documento sulla copia della impegnativa e di dire alla paziente che lo avrebbe dovuto produrre al ritiro del referto. Infine abbiamo contattato telefonicamente la paziente. Con nostro stupore la sig.ra P.L. ha affermato di non aver eseguito il prelievo in quanto aveva smarrito le impegnative - non sapeva dove- e sapeva di essere AB Rh negativo.

16 Problemi biologici Ridotta presenza Ag/Ab gruppospecifici B acquisito Auto/allo anticorpi freddi Anticorpi anti H Varianti deboli dei gruppi sanguigni Errata interpretazione reazione emolitica Reazione verso additivi Problemi clinici (trapianto, linfomi ) Presenza di fibrina

17 Ridotta presenza antigeni o anticorpi gruppo specifici Diretta: neonati, pazienti anziani, soggetti secernenti antigene solubile che neutralizza l antisiero utilizzato riducendo la sua azione agglutinante Indiretta: per potenziare la reazione sieroemazie note, porre in frigo per 30 quattro gocce di siero/plasma in una provetta con una goccia di emazie note; leggere agitando leggermente e dopo centrifugazione

18 B acquisito In alcune forme tumorali (prevalentemente intestinali), soprattutto nei soggetti A1, da parte di enzimi di origine batterica viene modificata parzialmente la struttura dell antigene A (N-acetilgalattosamina) facendola assomigliare al galattosio. Il quadro è di una forte reazione con anti-a, debole reazione con anti-b ma forte reazione siero-emazie B. Con gli anticorpi monoclonali questo quadro è meno o non più evidente.

19 Presenza di anticorpi In caso di incongruenza tra prova diretta ed indiretta, con agglutinazione inattesa delle cellule screening, occorre in primis effettuare una ricerca anticorpale a freddo. Anti-M, anti-i possono reagire con i rispettivi antigeni presenti sulle emazie test. In questo caso l anticorpo implicato era un anti-c ad ampio excursus termico.

20 Anticorpi anti H La presenza di sostanza H sui globuli rossi ha una concentrazione in ordine decrescente da soggetti di gruppo 0-A2-B-A2B-A1 ed A1B. Una reazione alla Simonin Michon inattesa (agglutinazione di emazie A2 e 0) di un soggetto A1 deve far sospettare una simile evenienza.

21 Come approfondimento diagnostico si è allestita una tecnica di assorbimento-eluizione per accertare l eventuale capacità delle emazie di adsorbire la sostanza A. 1/2 Varianti di gruppo A 3, A x, A el. Le determinazioni in schedina ed in micropiastra hanno evidenziato con la metodica diretta un fenotipo 0 che alla Simon-Michon risultava A per la mancata agglutinazione sia delle emazie A1 che A2. La reazione con anti-h era di 4+. Anti-H Anti-A E stata quindi effettuata una determinazione Le a e Le b per accertare se la sig.ra fosse secretrice. L esito è stato Le a - Le b +, quindi secretrice. La sua saliva è stata pertanto centrifugata, inattivata a 100, quindi ricentrifugata ed analizzata per valutare la presenza sia di sostanza A che H. E risultata presente solo sostanza H.

22 Ricapitolando: anti A:-; anti B:-; anti AB:-; anti H:+++; anti Rh (D):+++ siero vs. emazie A1:+/-, emazie A2:-; emazie B:++; emazie 0:-; emazie autologhe:- nella saliva: presenza sostanza H. Su eluato: positività per assorbimento sostanza A. 2/2 Varianti di gruppo A 3, A x, A el. Pertanto una provetta di emazie lavate e sospese 1:2 con pool di plasma di donatori di gruppo 0 è stata lasciata incubare a 37 per 12h. Successivamente le emazie sono state lavate abbondantemente in soluzione fisiologica, risospese e poste a 56 C per 10 al fine di ottenere la eluizione. L eluato, come si può notare, cimentato con emazie A è risultato positivo.

23 Errata interpretazione reazione emolitica Nella prova indiretta può accadere occasionalmente che gli anticorpi naturali anti A ed anti- B invece di agglutinare lisino i globuli rossi noti. La mancata interpretazione della emolisi come risultato positivo può indurre in errore

24 Reazione verso additivi Le emazie dei pannelli, sia per la identificazione anticorpale che di gruppo noto, sono sospese in soluzioni additive (antibiotici, idrocortisone ecc.) che le preservano dal deterioramento biologico. Una panreattività può essere dovuta alla presenza di anticorpi nel siero del paziente che reagisce con tali additivi. Soluzione? Utilizzare emazie di donatori di gruppo A1, A2, B e 0 opportunamente lavate e sospese al 3% in sol. fisiologica.

25 Problemi clinici Pazienti trapiantati, precedentemente trasfusi o con malattie ematologiche o che hanno ricevuto immunoglobuline, possono presentare difficoltà interpretative. Su vetrino compare una agglutinazione a campi misti (50% agglutinato) o a cielo stellato (- del 50% è agglutinato). La differenza con le varianti deboli in schedina si valuta in quanto nei trasfusi ci sono due popolazioni nettamente distinte; nelle varianti deboli c è la dispersione lungo la colonna.

26 teoria di Fisher-Race Sistema Rh (Rhesus) gli antigeni principali del sistema Rh sono controllati da tre coppie di geni che occupano dei loci strettamente associati sullo stesso cromosoma; vi sono due o tre alleli per ogni locus il gene d è un gene silente in quanto non è visibile un prodotto associato alla sua presenza; la tripletta dei geni è così linked che vengono trasmessi come un aplotipo; sia il gene che l antigene hanno lo stesso simbolo; il gene viene indicato con la lettera in corsivo al sistema Rh si ascrivono quasi 50 antigeni.

27 teoria di Wiener Sistema Rh (Rhesus) due geni, uno per cromosoma, controllano l intera espressione del sistema Rh; esistono molti alleli di cui gli otto più importanti sono: R 0, R 1, R 2, R Z, r, r, r e r y ; ogni gene produce sul globulo rosso una struttura detta agglutinogeno che può essere identificato da parti di esso o fattori che reagiscono con gli antisieri specifici;

28 Fisher-Race Wiener Complesso genico Dce DCe DcE DCE dce dce dce dce Antigeni D, c, e D, C, e D, c, E D, C, E d, c, e d, C, e d, c, E d, C, E Geni Agglutinogeni Fattori R 0 Rh O Rh O, hr, hr R 1 Rh 1 Rh O, rh, hr R 2 Rh 2 Rh O, hr, rh R Z Rh Z Rh O, rh, rh r rh hr, hr r rh rh, hr r rh hr, rh r y rh y rh, rh

29 Definizione del fenotipo La prima determinazione da fare nella tipizzazione Rh è la distinzione del tipo Rh in positivo o negativo. Il termine positivo riguarda la sola presenza dell antigene D o della variante D u (vecchia classificazione) o Dweak sulla superficie eritrocitaria. Le emazie che presentano delle forme indebolite dell antigene D vengono classificate come D positive e possono essere descritte come D deboli la produzione di alloanticorpi anti-d, come avviene nei fenotipi D parziali, non è prevista Technical Manual XV ed.

30 Ogni eritrocita ha approssimativamente da a di recettori del sistema AB0, da a recettori del sistema Rh, da a del sistema Kell e da a del sistema Duffy. Da qui si comprendono le diverse intensità ed i differenti tempi di reazione con gli antisieri. Oggi gli epitopi dell antigene D sono stimati in oltre 30.

31 Le cause di difficoltà Le espressioni antigeniche D indebolite possono essere correlate a: 1) Alterazioni di tipo qualitativo dell antigene (D variant). 2) Alterazioni di tipo quantitativo (D weak) 3) Alterazioni di entrambi i tipi Alterazioni qualitative, senza delle evidenti alterazioni quantitative sierologicamente rilevabili, appaiono come un comune Rh+. G. Assali 2010 modificata

32 Cause genetiche quantitative Un esempio di alterazione quantitativa dell espressione del D si rileva nel genotipo DCe/dCe, ove il gene C presente nell aplotipo dce in posizione trans rispetto al D, determina un inibizione parziale dell espressione antigenica di un gene D che è strutturalmente normale. G. Assali 2010 modificata

33 Cause genetiche quantitative La maggioranza delle varianti D deboli che costituisce circa il 93% dei D deboli sierologicamente rilevabili nelle nostre popolazioni, è di tipo quantitativo ed espressa nelle varianti: Tipo 1 (valina 270 glicina), Tipo 2 (glicina 385 alanina) Tipo 3 (serina 3 cisteina) Tutti questi pazienti non sono esposti al rischio di una possibile alloimmunizzazione per l antigene D. G. Assali 2010 modificata

34 A seguito di mutazioni o di crossingover uno o più epitopi possono esser persi (delezione). Tale caratteristica viene trasmessa poi geneticamente (D u ereditario). La reazione può essere equivalente a quella del soggetto Rh positivo con una intensità di reazione più lieve o può essere necessario adottare delle tecniche di indagine più approfondita. La trasfusione di cellule dotate dell epitopo mancante può portare alla formazione di anticorpo specifico.

35 Considerazioni Questo non deve indurci in una paranoia da biologia molecolare. La frequenza delle varianti qualitative dell antigene D nelle nostre popolazioni non è cambiata, come non lo è l esigua incidenza dei soggetti D parziali immunizzati. Da questo incontro sono emersi solo 5 casi relativi a pazienti D positivi con alloimmunizzazione anti-d parziale. Uno dei pazienti presentava un espressione antigenica D debole, quattro non erano distiguibili sierologicamente da un comune D positivo. Tutti si erano immunizzati per delle trasfusioni con unità D+. G. Assali 2010 modificata In un incontro con i colleghi P. Strada (San Martino) e F. Picardi (Pesaro) abbiamo riassunto la nostra casistica personale sul problema formata su ampie aree geografiche del Paese in oltre 35 anni di attività professionale e consulenze.

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37 ma il D VI? Rhesus D category VI (DVI) is the clinically most important partial D Three molecular structures cause rhesus D category VI phenotypes with distinct immunohematologic features. Wagner FF1, Gassner C, Muller TH, Schonitzer D, Schunter F, Flegel WA. Blood Mar 15;91(6):

38 Considerazioni Quale strategia possiamo adottare per gestire razionalmente il problema dell antigene D debole? Per un ricevente che presenti un'espressione indebolita dell'antigene D (con degli score di reazione inferiori a 2+ nelle procedure in microcolonne), è opportuno adottare una strategia trasfusionale che consideri sia gli obiettivi clinici che gli aspetti gestionali delle risorse trasfusionali disponibili. Se è un maschio o una paziente in menopausa, e non sussistono indicazioni relative a varianti qualitative familiari dell antigene D, per ridurre il consumo delle scorte limitate di sangue D- si possono utilizzare unità D+, accettando l improbabile rischio di un immunizzazione per i partigeni del D per la scarsa possibilità che possa essere un D parziale. G. Assali 2010 modificata

39 Considerazioni Se invece è una paziente di sesso femminile in età fertile, o prepubere, anche se molto probabilmente non è realmente esposta a rischio è opportuno utilizzare del sangue Rh- per prevenire l improbabile possibilità di future incompatibilità materno-fetali in un possibile soggetto D parziale qualitativo con espressione antigenica indebolita. Per definire il fenotipo Rh negativo in un ricevente una doppia determinazione con due diversi sieri monoclonali che siano reattivi per quanto possibile in modo complementare con degli epitopi del D diversi è adeguata e, secondo alcuni autori, nei pazienti da sottoporre a trasfusioni può ritenersi superflua la determinazione del D debole con il siero antiglobuline. G. Assali 2010 modificata

40 Considerazioni Sieri monoclonali Sieri policlonali Du negativo anti- D: 0 anti-d: 0 anti- C: 0 anti-c: 0 anti- c: 3+ anti-c: 3+ anti- E: 0 anti-e: 0 anti- e: 3+ anti-e: 3+ anti- CDE: 0 anti-cde: 2+ G. Assali 2010 modificata Per i nuovi donatori risultati Rh- è consigliabile eseguire una ricerca della variante D debole anche con un affidabile diagnostico policlonale costituito da un ampio pool di sieri anti-d umani. Per i nuovi donatori risultati Rh negativi dccee é utile eseguire anche un controllo del fenotipo Rh con un potente siero policlonale anti- CDE di origine umana in alternativa al diagnostico monoclonale, come viene evidenziato dal caso di questo donatore.

41 Considerazioni G. Assali 2010 modificata Tutto questo viene spiegato dal fatto che il candidato donatore non é un comune fenotipo dccee ma é un raro fenotipo dc G cee. Se fosse stato trasfuso in riceventi dccee avrebbe indotto la produzione di un alloanticorpo anti-g che si sarebbe presentato come una miscela di anti- D + anti-c, un po difficile da spiegare per un ricevente del sangue di un donatore che risultava tipizzato come dccee.

42 Considerazioni Technical Manual XV ed. Gli anti-g appaiono come una miscela di anti-d + anti-c, ma la loro reattività non può essere separata nelle componenti anti-c e anti-d. Il fatto che il G appaia come un entità unica comprendente le specificità C e D spiega perché persone D negative immunizzate con eritrociti C D+ appaiono, qualche volta, aver prodotto anche un anti-c insieme con l anti-d e perché le persone D negative, esposte a emazie C+ D, producano anticorpi che sembrano contenere una componente anti-d. La differenziazione dell anti-d, anti-c e anti-g non è necessaria nella selezione pre-trasfusionale perché, virtualmente, tutte le emazie D e C sono anche G

43 Importanza della tipizzazione Rh il sistema Rh è rappresentato da molti antigeni di cui il più importante è l antigene D, (anche Rh 0 ). l importanza di questo antigene è dovuta al fatto che la presenza dell anticorpo anti-d nel siero può avere tragiche conseguenze. diversamente dal sistema AB0, nessun altro sistema eritrocitario, Rh compreso, ha espresso in circolo anticorpi naturali ; gli antigeni del sistema Rh non sono presenti nei secreti né in natura per cui il rilevamento di un anticorpo è testimonianza di un precedente esposizione ad eritrociti estranei -trasfusioni o passaggio feto/madre-. L antigene D era responsabile della quasi totalità delle incompatibilità materno-fetali; dal 1970 è in uso l immunoprofilassi delle donne Rh negative che ha drasticamente abbattuto tale patologia.

44 La tecnica di ricerca non si discosta da quella utilizzata per il sistema AB0, in pratica si cimenta un antisiero specifico (anti-d, anti-c, anti-c ecc.) con i globuli rossi da testare. Qualora non vi sia reazione (agglutinazione) nel test con anti-d occorre obbligatoriamente procedere per la ricerca del D weak. Gli antisieri inizialmente utilizzati erano frutto di una stimolazione immunitaria (IgG) e pertanto per renderli attivi in vetrino o provetta era necessario utilizzare sistemi potenzianti (carica proteica >10%); sono ormai in disuso. Si è poi fatto ricorso ad antisieri modificati con trattamenti chimici al fine di far loro acquistare alcune proprietà delle IgM e cioè la capacità di agglutinare emazie in soluzione fisiologica.

45 Le molecole anticorpali di classe IgM hanno in effetti la capacità, data la loro conformazione pentamerica, di agglutinare le emazie senza aggiunta di potenzianti. Attualmente si fa ricorso a miscele di antisieri monoclonali di classe IgM con aggiunta di antisieri policlonali di classe IgG. Cellule di topi portatori di mieloma non secernente, ibridate con cellule spleniche di topi immunizzati, portano alla produzione di un enorme quantità di anticorpi identici (stessa specificità, avidità e capacità biologica,). N.B. per la ricerca dell antigene D weak è obbligatorio utilizzare antisieri contenenti anticorpi di classe IgG.

46 Come detto non tutte le emazie possono tout court essere classificate positive o negative con il test di agglutinazione. Quelle che risultano negative vanno incubate con il siero anti-d contenente anticorpi di classe IgG in quanto, pur se non reagiscono in vitro o per delezione o per ridotta espressività antigenica, sono in grado di adsorbire l anticorpo. Al termine del periodo di incubazione le emazie eventualmente sensibilizzate, adeguatamente lavate, vanno cimentate con siero antiglobuline umane che ne evidenzia l avvenuta reazione. N.B. In caso di esito positivo è obbligatorio effettuare sul paziente il test di Coombs diretto. La ricerca dell anti-cde può dare informazioni sul tipo di D weak.

47 ANTIGENI Immunogenicità: capacità di una sostanza di stimolare la produzione del corrispondente anticorpo quando introdotto in un organismo che manchi dell antigene. Fattori la struttura chimica dell antigene (aptene, epitopo ecc.) il grado di estraneità la quantità di antigene inoculato la via di somministrazione

48 ANTICORPI Gli anticorpi sono proteine (gammaglobuline) prodotte in difesa dell organismo a seguito dell esposizione ad un immunogeno estraneo. La risposta primaria, in occasione della prima inoculazione, è piuttosto lenta necessitando da 20 gg. fino a sei mesi prima che si evidenzi l anticorpo che inizialmente è di tipo IgM per poi mutare in IgG che testimonia l avvenuto contatto.

49 Un secondo contatto con lo stesso immunogeno porterà ad una impennata della concentrazione dell anticorpo in poche ore o giorni- risposta secondaria anche detta risposta anamnestica-.

50 Reazione antigene- anticorpo Quando un antigene ed un anticorpo si legano, i legami non sono permanenti ma raggiungono uno stato di equilibrio dinamico Ag + Ab K 1 K 2 AgAb Le variabili che entrano in gioco nella reazione sono la temperatura, la forza ionica del mezzo di reazione, il tempo e la densità antigenica.

51 Temperatura La gran parte degli anticorpi clinicamente significativi reagisce in modo ottimale a 37 C (anticorpi caldi); altri mostrano una reattività a temperatura inferiore a quella corporea (anticorpi freddi). Si è soliti ritenere che i primi siano IgG ed i secondi IgM; la pratica ha evidenziato anche IgG attive a freddo.

52 Forza ionica del mezzo Da sempre quando si utilizzano globuli rossi come portatori di antigeni si utilizzano soluzioni isotoniche del plasma: soluzione fisiologica, ACD, CPDA ecc. Nella soluz. fisiologica l NaCl si dissocia producendo Na + e Cl - che si concentrano intorno al globulo rosso interagendo con gli anticorpi e rallentando il legame Ag-Ab.

53 Quando i g.r. sono sospesi in fisiologica una nuvola di ioni contorna una emazia: gli ioni Na+ sono attratti dalla superficie elettronegativa della cellula, mentre gli ioni Clsi dispongono all esterno formando un atmosfera intorno alla cellula. Il potenziale elettrico misurato tra la membrana cellulare e questa zona neutra è detto potenziale zeta.

54 Le soluzioni in cui la concentrazione di Na + e Cl - è inferiore a quella della fisiologica vengono dette soluzioni a bassa forza ionica LISS (low ionic strenght solutions). L utilizzo di queste soluzioni riduce drasticamente il tempo di reazione necessario.

55 Nella ricerca anticorpi la LISS (0,03 I) sostituisce la sol. fisiologica che ha una I di 0,15. Analizziamo il dettaglio delle forze ioniche: siero 0,16 LISS 0,03 salina 0,15 1gt. siero+1 gt. salina 0,15 1gt. siero+1gt. LISS 0,09 Forza ionica critica per: autoagglutinazione 0,03 limite di sicurezza 0,07

56 A seguito dell abbassamento della forza ionica a 0,09 gli Ab aumentano la velocità cinetica e si avvicinano agli eritrociti aderendo alla loro superficie in quantità fino a 1000 volte nell unità di tempo. N.B. La LISS rende soltanto più veloce la ricerca consentendo la riduzione dei tempi di reazione e non aumenta la concentrazione dell anticorpo.

57 Un abbassamento della forza ionica porterebbe ad un addensamento delle globuline sulla superficie eritrocitaria cosicché le cariche elettrostatiche dei g.r. sarebbero neutralizzate con il risultato dell aggregazione spontanea dei g.r. dando un quadro di falsa agglutinazione.

58 Agglutinazione eritrocitaria su base immunologica Rouleaux eritrocitario: aggregazione da riduzione forze di repulsione

59 Se è vero che difficilmente con una forza di 0,03 ci sia l aggregazione, è sicuramente possibile un aspecifico addensamento di Ig e complemento sui g.r. e queste possono reagire con le anti-igg e complemento nel siero di Coombs. Questo adsorbimento non avviene a forza I di 0,09. Se dovessero verificarsi la responsabilità è da ascrivere evidentemente ad un mancato rispetto delle procedure tecniche.

60 1 gt. siero = 0,16 1 gt. LISS = 0,03 0,19/2 ggt. = 0,09 ottimale 2 gtt. siero (0,16) = 0,32 2 gtt. LISS (0,03) = 0,06 0,38/4 ggt. = 0,09 ottimale 3 gtt. LISS (0,03) = 0,09 1 gt. siero (0,16) = 0,16 0,25/4 = 0,06 possibili falsi positivi 4 gtt. siero (0,16) = 0,64 1 gt. LISS (0,03) = 0,03 0,67/5 = 0,13 possibili falsi negativi

61 Il PEG Il polietilenglicole (PEG) è un additivo per potenziare le reazioni antigene-anticorpo. Si ritiene che il PEG promuova l adesione anticorpale facendo sì che le molecole anticorpali e l antigene possano porsi in stretta prossimità, determinando un aumento delle collisioni anticorpo-cellula con conseguente legame dell anticorpo. Viene utilizzato nelle microcolonne polispecifiche.

62 Densità antigenica La densità dell antigene svolge un ruolo importante; per comprenderne il significato basti pensare che la densità degli antigeni del sistema AB0 è di circa /cellula contro i poco più di del sistema Rh 0 (D). Ciò spiega l intensità di reazione che contraddistingue la tipizzazione AB0 da quella degli altri sistemi.

63 Interazione antigene-anticorpo Molti anticorpi anti-eritrocitari reagiscono con il corrispettivo antigene senza determinare in vitro alcuna reazione visibile. Si tratta di molecole anticorpali di classe IgG che legano un solo frammento Fab al sito antigenico; tali anticorpi sono detti sensibilizzanti. Le cellule che portano questi anticorpi sensibilizzate ed in vivo vengono distrutte per sequestrazione dalla milza.

64 Il motivo del mancato ponte tra due cellule è dovuto al fatto che la naturale tendenza delle cellule ad aggregare è contrastata da forze repulsive che determinano la distanza minima tra loro che è maggiore dell ampiezza delle braccia delle IgG. La distanza minima è mantenuta dalla carica negativa che circonda i g.r. ed è determinata dal gran numero di catene di acido sialico attaccato alle catene proteiche.

65 Oltre la LISS, di cui si è detto, un altro mezzo per ridurre le forze di repulsione è quello che cambia direttamente la carica negativa delle cellule dovute all acido sialico. Gli enzimi proteolitici, quali tripsina, papaina, ficina e bromelina, sono in grado di scindere alcuni legami delle proteine privando le cellule delle parti terminali di queste. N.B. Il trattamento enzimatico rimuove alcuni antigeni, come M e N, occasionalmente S, s e Fya, mentre vengono potenziate le reattività di altri, come quelli Rh, facendo supporre che questi antigeni sono situati sugli strati più interni.

66 Un altra conseguenza dell attacco degli anticorpi sulle cellule è l attivazione della cascata complementare che costituisce un altro meccanismo di difesa naturale e che comporta, come esito finale, la lisi cellulare.

67 Il primo componente C1 si scinde in tre parti q, r e s. Il frammento q si lega al frammento Fc della immunoglobulina.

68 A seguito di questo legame il C1s scinde il C4 ed il C2 in due frammenti di cui i più grandi C4b e C2a (C3 convertasi) si legano direttamente al globulo rosso insieme a gran quantità di C3b. L attivazione prosegue fino al completamento C5, 6, 7, 8 e 9 che bucano la membrana cellulare.

69 I sieri antiglobuline umane Questi sieri vengono preparati utilizzando componenti purificati del siero umano: gammaglobuline e betaglobuline (fraz. di complemento).

70 Il sistema immune del coniglio riconosce come estranee le molecole umane inoculate e produce degli anticorpi che vengono poi raccolti, purificati e miscelati tra loro e reagiscono con cellule sensibilizzate.

71 Il test antiglobuline umane AHG o test di Coombs Il principio del test è semplice: al termine del periodo di incubazione siero-cellule, tramite abbondante lavaggio (se si usa la fase liquida), viene allontanato tutto il siero e con esso le globuline non legate ai globuli rossi. Si aggiunge al fondello di cellule il siero antiglobuline umane per cui il Fab degli anticorpi di coniglio si legherà al Fc delle immunoglobuline adese sulle cellule formando dei ponti che causeranno l agglutinazione non altrimenti visibile.

72 Il test di Coombs può essere: diretto: in condizioni normali l anticorpo non è mai adeso alle emazie. In caso di malattie emolitiche autoimmuni, nella malattia emolitica del neonato e nelle reazioni trasfusionali, l anticorpo si trova attaccato alle cellule e la sua evidenziazione in vitro richiede semplicemente il lavaggio dei g.r., per allontanare le proteine non adese (se si usa la fase liquida), e l uso del siero antiglobuline umane.

73 indiretto: quando nel siero di una persona è presente un anticorpo e se ne vuole evidenziare la sua presenza e specificità è necessario incubare il siero con i g.r. screening e/o del pannello di identificazione. Al termine del periodo di incubazione i g.r. si cimentano con il siero antiglobuline.

74 La procedura di ricerca di screening utilizzata attualmente è il Type and Screen che è caratterizzata dalla determinazione del gruppo sanguigno e dalla ricerca anticorpi per la quale si utilizzano pannelli eritrocitari con gli antigeni più importanti espressi in forma omozigote in quanto si sfrutta il principio dell effetto dose: reazione più intensa con cellule omozigoti o presenza sulla stessa cellula di più antigeni. La ricerca viene effettuata utilizzando LISS ed incubazione a 37 C in considerazione del fatto che gli anticorpi clinicamente significativi sono attivi a questa temperatura.

75 Altre reazioni: reazione febbrile non emolitica: dovuta alla presenza di anticorpi diretti contro gli antigeni leuco-piastrinici. Di solito si osservano nei politrasfusi o nelle poligravide. E caratterizzata da febbre, brividi scuotenti e malessere. Si controlla facilmente con terapia antipiretica reazione anafilattica: compare solitamente a seguito dell infusione delle proteine plasmatiche in soggetti congenitamente privi di IgA. E una reazione gravissima che compare alle prime gocce infuse.

76 D.M (G.U. n 300 del ) all. VII Specifiche procedure definite dal servizio trasfusionale devono descrivere i criteri, le modalità di effettuazione e gestione delle richieste, e di scelta degli emocomponenti (con particolare riguardo al gruppo sanguigno), nei casi di urgenza/emergenza in cui non sia possibile seguire le normali procedure per la determinazione del gruppo sanguigno e per l esecuzione delle indagini pretrasfusionali. Nel caso di type & screen la validità temporale delle indagini pre-trasfusionali di 90 giorni nel paziente mai trasfuso o non trasfuso negli ultimi 90 giorni e non trasfuso successivamente al prelievo. Negli altri casi, inclusa la donna in gravidanza, la validità temporale delle suddette indagini di 72 ore dal prelievo.

77 - maggiore sensibilità del test in Agglut. su Colon. o Gel sediment. o in fase solida rispetto a quello in provetta nel dimostrare Ab di classe IgG - maggiore riproducibilità - maggiore rapidità di esecuzione - maggiore stabilità nel tempo dei risultati - minore soggettività di interpretazione - ridotte quantità di reagenti (siero/emazie)

78 Ricerca anticorpi tramite test a 37 C in fase liquida (provetta) con emazie screening ed utilizzo di siero antiglobuline umane (AHG). agglutinazione: positività non agglutinazione: negatività 2 gtt. siero paziente 2 gtt. LISS 1 gt. di emazie screening al 5% di incubazione lavaggi gtt. siero di Coombs (verde) centrifugazione lettura aggiunta in caso di negatività di 1 gt. di emazie sensibilizzate, centrifugare a basso n di giri e lettura

79 Test di Coombs diretto: -ricerca anticorpi adesi sulla superficie eritrocitaria- Schedina 10 µl emazie sospese al 5% in sol. fisiol. centrifugaz. lettura Provetta lavaggio abbondante delle emazie 1gt. emazie sospes. al 5% in sol. fisiol. 2 gtt. siero Coombs. centrifugaz. lettura

80 La eluizione A seguito di un test di Coombs diretto positivo, al fine di individuare l anticorpo implicato nella reazione, si fa ricorso alla tecnica di eluizione. Ci sono in pratica vari modi per far scindere il legame antigene-anticorpo (calore, acidità ecc.) e consentire così la individuazione dell anticorpo ormai libero nel sovranatante.

81 I globuli rossi, con gli autoanticorpi adesi, non possono essere utilizzati per la ricerca di antigeni tramite test di Coombs (Du; Kell; Duffy ecc.); autoanticorpi Gli auto-anticorpi presenti nel siero-plasma interferiscono con la ricerca di allo anticorpi (prove di compatibilità, Type & Screen ecc.). alloanticorpi

82 Lavaggio e concentrazione dei globuli rossi; loro miscelazione, in rapporto di 1 a 2, con glicina. a 37 C per 30 glicina 2 1

83 I globuli rossi possono essere utilizzati per la ricerca di antigeni (Du, Kell, Duffy ecc.) o per proseguire con la tecnica dell autoassorbimento L effetto che si ottiene è la separazione degli autoanticorpi dai g.r. Si centrifugano e si lavano le cellule per separarle dal sovranatante che va scartato.

84 Per far ciò si cimentano i globuli rossi appena privati dagli autoanticorpi con il siero del paziente, in rapporto di 1 a 1. A 37C per 1 h. Quello che si desidera ottenere è eliminare dal siero gli auto-anticorpi per poter isolare eventuali allo-anticorpi.

85 Identificazione anticorpi irregolari A seguito di una ricerca anticorpi irregolari positiva è necessario procedere con la identificazione del/degli anticorpi presenti. A tal fine sono disponibili in commercio pannelli eritrocitari ottenuti da diversi individui (da 11 a 15) recanti gli antigeni eritrocitari più importanti variamente combinati tra loro. La tecnica è eguale a quella descritta per la ricerca di screening (schedina, fase solida o fase liquida) variando in pratica solo i g.r. utilizzati.

86 Quale che sia la tecnica utilizzata, al termine dell ultima centrifugazione si annotano le positività riscontrate con il relativo score (1,2,3,4) per valutare eventuali effetti dose: presenza contemporanea di due antigeni o di un antigene in forma omozigote e si raffrontano con il panel utilizzato.

87 Utilizzo pratico del T.C.I. prove di compatibilità: siero paziente e gr al 5% del donatore; ricerca Du: siero anti-d (IgG) + gr al 5% del soggetto; Type & Screen: siero paziente + gr pan-antigenici; ricerca anticorpi irregolari (gravidanza, donatori, malattie emolitiche ecc.): come T&S; ricerca antigeni particolari (Kidd, Duffy, Lutheran ecc.) siero anti-.. + gr al 5% del soggetto;

88 Cause di errore Non corretto lavaggio dei g.r. (l eventuale siero/plasma ancora presente neutralizza con le proteine in esso contenuto il siero anti-ahg); Presenza di paraproteine nel siero (mielomi, linfomi ); lavare con sol. fisiologica a 37 ; Reagenti mal conservati e/o contaminati; Centrigufazione finale eccessiva (per tempo o rpm) Mancato rispetto dei tempi di reazione: 15 con LISS; senza mezzi potenzianti; Errato rapporto siero- emazie, soprattutto se in presenza di deboli concentrazioni di anticorpo Presenza di autoanticorpi che fuorviano

89 Poliagglutinazione Anticorpi- anti componenti proteici della LISS Anticorpi anti-peg Anticorpi- anti idrocortisone Come discriminare? Esito Emazie al 3% in LISS in schedina Emazie al 3% in LISS in provetta Emazie al 3% no LISS in schedina Emazie al 3% no LISS provetta Emazie al 3% lav. sosp. in LISS sched Emazie al 3% lav. no LISS provetta P.C. in LISS in schedina P.C. no LISS in schedina P.C. in LISS in provetta P.C. no LISS in provetta - - -

90 DM GU 300 del all. VII 8. Specifiche procedure definite dal servizio trasfusionale devono descrivere i criteri, le modalità di effettuazione e gestione delle richieste, e di scelta degli emocomponenti (con particolare riguardo al gruppo sanguigno), nei casi di urgenza/emergenza in cui non sia possibile seguire le normali procedure per la determinazione del gruppo sanguigno e per l esecuzione delle indagini pre-trasfusionali. 9. Nel caso di type & screen la validità temporale delle indagini pre-trasfusionali di 90 giorni nel paziente mai trasfuso o non trasfuso negli ultimi 90 giorni e non trasfuso successivamente al prelievo. Negli altri casi, inclusa la donna in gravidanza, la validità temporale delle suddette indagini di 72 ore dal prelievo.

91 1964- Grove e Rasmussen mettono in dubbio l utilità della fase anti-globulinica del crossmatch. Su anticorpi rilevati, lo 0.4% era sfuggito alla evidenziazione Gli standards AABB, che in precedenza non prevedevano l esecuzione del test dell anti-globulina in caso di negatività della ricerca anticorpi, ne prescrivono la sua esecuzione Eloise Giblett dimostra la inutilità della prova a temperatura ambiente Sommando i risultati degli studi di Oberman e Boral, su campioni trovati positivi, 23 (1 ogni 1.925) erano sfuggiti allo screening. Nonostante la bassa incidenza i regolamenti federali americani non ne consentivano l uso Judd su cross-match ha rilevato 35 anticorpi significativi sfuggiti allo screening. 9 erano diretti verso antigeni a bassa frequenza e 17 avevano specificità anti-rh l FDA e gli Standards dell AABB consentirono l utilizzo per tutti i pazienti della metodologia T&S. Il rischio calcolato di non evidenziare un anticorpo era stimato in 1 ogni campioni o di 1 ogni cross-match.

92 Criticità delle ricerche -Fase liquida -Emazie test a due cellule con assenza antigeni critici in forma omozigote Ricerche seguenti Shulrnan su 1.3 milioni tests solo 5 pazienti erano sfuggiti all individuazione dell anticorpo facendo registrare una reazione emolitica acuta. I 5 anticorpi era anti-jka, anti-c, anti-c, anti-wra ed anti- Kpa.

93

94 Linee Guida per il T&S La Trasf. del San. Vol. 40 num. 4 Lug/Ag 1995, Alessandria, Bolzano, Magenta, Milano, Monza, Pordenone, Romano di Lombardia, S. Donà di Piave, Sondalo, Torino, Udine, Urbino, Varese Il T&S sembra essere la procedura indicata per una corretta indagine pre-trasfusionale in ogni condizione clinica che preluda ad una trasfusione

95 -Quante Cellule? -Quale metodologia? -Emazie trattate con enzimi? -Quale controllo AB0? -Quale validità temporale? Dubbi Raccomandazioni -Pannello almeno a tre cellule non trattate con enzimi -Fase solida, gel sedimentazione o agglutinazione su colonna -LISS-Coombs a 37 C -Controllo AB0 su codino della sacca ed in assegnazione computer cross-match o immediate spin -90 giorni senza gravidanze o trasfusioni intercorrenti; 72 ore nelle donne in gravidanza o trasfusioni intercorrenti

96 giorni E S A M E E S A M E P R E L I E V O I N V I O ore Il campione deve essere raccolto in provetta sterile entro 72 ore precedenti la trasfusione, contrassegnato in modo da consentire l'identità del soggetto cui appartiene e firmato dal responsabile del prelievo Standard pag. 129 la ricerca anticorpi irregolari anti-eritrocitari negativa può essere utilizzata come test di compatibilità pretrasfusionale valido per non più di 72 ore dalla sua esecuzione ore

97 CASO CLINICO N. 1 Donna di 86 anni, mai trasfusa, plurigravida, identificata n Gruppo A POS ccdee Positiva al Capture-R Ready Screen (4). Lo studio della Master List evidenzia una miscela di anticorpi anti- C+e. Si cimenta quindi il campione con due unità di emazie: 2693 A ccdee A ccdee

98 La sacca 2693 A ccdee è negativa al crossmatch.

99 CASO CLINICO N. Uomo 2 53enne immunizzato anti-jk a. Si crociano 4 unità di emazie concentrate (n.6409, n.6423, n.6370 e n.6373). Di queste 2 risultano compatibili: 6409 e 6370)

100 Le unità vengono saggiate per la ricerca dell antigene Jk a sulle emazie Delle due compatibili ad Innova l ultima era Jka+ Solo l unità 6409 era Jka negativa, quindi l unica realmente compatibile.

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102 Con un T&S periodico e le prove di compatibilità per i pazienti politrasfusi, come i talassemici e gli emoglobinopatici, per i responder con pregresse alloimmunizzazioni ed i neonati con anemizzazioni sospette, potremo ottenere un'ottima sicurezza trasfusionale per i pazienti. Giorgio Assali

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104 6 anti-c 55 anti-d 75 anti- E 11 anti-fya 24 anti-jka 101 anti-k 18 anti-kpa 11 anti-lea 27 anti-m 5 anti-cw 20 anti-d+c 4 anti-e+c Fya+E 3 anti-jka+e 2 anti K+c 3 anti-leb 7 anti-s 1 anti C+e 4 anti-d+e 3 anti-e+kpa Fyb Jka+E+Lea 2 anti- K+E Lea+Leb N 1 anti C+e+M 3 anti-d+k 2 anti-e+fya Jka+Kpa 2 anti-k+fya 15 anti-c 2 anti-d+fya E+Jkb 2 anti-jkb K+C 4 anti c+e 1 anti D+K+Jkb E+Jkb+Kpa K,C,e 1 anti-d+c+e E+M+c K+Jka 1 anti-d+e+k E+S K+Jkb+Kpa+E E+Wra K+Kpa 3 anti-e K+Kpa K+S+M anti Kell: 117 anti E: 97 Tot. 438 su circa pazienti anti D: 79 anti C : 35 anti M: 30 anti Jka: 27 anti c: 25 anti Kpa: 24 anti Fya: 15 anti e: 6

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