Spettroscopia nell ultravioletto e nel visibile

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1 Spettroscopia nell ultravioletto e nel visibile Sono le regioni dello spettro elettromagnetico maggiormente utilizzate nelle ricerche in campo biomedico

2 Le radiazioni elettromagnetiche e lo spettro Una radiazione elettromagnetica è caratterizzata dalla sua frequenza (ν) o dalla sua lunghezza d onda (λ). Queste sono tra loro correlate dalla velocità della luce (c) secondo la seguente relazione: ν= c/λ La luce visibile rappresenta una porzione molto ristretta di questo intervallo, compresa tra 400 nm, della luce blu-viola, e i 700 nm della luce rossa. Lunghezze d onda più piccole sono quelle della luce ultravioletta, mentre quelle più lunghe sono tipiche della luce infrarossa

3 Lo spettro di assorbimento Le sostanze pure non assorbono energia di tutte le lunghezze d onda in modo uguale, ed una sostanza può essere identificata proprio in base al pattern di lunghezze d onda assorbite. La clorofilla delle piante, ad es., assorbe alla lunghezza d onda del blu (ca. 450 nm), e del rosso (ca. 650 nm), ma riflette quella verde (ca.525 nm).

4 Lo spettro di assorbimento La misura dell assorbanza di una soluzione permette di generare un grafico, uno spettro d assorbimento del campione, in cui sull asse delle Y si pongono i valori dell assorbanza e sull asse delle X le lunghezze d onda. Il massimo di assorbimento per una qualunque sostanza pura in soluzione corrisponde alla lunghezza d onda dove l assorbimento è massimo.

5 Cosa si misura con uno spettrofotometro? Lo spettrofotometro può essere usato, oltre che per determinare gli spettri di assorbimento di una sostanza, anche per misurare le concentrazioni di sostanze in soluzione. Uno spettrofotometro è una macchina ottica che misura la quantità di energia luminosa che viene trasmessa da una sostanza colpita da radiazioni luminose di diversa lunghezza d onda. L energia luminosa trasmessa si può misurare come Trasmittanza: il rapporto tra l energia della luce trasmessa (I) e della luce incidente (I 0 ). La percentuale di trasmittanza si ottiene moltiplicando per 100 questo rapporto %T = (I /I 0 )x100 d Luce incidente I 0 I Luce trasmessa

6 d Luce incidente I 0 I Luce trasmessa Trasmittanza T = I/I 0 Assorbanza A = -Log T = LogI o -Log I La trasmittanza non è proporzionale alla concentrazione di soluto e per questo viene convertita in Assorbanza, proporzionale alla concentrazione di soluto

7 I 0 Assorbimento del campione a concentrazione C I Intensità di luce INCIDENTE Intensità di luce TRASMESSA Maggiore è la quantità di molecole che la luce incontra, maggiore è l assorbimento, minore è l intensità di luce trasmessa.

8 Relazione tra concentrazione ed assorbimento di una sostanza ad una certa lunghezza d onda Legge di lambert-beer: A = ecd d I 0 I c = concentrazione Molare della sostanza che assorbe la luce. d = lunghezza del cammino ottico espressa in cm. e = Coefficiente di Estinzione Molare della sostanza che assorbe luce.

9 La struttura di uno spettrofotometro Uno spettrofotometro consiste di una sorgente di luce (visibile/ultravioletto), un prisma o reticolo di diffrazione che separa la luce di differenti lunghezze d onda, una fenditura attraverso cui passa un sottile raggio della lunghezza d onda desiderata (raggio di luce incidente, I 0 ), un supporto per la soluzione del campione, un tubo fotosensibile che misuri l energia della luce trasmessa attraverso la soluzione (I), ed un apparato di registrazione che misuri la quantità di luce trasmessa. 4 Spettrofotometro a singolo raggio: Sorgente luminosa (UV/visible) 2. Selettore (monocromatore/ reticolo) 3. Contenitore del campione 1 4. Rivelatore (detector) 5. Computer

10 Per strumenti UV/VIS ci sono due lampade: tungsteno -----> VIS idrogeno o deuterio > UV La lunghezza d onda di 350 nm è il punto di switch fra l una e l altra. Monocromatore -----> seleziona la lunghezza d onda con prismi (rifrazione) o mediante reticoli (diffrazione). Il detector è una fotocellula dove una superficie sensibile riceve fotoni e genera una corrente che è proporzionale all intensità del raggio di luce che raggiunge la superficie. Campione: ha un cromoforo che è la parte di una molecola che dà assorbimento (aminoacidi aromatici). E sempre in soluzione che di solito è un tampone. Il contenitore non deve assorbire e deve essere scelto a seconda della lunghezza d onda.

11 Cromofori delle proteine Legame peptidico assorbe a 210 nm Aminoacidi aromatici assorbono a 280 nm Le cisteine assorbono a 250 nm

12 Cuvette e piastre: Plastica per luce visibile

13 Vetro per luce visibile

14 Quarzo per luce ultravioletto

15 Determinazione della concentrazione proteica mediante Metodo Bradford -Colorante: Coomassie Brilliant Blue G 250; -Il colorante reagisce con aminoacidi basici delle proteine; Lisina Arginina Istidina

16 Proteina Arginina-Lisina-Istidina Albumina Complesso proteina-colorante Il dosaggio è indipendente dal tipo di proteina utilizzata

17 Assorbanza Assorbanza Il legame alle proteine in soluzioni acide sposta l assorbimento massimo del colorante da 465 nm a 595 nm Reattivo Bradford 465 nm 595 nm 200 nm 800 nm Complesso Reattivo Bradford-proteine 595 nm 465 nm Il colorante Blu di Comassie legato alla proteina è blu se non è legato è marroncino. 200 nm 800 nm

18 Protocollo sperimentale - Preparazione dello standard (albumina di siero bovino) e costruzione della retta di taratura. - Preparazione del campione e calcolo della concentrazione proteica utilizzando la retta di taratura.

19 Reviewed, UniProtKB/Swiss-Prot ALBU BOVIN (P02769) Albumina di siero bovino (BSA) Serum albumin (BSA) Bos taurus (Bovine). The computation has been carried out on the complete sequence (607 amino acids). Number of amino acids: 607 Molecular weight: Theoretical pi: 5.82

20 Retta di Taratura Proteina standard: Albumina di siero bovino (BSA) concentrata 0,1 mg/ml Concentrazione di BSA nella piastra l di BSA - Incubare per 5 minuti - Leggere l assorbanza a 595 nm - Costruire la retta di taratura l H 2 O 150 l di reagente Bianco l 1 g 10 l 90 l 2 g 20 l 80 l 3 g 30 l 70 l 4 g 40 l 60 l 5 g 50 l 50 l 6 g 60 l 40 l

21 Come allestire la curva de taratura in una piastra per il dosaggio Bradford Si allestisce in triplicato nel seguente modo: In A1, A2, A3 (Bianco) 100 l di H 2 O l di reagente Bradford diluito 1:5 In B1, B2, B3 (1 g di BSA) 10 l di BSA (0.1 mg/ml) + 90 L di H 2 O L di reagente Bradford diluito 1:5 In C1, C2, C3 (2 g di BSA) 20 l di BSA (0.1 mg/ml) + 80 L di H 2 O L di reagente Bradford diluito 1: Bianco g g g g g g In D1, D2, D3 (3 g di BSA) 30 l di BSA (0.1 mg/ml) + 70 L di H 2 O L di reagente Bradford diluito 1:5 In E1, E2, E3 (4 g di BSA) 40 l di BSA (0.1 mg/ml) + 60 L di H 2 O L di reagente Bradford diluito 1:5 In F1, F2, F3 (5 g di BSA) 50 l di BSA (0.1 mg/ml) + 50 L di H 2 O L di reagente Bradford diluito 1:5 In G1, G2, G3 (6 g di BSA) 60 l di BSA (0.1 mg/ml) + 40 L di H 2 O L di reagente Bradford diluito 1:5

22 Campione da analizzare: Siero di sangue bovino Il siero è la parte non corpuscolata del sangue che si separa da questo dopo la coagulazione. È un liquido di colore variabile dal giallo pallido al giallo oro, la sua composizione proteica è simile al plasma privato dei fattori della coagulazione fondamentalmente fibrinogeno (che, trasformatosi in fibrina, passa a far parte del coagulo) Il plasma consente alle cellule dell'organismo di disporre di acqua e di sostanze nutritive derivanti dagli alimenti. Esso contiene proteine, sostanze minerali ed ormoni essenziali per il normale sviluppo organico, inoltre trasporta i vari prodotti di degradazione al rene e al fegato perché vengano eliminati.

23 Proteine del plasma Albumina (costituisce da sola il 52% del totale) e Globuline a e b prodotte dal fegato, pressione colloido-osmotica, funzione tampone del plasma, trasporto di ioni metallici, proteine che legano i lipidi e vitamine liposolubili mentre le g Globuline sono prodotte da plasmacellule, anticorpi della difesa immunitaria. (trasporto e difesa) Proteine della coagulazione, la protrombina e il fibrinogeno, prodotte dal fegato. Proteine del complemento, C1-C9 prodotte dal fegato, difesa di microorganismi e risposta infiammatoria Lipoproteine plasmatiche, colesterolo dal fegato alle cellule

24 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Diluire il siero 1: 200 piastra l di siero l di H 2 O 150 l di reagente Bianco l 5 l 95 l 10 l 90 l 20 l 80 l - Incubare per 5 minuti - Leggere l assorbanza a 595 nm - Calcolare la concentrazione proteica

25 Come allestire i campioni in una piastra per il dosaggio Bradford - - Bianco 5 5 l l l Si allestisce in doppio nel seguente modo: In A5, A6, (Bianco) 100 l di H 2 O l di reagente Bradford diluito 1:5 In B5, B6, 5 l di campione (diluito 1:200) + 95 L di H 2 O L di reagente Bradford diluito 1:5 In C5, C6, 10 l di campione (diluito 1:200) + 90 L di H 2 O L di reagente Bradford diluito 1:5 In D5, D6, 20 l di campione (diluito 1:200) + 80 L di H 2 O L di reagente Bradford diluito 1:5

26 Piastra dopo lettura in assorbarza 595 nm

27 Protocollo sperimentale Con i valori di assorbanza ottenuti dalla lettura a 595 nm, costruire la curva di taratura Calcolare la concentrazione delle proteine del nostro campione utilizzando la retta di taratura (Y=m*x+q) dove: X = la nostra incognita y = Assorbanza letta a 595 nm

28 Vantaggi: semplicità di preparazione del reattivo; sviluppo immediato del colore; stabilità del complesso; sensibilità alta (5-100 g proteina/ml) Svantaggi: alcuni campioni sono poco solubili in ambiente acido;