Estrazione rapida di DNA plasmidico da Escherichia coli. (QIAscreen) ESERCITAZIONE DI LAB. N.1. Corso di INGEGNERIA GENETICA, Prof.

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1 Estrazione rapida di DNA plasmidico da Escherichia coli (QIAscreen) Corso di INGEGNERIA GENETICA, Prof. Renato Fani, ESERCITAZIONE DI LAB. N.1

2 PLASMIDI IN NUMEROSE SPECIE BATTERICHE SONO PRESENTI I PLASMIDI, MOLECOLE DI DNA PIU PICCOLE DEL GENOMA,GENERALMENTE CIRCOLARI, A DOPPIA ELICA E DI DIMENSIONI VARIABILI. ESSI SONO DOTATI DI CAPACITA REPLICATIVA AUTONOMA TALORA IN GRADO DI INTEGRARSI NEL GENOMA (EPISOMI) E POSSONO CONFERIRE FENOTIPI RILEVANTI AI BATTERI (VIRULENZA RESISTENZA, FISSAZIONE DELL AZOTO, DEGRADAZIONE COMPOSTI XENOBIOTICI, ).

3 PLASMIDI OC CCC

4 Trasmissione di geni per via orizzontale (CONIUGAZIONE BATTERICA) Anche i casi di semplice trasferimento dei pochi geni presenti su un plasmide, sembrano aver rappresentato uno dei motori trainanti per l evoluzione delle forme di vita e dei procarioti in particolare.

5 I plasmidi I plasmidi sono utilizzati in tecniche di biologia molecolare Uno dei più classici:

6 I plasmidi Regioni importanti: bla (ApR), corrisponde al gene codificante un enzima capace di conferire alla cellula che ospita il plasmide la resistenza all antibiotico ampicillina. tet (TcR), gene che conferisce la resistenza all antibiotico tetraciclina. rep, corrisponde alla regione che serve alla replicazione, e quindi al mantenimento, del plasmide, in sua assenza il plasmide viene perso perché non può più essere replicato I punti indicati dalle scritte blu corrispondono a specifici siti al cui interno è possibile inserire il DNA da analizzare.

7 IN COSA CONSISTE DUNQUE L ESERCITAZIONE DI OGGI? ESTRAZIONE DEL DNA PLASMIDICO MEDIANTE LISI ALCALINA

8 PROTOCOLLO 1. Da una piastra di cellule batteriche, recanti il plasmide d interesse, o da uno stock di batteri in glicerolo, viene effettuato, in condizioni sterili, l inoculo di una singola colonia, in 3ml di brodo LB con opportuno antibiotico, all interno di un tubo batteriologico da 15 ml. Il tubo viene incubato per circa ore a 37 C in agitazione, affinché la coltura batterica raggiunga la fase di crescita stazionaria. LB + antibiotico

9 PROTOCOLLO 2. La coltura viene quindi centrifugata a rpm per 1-3 minuti, ottenendo così un pellet di cellule batteriche che viene poi risospeso in 300μl (0,3 ml) di soluzione di risospensione, o soluzione P1 (50mM Tris-HCl ph 8, 10 mm EDTA ph 8 + RNasiA). Tris HCl Tampone con la funzione di creare un microambiente favorevole al mantenimento del DNA in condizioni ottimali. EDTA Chelante degli ioni bipositivi (soprattutto calcio e magnesio) serve a disattivare gli enzimi litici (Dnasi) che si liberano con la lisi cellulare e che potrebbero degradare il DNA. Destabilizzante delle membrane biologiche. RNasiA Enzima indispensabile alla degradazione dell RNA, che altrimenti potrebbe mascherare il segnale dato dal DNA.

10 PROTOCOLLO 3. Aggiungere 300 μl di soluzione di lisi, o soluzione P2 (200 mm NaOH, 1% SDS), agitare delicatamente per inversione e incubare a temperatura ambiente per max 5. NaOH Eleva il ph determinando uno stress osmotico che destabilizza la parete cellulare. Denatura tutte le strutture ad alto peso molecolare compreso il DNA cromosomico. SDS Scioglie la membrana plasmatica.

11 PROTOCOLLO 4. Aggiungere 300 μl di soluzione neutralizzante o P3 (2,55 M K-acetato ph 4,8), mescolare ancora per inversione e centrifugare a rpm per 15. K-acetato Riporta il ph a valori lggermente basici (intorno a 8) determinando la rinaturazione rapida e imperfetta delle strutture cellulari (flocculi biancastri) ad eccezione del DNA plasmidico.

12 PROTOCOLLO 5. Recuperare il sopranatante con una micropipetta e trasferirlo in una nuova eppendorf. Precipitare il DNA con 0,8 volumi di isopropanolo mediante centrifugazione per 15. Le soluzioni alcoliche servono per far precipitare gli acidi nucleici.

13 PROTOCOLLO 6. Il pellet del DNA viene sottoposto a due lavaggi con etanolo 70%, centrifugando per 2 a rpm. Dopo averlo essiccato brevemente risospendere in 20 μl di TE o dh 2 0.

14 PROTOCOLLO 7. La concentrazione del DNA estratto e purificato viene stimata sottoponendo un aliquota ad elettroforesi su gel di agarosio, con Bromuro di etidio (EtBr), insieme ad aliquote di preparazioni a concentrazione nota utilizzate come standard.

15 reparazione di un gel di agarosio. Pesare la quantità opportuna di agarosio (in base alle dimensioni dei frammenti da separare) ed aggiungerla al volume stabilito di tampone TEA 1 X.. Portare ad ebollizione il gel su piastra magnetica o in un forno a microonde e verificare il completo scioglimento dell'agarosio.. Aggiungere la giusta quantità di bromuro di etidio ATTENZIONE: agente mutageno. Versare il gel nella vasca elettroforetica all interno della slitta, sulla quale sarà stato precedentemente sistemato un pettine vicino ad un'estremità della vaschetta. I denti del pettine formeranno, una volta solidificatosi il gel, i pozzetti in cui verranno caricati i campioni di DNA. E estrememente importante che i denti del pettine non tocchino la base della slitta, per evitare, al termine della preparazione, che i pozzetti risultino "bucati". AGAROSIO. Un polimero lineare estratto da alghe, solido a temperatura ambiente.. Quando il gel si è perfettamente solidificato (solitamente sono sufficienti per questo circa 30 minuti a temperatura ambiente), rimuovere delicatamente il pettine e i supporti per la slitta dalla vasca elettroforetica. BROMURO DI ETIDIO. Il 3-8 diamino 5 etil-fenilfenantridio bromuro è un mutageno che si intercala tra le basi del DNA e per questo motivo va utilizzato con prudenza ed è necessario indossare i guanti quando si utilizzano materiali che lo contengono. Possiede la proprietà di illuminarsi per fluorescenza quando viene colpita da un fascio di luce ultravioletta.. Aggiungere il tampone da elettroforesi (TEA 1X) fino a coprire il gel per almeno 2 mm. Viene preparato come soluzione a 10 mg/ml in acqua distillata e conservato a 4 C.

16 reparazione e caricamento dei campioni. Aggiungere Blue di Bromofenolo ai campioni di DNA (ad esempio 2 μl di Blue per 10 μl di campione) e caricarli nei pozzetti con una micropipetta.. Applicare il coperchio alla vasca elettroforetica e inserire gli elettrodi in modo tale che il polo positivo (rosso) si trovi all'estremità del gel più lontana dai pozzetti. tilizzando come riferimento la banda del Blue di Bromofenolo, continuare la corsa elettroforetica per il tempo desiderato. BLU DI BROMOFENOLO (BBF). Il BBF è un colorante blu violaceo che viene aggiunto al campione che carichiamo su gel di agarosio in modo da visualizzarne la corsa. Di questo colorante sfruttiamo la mobilità in direzione dell anodo, caratteristica analoga al DNA.. Terminato il tempo spengere l'apparato, porre il gel su di un transilluminatore a raggi UV e documentare il risultato con una fotografia. La soluzione madre si prepara al 5% in acqua distillata ed ha consistenza molto densa.