Ø Gel Elettroforesi (GE) Ø Spettrometria di Massa (MS)

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1 Tecniche di indagine nello studio delle PTMs Ø Gel Elettroforesi (GE) Ø Tecniche cromatografiche (LC, HPLC) Ø Spettrometria di Massa (MS) Possono essere utilizzate da sole o in combinazione, direttamente sulle proteine oppure sui derivati della digestione proteolitica

2 MS spectrometry and PTMs

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10 Tecniche per lo studio in MS/MS delle PTMs Neutral loss mode: si selezionano i frammenti che hanno perso un frammento neutro e che quindi hanno un valore di m/z inferiore di un valore che dipende dal tipo di PTM (es. 18 per acqua, 17 per ammoniaca, 80 acido fosforico) In questo modo è possibile identificare subito il tipo di PTM. Precursor ion mode: viene selezionato un singolo frammento il cui valore di m/z è indicativo di una specifica PTM e quindi permette di esaminare solo i frammenti che contengono tale modificazione. L uso della MS/MS permette di identificare PTMs con variazione di massa minime come la deamidazione di Asn ad Asp (o Gln a Glu) con variazione di massa di +1 Da oppure la formazione di ponti di solfuro ( -2 Da)

11 Corrisponde alla massa di un residuo di HPO 3 Lo spettro MS dei peptidi non modificati può essere sostituito da spettri calcolati della proteina Questo approccio è semplice, ma rende difficile l identificazione del sito coinvolto nella modificazione

12 Tecniche per lo studio in MS/MS delle PTMs Neutral loss mode: si selezionano i frammenti che hanno perso un frammento neutro e che quindi hanno un valore di m/z inferiore di un valore che dipende dal tipo di PTM (es. 18 per acqua, 17 per ammoniaca, 80 acido fosforico) In questo modo è possibile identificare subito il tipo di PTM. Precursor ion mode: viene selezionato un singolo frammento il cui valore di m/z è indicativo di una specifica PTM e quindi permette di esaminare solo i frammenti che contengono tale modificazione (es. picco a per l Nacetilazione della Lys descritto nella slide precedente) L uso della MS/MS permette di identificare PTMs con variazione di massa minime come la deamidazione di Asn ad Asp (o Gln a Glu) con variazione di massa di +1 Da oppure la formazione di ponti di solfuro ( -2 Da)

13 Attraverso un analisi combinata, di norma automatizzata, tra HPLC e MS è possibile identificare l a.a. che porta la PTM cercata (nell esempio mostrato l acetilazione di gruppi lisinici in un istone)

14 Peptide che deriva dalla digestione triptica dell emoglobina α umana

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16 Algoritmi di calcolo per lo studio in MS di PTMs sono necessari e in continuo miglioramento e facilitano enormemente l analisi dei dati e l accuratezza dei risultati. Bisogna considerare che l identificazione delle proteine (A nella figura sotto) può essere eseguita automaticamente con una copertura (coverage) parziale delle sequenze a.a. In contrasto, la mappatura di tutte le PTMs (B) richiede, idealmente, una copertura completa della sequenza. In grigio gli a.a. rilevati per identificare la proteina In grigio gli a.a. che portano una PTM

17 Questo obiettivo non è banale poichè solo una percentuale dei peptidi derivanti dalla digestione proteolitica della proteina viene rilevata dall analisi MS. Un campione può contenere anche migliaia di proteine che possono dar luogo a decine di migliaia di peptidi. Per questo motivo è necessario lo sviluppo di nuove strategie analitiche (es. data mining) che in genere sono basate sulla semplificazione dell approccio (es. ricerca di ben definite PTMs)

18 Il programma Sequest (il primo sviluppato nel 1995 per identificare proteine usando MS tandem) permette all operatore di selezionare alcune PTMs a basso PM da ricercare negli spettri MS-MS (es. fosforilazione di residui di Ser, Thr o Tyr). Il programma genera spettri MS-MS virtuali nei quali i frammenti possono contenere o meno la modificazione scelta. I dati virtuali sono confrontati con quelli reali restituendo uno score di correlazione che consente con un certo livello di confidenza di identificare l a.a. modificato. La validità di questo approccio presuppone che la variazione di massa creata dalla modificazione sia: i) nota, ii) che rientri nei limiti imposti dal programma e iii) che sia contenuta negli spettri MS-MS sperimentali.

19 Esempio della procedura seguita da SEQUEST

20 Un altro l algoritmo è il SALSA che va a ricercare negli spettri sperimentali MS-MS specifiche caratteristiche quali: - Uno ione prodotto ad uno specifico valore m/z - Ilrilascio di un frammento neutro (neutral loss) da un precursore - Il rilascio di un frammento carico (charged loss) da un precursore a carica multipla - La correlazione tra due frammenti qualunque separati da uno specifico valore di m/z (ion pair)

21 L algoritmo SALSA è molto flessibile e permette anche di stabilire un ordine di rilevanza delle caratteristiche degli spettri in funzione dell obiettivo che si prefigge lo studio. Infatti, le 4 modalità di analisi non sono equivalenti nel loro contenuto informativo: neutral loss è PTM ion pair è modificazioni permanenti product ion è modificazioni indotte da farmaci o agenti chimici

22 Peptide sequence analysis by MS/MS

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24 Schematic representation of nomenclature for fragmentation of peptide ions. The typical fragmentation generates y- and b- peakseries

25 Annotated MS- MS spectrum of the [M+2H] 2+ ion of AVAGCAGAR showing b- and y- ions.

26 Esempio dell applicazione di SALSA per studiare una PTM Peptide non modificato y 7 y 6 y 5 y 4 y 3 y 2 y 1 A-V-A-G-C-A-G-A-R

27 Peptide modificato (carbossimetilato al sito C) y 7 y 6 y 5 y 4 y 3 y 2 y 1 A-V-A-G-C*-A-G-A-R Righello allineato su y7 Righello allineato su y2

28 Rimane comunque il fatto che questi approcci, se usati singolarmente hanno successo solo se il peptide modificato viene rilevato dalla MS, il chè ribadisce l importanza di ottimizzare i processi di digestione, separazione dei peptidi e sensibilità dello spettrometro. Considerando un campione reale contenente numerosi peptidi, modificati e non, il principale limite di Sequest è la necessità di anticipare il tipo di modificazione (e l a.a. coinvolto) da cercare, mentre quello di SALSA è di dover prevedere che tipo di motivo utilizzare come righello. Queste considerazioni hanno portato all idea di un approccio combinato in cui vengono utilizzati entrambi gli algoritmi (Sequest per identificare la proteina e SALSA per le PTM)

29 L analisi iniziale dei dati attraverso Sequest consente di correlare gli spettri MS- MS con le sequenze del database. Anche se le sequenze modificate non vengono rilevate, altri peptidi non modificati della stessa proteina vengono identificati. In questo modo si può ottenere una lista di proteine contenute nel campione. Su questa base è possibile prevedere dei motivi strutturali che vengono analizzati da SALSA che, oltre a confermare la struttura non modificata della proteina, potrà identificare modificazioni e coinvolti. mappare I siti

30 E importante sottolineare che le PTMs sono localizzate generalmente all interno di una specifica sequenza amminoacidica. Ad esempio, la N- glicosilazione coinvolge di norma un residuo Asn nella sequenza Asn- X- Ser/Thr/Cys (dove X può essere qualunque a.a. eccetto Pro). Gli algoritmi di analisi sono quindi facilitati da questa osservazione. Va comunque sottolineato che anche se l analisi computazionale permette di assegnareuna specifica PTM ad una sequenza, lasuaeffettivapresenzanel sistema in esame richiedeinevitabilmentedi essereconfermata sperimentalmente.