LA DIAGNOSI MICROBIOLOGICA DELLE MALATTIE DA INFEZIONE

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1 LA DIAGNOSI MICROBIOLOGICA DELLE MALATTIE DA INFEZIONE A. CONTI La microbiologia clinica, come disciplina di laboratorio che contempla la diagnostica delle malattie da infezione (batteri, virus, miceti, protozoi), si prefigge di ottenere l isolamento (o l identificazione) del patogeno causa di malattia o le sue «tracce immunitarie». Pertanto, permette di porre una diagnosi eziologica che, congiunta con la diagnosi clinica, consente al medico di formulare definitivamente la diagnosi di malattia. La diagnosi microbiologica è costituita da un insieme di interventi tesi specificamente all individuazione dei microrganismi patogeni responsabili delle malattie da infezione. Essa non può essere considerata un attività isolata e a sé stante, ma, al contrario, va opportunamente collocata in un più vasto contesto di approcci semeiologici e clinici indirizzati allo studio globale del paziente; molti di questi sono assolutamente preziosi e necessari per l avvio e l impostazione delle indagini prettamente microbiologiche e, in maniera determinante, ne condizionano svolgimento e risultato. Infatti, le malattie da infezione di determinati distretti anatomici dell organismo possono a volte presentare quadri clinici omologabili a prescindere dal patogeno in causa, mentre, al contrario, lo stesso agente causale può provocare processi morbosi clinicamente assai diversi in relazione alle varie possibili localizzazioni. La sindrome clinica del paziente malato e la sua evoluzione temporale vanno costantemente monitorate, in modo tale da rendere agevoli tutte le modificazioni operative che possono essere suggerite dagli elementi di giudizio emergenti. Per tale motivo la diagnosi microbiologica è, a tutti gli effetti, atto squisitamente medico. INFEZIONI ENDOGENE ED ESOGENE La diagnostica di laboratorio delle malattie da infezione (1, 2, 3) presenta alcuni aspetti di peculiarità, nell ambito delle discipline di laboratorio, che possono essere riassunti in tre punti: forte influenza della fase pre-analitica; determinazione dell agente causa della malattia (patogeno); interazione tra due sistemi biologici. Quando il corpo umano, dopo aver lasciato la cavità uterina, sterile, attraversa il canale del parto e fuoriesce all esterno, entra in contatto con una grande varietà di microbi che colonizzano le sue zone più esposte. A livello della cute e delle membrane mucose attecchiscono quelle comunità microbiche che diventano poi caratteristiche delle varie aree anatomiche, nelle quali contribuiscono alla nascita di ecosistemi che, di per sé, sono espressione di una condizione assolutamente normale. I termini «flora microbica normale, flora microbica commensale, flora microbica indigena» sono sinonimi e vengono usualmente utilizzati per descrivere microrganismi ritrovati frequentemente in particolari sedi anatomiche degli individui sani. La costituzione e l entità di questa flora batterica variano nei diversi distretti anatomici, talvolta anche in relazione alle differenti età della vita; tale flora comprende microrganismi le cui caratteristiche morfologiche e fisiologiche permettono di colonizzare e popolare un ecosistema microbico unico per condizioni metaboliche (ph, potenziale di ossidoriduzione, affinità per le cellule tissutali, disponibilità di nutrienti) e di competere con altri microrganismi «invasori». La flora microbica «normale» (4, 5) gioca un ruolo importante sia negli individui sani sia in quelli malati; ad esempio, la flora intestinale sintetizza e secerne la vitamina K e produce enzimi (glucoronidasi e sulfatasi) che permettono l assorbimento di steroidi e sali biliari coniugati. Un altro effetto benefico della flora batterica commensale è rappresentato dalla stimolazione antigenica del sistema immunitario. Sebbene l esposizione antigenica ne induca solo una ridotta sintesi in termini di concentrazione, la semplice presenza delle varie classi di immunoglobuline gioca un ruolo molto importante nelle difese dell ospite. In particolare, le IgA prodotte in risposta a stimoli antigenici sono secrete attraverso le membrane mucose, impedendo la colonizzazione dei tessuti profondi da parte di alcuni tipi di microrganismi della flora microbica normale. Tuttavia, il più importante ruolo della flora microbica commensale è quello di aiutare a prevenire infezioni conseguenti all esposizione a potenziali microrganismi patogeni semplicemente occupando fisicamente lo «spazio vitale» su cute e mucose, aderendo ai recettori delle cellule epiteliali e non rendendoli quindi disponibili per potenziali microrganismi patogeni. Sono fisiologicamente sterili il sistema nervoso, lo scheletro, le articolazioni, i muscoli, il sistema cardiovascolare, il sistema linfatico, il fegato, la milza, i reni, gli ureteri, la vescica, i polmoni e i bronchi terminali. Lo stomaco e il pic-

2 colo intestino prossimale (duodeno, digiuno e alto ileo) possono transitoriamente albergare dei microrganismi. Con livelli diversi sono, per contro, colonizzati la cute, la congiuntiva, il tratto respiratorio alto, il nasofaringe, l orofaringe, il meato esterno dell orecchio, l ileo terminale, il cieco, il colon, il retto, la vagina e l uretra terminale (2, 4, 5). Questo elenco vuole solo porre in risalto il fatto che, in molti casi, è necessario attuare accorgimenti per evitare, da un lato, che i prelievi di campioni biologici a fini diagnostici vengano contaminati dai microrganismi residenti, legati all ospite da simbiosi commensale o mutualistica, e, dall altro, per eliminare quei microrganismi la cui rilevanza come causa dell episodio morboso studiato può essere esclusa a priori. Con ciò non si vuole, però, intendere che i membri del microbiota residente siano tutti da etichettare come «incapaci» di causare malattia. Tipicamente, le cause «endogene» di malattie da infezione sono rappresentate dall abnorme aumento della popolazione di una o più di queste specie microbiche all interno di un sito anatomico dell organismo, aumento causato dallo squilibrio dell ecosistema microbico in seguito a trattamenti antibatterici che riducono la concorrenza vitale con altre specie o dal venir meno, anche temporaneo, della sorveglianza immunologica. Altro meccanismo patogenetico è rappresentato dal trasferimento di microrganismi presenti nella popolazione microbica normale di un distretto anatomico a un altro non colonizzato dalla stessa popolazione (tipicamente, infezioni delle vie urinarie causate da batteri intestinali). Le infezioni «esogene» sono causate da agenti infettivi introdotti all interno dell organismo da una sorgente esterna tramite materiali inanimati, traumi, ferite, alimenti, contatto diretto con animali o altri esseri umani infetti. LA SCELTA DEI TEST DIAGNOSTICI Compiti qualificanti del Microbiologo clinico sono la scelta degli esami da offrire e la selezione delle metodiche migliori per eseguirli (4-6). Molti sono gli aspetti da considerare prima di decidere di rendere disponibile un nuovo esame. Il più importante di questi è rappresentato dal «clinical need» dell esame stesso, che però deve anche risultare tecnicamente accessibile in condizioni operative standard in modo da ottenere la diminuzione del «turnaround time» terapeutico e impattare quindi positivamente sull outcome clinico e sui costi generali dell assistenza (4, 5, 7). L indicazione clinica all esame diventa irrinunciabile nel caso di patologie gravi per le quali siano disponibili trattamenti efficaci ma costosi. Un buon esempio di ciò è rappresentato dalla decisione di offrire, in regime di urgenza, l esame per la ricerca di VRS (virus respiratorio sinciziale), che diventa razionale qualora sia disponibile il trattamento con ribavirina. Questa terapia è molto costosa; i neonati infettati da VRS possono presentare una sintomatologia estremamente grave: ecco che allora la disponibilità di un esame diagnostico rapido e affidabile acquista valore. Senza contare che un intervento terapeutico precoce sui pazienti infetti può limitare il pernicioso espandersi di VRS in un reparto pediatrico. Tra gli altri fattori da considerare al momento di decidere se aggiungere un nuovo esame al menù delle indagini richiedibili si possono elencare: la prevalenza della malattia. Nel caso della ricerca degli antigeni di VRS, si può esaminare la frequenza di ricoveri al Pronto Soccorso di bambini di età inferiore ai 3 anni con distress respiratorio; l utilità di un esame colturale o non colturale; la necessità di un elevato livello di automazione, in base al numero di campioni attesi e la disponibilità di spazi dedicati, se necessario. Questa valutazione è molto importante nel caso si vogliano utilizzare tecniche molecolari come la PCR (Polymerase Chain Reaction), in cui si raccomanda di posizionare il termociclatore in aree di lavoro separate al fine di evitare contaminazioni; la disponibilità di kits e reagenti approvati e registrati da Istituzioni nazionali o internazionali (ad es., FDA); la disponibilità di un controllo di qualità interno e di un programma VEQ (valutazione esterna della qualità); le modalità di prelievo del campione e le condizioni di trasporto e conservazione; la presenza di personale tecnico esperto nell esecuzione dell esame, specialmente se richiedibile in urgenza; la presenza di personale in grado di garantire la validazione clinica del risultato. Può essere necessario giudicare se un esame di screening sia sufficiente o è obbligatorio ricorrere a un test di conferma (diagnostico); la possibilità di misurare l outcome clinico su basi regolari; la disponibilità di un Laboratorio di riferimento, in caso di risultati dubbi o di difficile valutazione; la valutazione del costo/beneficio.

3 DIAGNOSI DIRETTA E INDIRETTA La diagnosi microbiologica di una malattia da infezione viene tradizionalmente classificata in diretta e indiretta. La prima ricerca il microrganismo che ha causato l episodio morboso oggetto dello studio, qualunque sia il metodo a tal fine utilizzato. La seconda tende alla dimostrazione delle tracce lasciate nel paziente dal «passaggio» di detto microrganismo, tracce che quasi sempre sono rappresentate dagli anticorpi prodotti dall ospite in risposta a stimoli immunogeni dovuti agli antigeni del microrganismo stesso o con questo in stretto rapporto. Sicuramente più complessa di quella indiretta, la diagnosi diretta si articola in una maggior varietà di interventi la cui impostazione, più che in altri campi, è direttamente collegata al progresso scientifico nel settore considerato. Devono, infatti, essere tenute presenti le conoscenze più aggiornate riguardo la biologia dei diversi microbi e le basi della loro patogenicità. Per tracciare le linee essenziali di tali complessi interventi giova rammentare che i microrganismi in causa in tale contesto sono i batteri, comprese clamidie e rickettsie, i micoplasmi, i miceti, i protozoi e i virus. Sulla base del sospetto diagnostico, così come più o meno distintamente emerge dallo studio del paziente attraverso l esame obiettivo, l anamnesi e la raccolta di tutte le informazioni utili per la valutazione preliminare del quadro patologico in esame, si procede all esecuzione dei prelievi di campioni biologici. Diagnosi diretta L IMPORTANZA DEL PRELIEVO Il prelievo di sangue e di altri liquidi organici da utilizzare per la diagnosi indiretta si ricollega ai principi e ai metodi seguiti per acquisire campioni degli stessi materiali ai fini delle indagini chimico-cliniche. Nel caso della diagnosi diretta, il prelievo del campione è il momento più importante e presenta aspetti del tutto peculiari, al punto da condizionare la correttezza dell indagine e il raggiungimento di risultati affidabili. La fase pre-analitica è, in microbiologia clinica, un momento diagnostico di estrema importanza, che determina oltre il 50% del «destino» dell indagine microbiologica, di cui indirizza le ricerche, condizionando le modalità di processo del campione e la scelta delle tecniche; virtualmente, la fase pre-analitica per la diagnostica delle malattie da infezione inizia con la raccolta dell anamnesi al letto del malato e con la formulazione del sospetto eziologico da parte del clinico. Poiché il più delle volte la dimostrazione del microrganismo responsabile si basa sulle sue capacità riproduttive, è evidente che la scelta del materiale da prelevare, della tecnica da utilizzare, del momento del prelievo, della quantità da ottenere, delle modalità di «conservazione», della rapidità del trasporto in laboratorio ecc. saranno condizionati dalle conoscenze sull eziologia e sulla patogenesi della malattia da infezione sospettata. Esempio tipico di queste problematiche è rappresentato dal prelievo di sangue per emocoltura. La diagnosi di sepsi non può prescindere dall isolamento del patogeno e per rilevare la batteriemia vanno prese in considerazione molte variabili: il momento del prelievo in rapporto con la febbre o il brivido e con l antibioticoterapia eventualmente in corso, la modalità e la tempistica di assunzione del farmaco, la tecnica di antisepsi della cute per il prelievo, il numero delle emocolture (quanti flaconi nell arco delle 24 ore), l errore di campionamento (volume di campione). A queste si aggiungono fattori eminentemente tecnici, come la diluizione sangue/brodo di coltura, le condizioni di saggio (temperatura, durata dell incubazione, atmosfera di incubazione, agitazione dei flaconi), l esecuzione di sottocolture in cieco ecc. Il processo morboso, però, si presenta spesso con segni non definiti e, comunque, privo dei connotati indispensabili per orientare chiaramente il sospetto diagnostico. Inoltre, la diagnosi delle malattie da infezione è, più che per le altre patologie, una lotta contro il tempo e ciò non soltanto per i problemi relativi al singolo paziente, ma anche per il fatto che, non infrequentemente, esiste il pericolo della diffusione dell agente infettivo. La rapida esecuzione dell esame microbiologico o, per meglio dire, il rapido svolgersi delle sue varie fasi, dal prelievo alla risposta, assume valore particolare e rilevante nel caso di setticemia, meningite, endocardite, polmonite lobare ecc., dove un ritardo può ripercuotersi direttamente sulla scelta tempestiva della terapia appropriata e, quindi, anche sulla stessa sopravvivenza del paziente. Nel caso di malattia contagiosa, l accertamento diagnostico non soltanto indirizza la terapia, ma serve anche da guida per l impostazione delle più idonee misure preventive. Come fondamentale criterio di base è costantemente valida la regola di far trascorrere il minor tempo possibile tra il momento del prelievo e l esecuzione dell esame. Basti, a tal proposito, pensare alla «biofragilità» di diverse specie microbiche, o alla possibilità che in un materiale nativamente polimicrobico lo sviluppo «sovrapposto» delle specie commensali compresenti raggiunga livelli tali da sopraffare quella responsabile della malattia. Come esempio della prima situazione si può citare la ridottissima capacità di sopravviven-

4 za del gonococco a temperatura ambiente e, per il secondo caso, la possibilità di una pesante riduzione, fino alla scomparsa, delle shigelle in un campione di feci nel quale «il lungo viaggio» verso il laboratorio permetta, o addirittura favorisca, una massiva moltiplicazione delle specie costituenti il microbiota residente dell intestino. A tali inconvenienti si può in molti casi ovviare ricorrendo all impiego dei cosiddetti terreni di trasporto, o meglio rispettando la regola, tanto elementare quanto scientificamente preferibile, di effettuare i prelievi nello stesso laboratorio che dovrà esaminarli. I terreni di trasporto, oggi disponibili in numerose versioni, oltre a garantire per un periodo di tempo accettabile la sopravvivenza dei microrganismi «fragili», hanno il pregio di mantenere inalterate, almeno per un certo lasso tempo, le caratteristiche microbiche possedute dal materiale al momento del prelievo. Del tutto peculiari sono le problematiche del prelievo di campioni per la ricerca dei batteri anaerobi (che deve comportare l uso di contenitori dai quali sia stato allontanato l ossigeno e nei quali ne sia impedito il rientro), di campioni destinati all esame microscopico teso alla dimostrazione di protozoi mobili, quali trichomonas o amebe, e dei campioni destinati alla ricerca colturale dei virus. Quando localizzazione e natura dell infezione lo consentano, il materiale deve essere prelevato nel punto colpito dall infezione, in maniera tale da evitare contaminazioni da parte dei microrganismi presenti nell ambiente o costituenti la comunità microbica residente dei distretti cutanei o mucosi propri nella zona interessata dal prelievo o a questa strettamente contigui. In tale contesto operativo si inserisce in modo pertinente l esigenza di impiegare una strumentazione idonea agli scopi del prelievo e, in ogni caso, costituita da materiali sterili e sprovvisti di attività antimicrobica intrinseca. Inoltre, la quantità del materiale da prelevare deve essere modulata sul tipo di esame che dovrà essere eseguito; un elemento, questo, che dovrà suggerire anche il numero dei campioni da ottenere. Come nell esempio precedente riguardante l emocoltura, analoghi ragionamenti possono essere fatti per l espettorato o le feci o gli essudati, in relazione alle prove colturali e, circa il numero, all esigenza di contemporaneo invio di più campioni prelevati mediante tampone dal faringe, dall uretra, dalla vagina ecc., affinché il laboratorio possa procedere all avvio di diversi esami comportanti, per lo stesso materiale, il ricorso a tecniche tra loro completamente differenti. Il problema dei campioni multipli trova principi ispiratori diversi in altri casi, dove i prelievi dello stesso materiale dallo stesso paziente debbono esser opportunamente distribuiti nel tempo, in rapporto alla patogenesi della malattia sospettata o allo scopo di aumentare le probabilità di dimostrazione del microrganismo responsabile. Prescindendo dal numero, tale è il caso dei prelievi per l emocoltura e di quelli per la ricerca del parassita malarico, che debbono esser effettuati in corrispondenza della piressia, o di quelli per la dimostrazione della leptospiremia, generalmente confinata nella prima settimana di malattia, e della presenza degli Orthomyxovirus a livello orofaringeo, quando la probabilità di isolamento è direttamente proporzionale alla tempestività dell indagine rispetto all inizio della sintomatologia. Le informazioni clinico-anamnestiche e l appropriatezza della richiesta del test Regola fondamentale fra le più importanti è che, ogniqualvolta sia possibile, il prelievo venga eseguito prima dell inizio di un trattamento chemioantibiotico. Nel caso che il campione sia stato ottenuto in corso di tale tipo di terapia o poco dopo la fine di questa, il Laboratorio dovrà esserne puntualmente informato con adeguato dettaglio, così da poter di conseguenza modificare l impostazione delle indagini e seguirne l acquisizione dei risultati. Circa i problemi connessi con una terapia in corso, va sottolineato, per esempio, che le emocolture da soggetti sottoposti a trattamento chemioantibiotico risultano spesso negative, ma che il microbiologo, a conoscenza di tali trattamenti, può porre in essere accorgimenti idonei ad annullare l attività antimicrobica residua nel campione (ad esempio, utilizzando flaconi da emocoltura con carbone attivo o resine che intercettano le molecole di antibiotico). La suddetta informazione si rende necessaria anche per inquadrare nella giusta luce eventuali negatività dell indagine, altrimenti non agevolmente interpretabili. Paradigmatico a tal proposito è il caso di un liquor purulento nel quale né l esame microscopico né quello colturale riescano a rivelare la presenza di microrganismi, quali N. meningitidis o S. pneumoniae, quando il paziente abbia ricevuto, nelle 24 ore precedenti il prelievo, la somministrazione di un antibiotico capace di superare la barriera emato-encefalica. Tutto ciò senza minimamente voler intaccare il principio secondo il quale un esame microbiologico negativo non è indice assoluto dell assenza del microrganismo ricercato sia nel campione esaminato sia, a maggior ragione, nell organismo del paziente, inteso nella sua interezza. Nella definizione di diagnosi diretta si vuole implicitamente sottolineare che questa può fondarsi sul ricorso a tecniche tra loro molto diverse e tra le quali si procede a una scelta in funzione di altrettanto diverse esigenze connesse con la situazione clinica, il che può pregiudizialmente condizionare anche l operazione prelievo. A questo punto è opportuno inserire il concetto di appropriatezza della richiesta di un esame, con tutte le problematicità che a questa definizione si collegano (7).

5 In realtà, l unico modo di valutare il grado di appropriatezza di un esame sembra essere quello di metterne in relazione il risultato con l outcome clinico. Non è appropriata la richiesta di un esame se, indipendentemente dal suo risultato, la gestione clinico-terapeutica del paziente rimane immodificata. Un esame risulta, invece, appropriato se il risultato fornisce una risposta a un quesito clinico e, di fatto, rende possibile attuare un intervento sul paziente. L appropriatezza di un esame dipende dallo specifico contesto clinico, dalla gravità della patologia, dalla presenza di necessità amministrative e da molti altri fattori: ecco perché la definizione e l interpretazione dell appropriatezza di un esame di laboratorio risentono fortemente di aspetti soggettivi e sono difficilmente standardizzabili. È stato ragionevolmente proposto di riservare la definizione di «inappropriato» a ogni esame di laboratorio che «possa essere evitato senza esporre il paziente a un rischio significativo di danno per la salute». Un tentativo di soluzione può venire dall adozione, da parte del Laboratorio di Microbiologia, di una «gating policy» (7, 8). Questo temine identifica la prassi di migliorare l appropriatezza di un esame subordinandone l accettazione e l esecuzione alla soddisfazione di un set di criteri concordati con i clinici, senza la quale la richiesta stessa non viene presa in considerazione. Questi criteri sono essenzialmente di pertinenza clinica in quanto basati su rilievi clinici di selezione, precedentemente concordati ed esplicitati. Uno dei vantaggi più importanti di una richiesta appropriata di esami di laboratorio è la possibilità di applicare il «reflex testing» a cascata, come indicato in numerose linee-guida. In questo caso l informatica consente la piena automazione dei processi e abbina alla garanzia dell appropriatezza della richiesta l ulteriore vantaggio di una serie di risparmi (tempo, personale, reagenti, campione) (7). Il prelievo del materiale sfugge a molte delle limitazioni precedentemente rilevate quando esso non può o non si propone di utilizzare un metodo colturale e, di conseguenza, non richiede alcun accorgimento volto a garantire la sopravvivenza dei microrganismi. Detta impostazione può essere dettata da una necessità assoluta, senza alternative, oppure essere frutto di una scelta tecnica in funzione di problemi connessi con il sospetto diagnostico. Talvolta ci si trova di fronte alla ricerca di microrganismi la cui coltura in laboratorio o non è stata mai ottenuta o presenta tali difficoltà tecniche e tali incertezze di risultato da suggerirne l esclusione dalla pratica routinaria. È il caso dei prelievi destinati a un esame dove l osservazione al microscopio (di qualsiasi tipo e livello) esaurisce tutte le operazioni possibili. Ad esempio, i prelievi di sangue circolante per la ricerca dei plasmodi, delle microfilarie e degli emoflagellati (tripanosomi), nonché quelli dei materiali idonei per la ricerca, a seconda dei casi mediante esame a fresco o dopo colorazione, di ameba, Trichomonas, T. pallidum, M. leprae e dell associazione fuso-spirochetica, vengono utilizzati esclusivamente in indagini al microscopio ottico. Da quanto sopra, appare evidente che il «destino metodologico» che i campioni dovranno subire in laboratorio deve ovviamente guidare l esecuzione del prelievo e le successive modalità di preparazione del materiale prelevato. Si riporta, ad esempio, la Tabella 1 che evidenzia alcune delle possibili opzioni analitiche per la diagnosi di infezione da virus. METODI COLTURALI Una volta giudicato idoneo, il campione biologico prelevato è pronto per essere sottoposto alle opportune prove diagnostiche. Ci si trova a questo punto di fronte a tre possibilità di intervento: la via del metodo classico o colturale; la via del metodo rapido o non colturale; la scelta articolata di entrambi i percorsi. Nella pratica della microbiologia clinica, il metodo classico è adottato soprattutto in batteriologia e micologia. Viene con minor frequenza utilizzato in virologia e ancor più raramente in protozoologia. Con la sua esecuzione ci si prefigge l isolamento di microrganismi, tappa indispensabile per individuare la specie di appartenenza dei ceppi isolati e per effettuare su di essi ulteriori approfondimenti. Tali procedimenti richiedono idee chiare sull impiego dei terreni di coltura più idonei, la cui scelta si fonda sia sul sospetto diagnostico sia sulla natura del materiale in esame, in rapporto alla provenienza di quest ultimo da un distretto anatomico fisiologicamente sterile oppure da un area che, in condizioni di assoluta normalità, ospiti un microbiota residente. Nelle indagini orientate secondo il metodo tradizionale, l impiego dei terreni di isolamento comporta, soprattutto in batteriologia, una scelta plurima volta a coprire tutte le possibilità di coltura, specie quando il sospetto diagnostico non offra indirizzi specifici verso determinati microrganismi. Precisato che non esiste un terreno di coltura utilizzabile per la crescita di tutti i batteri, è bene sottolineare che, eccezion fatta per i prelievi provenienti da distretti non colonizzati, la situazione polimicrobica originale impone il ricorso a terreni selettivi e differenziali. I terreni solidi rappresentano,

6 in genere, lo strumento di base per le colture di isolamento e la loro selettività è una caratteristica valida per accelerare l iter del procedimento diagnostico. In alcuni casi (ricerca delle salmonelle nelle feci ecc.) i terreni selettivi liquidi, consentendo l impiego di inoculi notevolmente più abbondanti, aumentano le probabilità di coltura dei microrganismi ricercati. Tale concetto di selettività si applica in modo pertinente anche alla ricerca dei virus, dove il materiale da seminare nelle colture cellulari in vitro o, più eccezionalmente, nell uovo embrionato o in animali sensibili viene trattato con opportune miscele di antibiotici che, come ben noto, sono inattivi nei confronti dei virus. I terreni di coltura utilizzati per ottenere la crescita delle cellule «esposte» contengono, inoltre, diversi antimicrobici allo scopo di inibire la moltiplicazione dei batteri e dei miceti eventualmente presenti nel materiale patologico inoculato. ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE Isolamento significa ottenere colture microbiche pure; per realizzarlo è necessario disporre di una «colonia» (intesa come risultato della moltiplicazione di un unica cellula in un punto circoscritto del terreno solido), almeno in batteriologia e micologia. L isolamento è il presupposto indispensabile per arrivare all identificazione, attraverso un opportuno approfondimento delle proprietà morfologiche, fisiologiche, antigeniche, specificamente distintive del microrganismo studiato. Sia pure con pesi diversificati, la dimostrazione delle caratteristiche morfologico-tintoriali dei microrganismi isolati assume valore rilevante nel caso di tutti i procarioti ed eucarioti e permette di meglio impostare la prosecuzione delle indagini. Allo studio delle caratteristiche di crescita, delle attività biochimico-metaboliche, della sintesi di tossine ed enzimi particolari, si aggiunge a completamento la ricerca degli antigeni presenti, secondo un articolazione di approfondimenti estremamente variabile a seconda del microrganismo considerato. Gli schemi operativi di tali interventi sono ovviamente diversi a seconda che si tratti di batteri, funghi e micoplasmi o di virus e anche di protozoi. Se nel caso dei batteri l accertamento delle proprietà biochimico-metaboliche è assai spesso completato da quello delle caratteristiche antigeniche, nel caso dei funghi ha più rilevanza il riferimento alle proprietà morfologiche, che completa in maniera determinante la dimostrazione delle proprietà fisiologiche. Nel caso di virus le caratteristiche dell attività citopatogena saranno completate dall individuazione degli antigeni specifici attraverso l impiego di metodi diversi, che vanno dalla classica prova di neutralizzazione all immunofluorescenza fino al moderno impiego di sonde molecolari e tecniche di amplificazione degli acidi nucleici. Oggi per l identificazione dei microrganismi si dispone di metodi sensibilissimi e sofisticati grazie ai quali è possibile individuare fini proprietà immunologiche e genetiche. Tuttavia, va ancora una volta ribadito che tutte le informazioni così ottenute sono di limitata utilità pratica per stabilire il nesso eziologico, vale a dire il rapporto causale tra il microrganismo isolato e l episodio morboso oggetto di quella determinata indagine. METODI NON COLTURALI O RAPIDI Se accettiamo la definizione che la diagnosi delle malattie da infezione è una lotta contro il tempo, i cosiddetti metodi rapidi dovrebbero rappresentare l arma migliore a nostra disposizione. Invece, la loro utilità, pur notevolissima e in taluni casi addirittura rivoluzionaria, non si è dimostrata assoluta. Indicati come non tradizionali, questi metodi andrebbero meglio chiamati non colturali, allo scopo di rendere più chiara la differenza concettuale con i metodi fondati sull isolamento (4-6). Sorvolando sui dettagli, tra i metodi non colturali si possono includere tutte le tecniche che, partendo dalle indagini microscopiche tradizionali, si sono evolute beneficiando dei progressi della tecnologia. L aggancio in tal senso più diretto è rappresentato dai metodi di immunofluorescenza. Qui i vari microrganismi (batteri, comprese clamidie e rickettsie, micoplasmi, protozoi o miceti) possono essere dimostrati in seguito all unione con anticorpi marcati con fluorocromi. In tal modo alla rilevazione morfologica si aggiunge quella della presenza di determinati epitopi. Morfologia e specificità, dunque, che armonicamente convergono verso un risultato di grande portata diagnostica. Gli stessi ragionamenti possono essere avanzati per quei metodi nei quali, sempre ai fini di un osservazione al microscopio, l anticorpo sia stato precedentemente marcato con un enzima (per es., perossidasi). Anche nel campo della ricerca dei virus in immunofluorescenza sono stati raggiunti notevoli livelli metodologici grazie all impiego degli anticorpi monoclonali. In tali casi, pur non potendo far riferimento alla morfologia come per i microrganismi prima citati, è possibile l individuazione degli antigeni virali a livello della cellula ospite anche in rapporto alla successione degli eventi biosintetici virus-dipendenti (antigeni precoci e antigeni tardivi). Un applicazione di

7 tali procedure è utilizzata per la diagnosi di infezione da CMV (Cytomegalovirus) in pazienti trapiantati, in cui con la tecnica dell immunofluorescenza viene ricercata, nei leucociti del sangue periferico, la fosfoproteina strutturale pp65 del CMV (ppul83), molto abbondante e dotata di uno spiccato tropismo per il nucleo. Questo tipo di indagini virologiche può idealmente rappresentare l anello di congiunzione tra i già citati metodi morfoimmunologici e quelli nei quali l indagine è esclusivamente rivolta alla dimostrazione degli antigeni microbici come tali. Si può, infatti, affermare che la sostanza metodologica non muta, mentre, ovviamente, cambiano l antigene da ricercare, il relativo anticorpo noto da utilizzare e, soprattutto, il sistema di rivelazione dell immunocomplesso derivante dall unione dei due reagenti. Si viene così a disporre di un numero sempre crescente di tecniche immunoenzimatiche, radioimmunologiche ecc. che permettono di rilevare la presenza dei microbi attraverso la dimostrazione dei loro antigeni. Attualmente questo tipo di indagini presenta una grande varietà di soluzioni tecniche che trovano applicazione in ogni settore dell «eziologia microbica». Accanto ai metodi di immunofluorescenza, chemioluminescenza, radioimmunologia, immunoenzimatica, possono esser ricordate, anche con riferimento alla loro estrema praticità, le tecniche di agglutinazione passiva che utilizzano particelle di varia natura alla cui superficie sono state adsorbite molecole anticorpali note. Deve essere, inoltre, precisato che gli epitopi verso i quali anticorpi impiegati debbono esser necessariamente orientati possono trovarsi localizzati in antigeni strutturali del microbo ricercato o negli antigeni dei suoi prodotti esocellulari (tossine, enzimi). Per fare solo qualche esempio, l agglutinazione al lattice è ormai largamente usata per dimostrare, nel liquor e nel siero di sangue, la presenza di Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae tipo B, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Cryptococcus neoformans e, negli estratti di feci, l immunocromatografia su card viene impiegata per la ricerca della tossina di Clostridium difficile, di Rotavirus, di Adenovirus ecc. I metodi immunoenzimatici possono essere impiegati non soltanto per gli stessi scopi citati per la latex-agglutinazione, ma anche per la ricerca di antigeni di numerosi altri microrganismi, quali VRS, HBV, HIV, HSV, Adenovirus, Cytomegalovirus, Rotavirus, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae ecc., in situazioni che richiedono l esame del sangue, del siero o di altri materiali (4-6). Lo stesso ragionamento può essere applicato a quel largo insieme di tecniche diagnostiche che è diretta espressione delle attuali conquiste in tema di biologia molecolare. Si tratta delle sonde che permettono di porre in evidenza sequenze nucleotidiche specifiche di determinati microrganismi attraverso la formazione di duplex fra porzioni complementari di catene di DNA o RNA (9, 10). Particolare citazione merita il caso del Papillomavirus la cui individuazione nei prelievi bioptici mediante sonda si arricchisce della possibilità, sempre con le stesse tecniche, di stabilirne l appartenenza a uno dei quasi trenta genotipi. Espansione metodologica di tali sistemi, resa possibile dalle più recenti acquisizioni nel campo dell ingegneria genetica, è l amplificazione genica (PCR, RT-PCR, Realtime PCR, Microarray), la cui applicazione tecnica trova sempre più ampia diffusione (9, 10) (Tabella 2). Da un punto di vista generale si deve sottolineare che, oltre al fatto di essere generalmente molto più costosi di quelli colturali, i metodi non colturali presentano tutti lo svantaggio di non poter consentire di abbinare al risultato dell individuazione dei microrganismi i saggi di sensibilità agli antimicrobici. Questa limitazione ha, ovviamente, grande importanza nel caso dei batteri e progressivamente minor valore per i micoplasmi, i miceti, i virus e i protozoi. Le tecniche molecolari, a fronte di una sensibilità (virtualmente è possibile utilizzare il DNA di una singola cellula come template) e specificità maggiori rispetto alle altre, della loro robustezza (amplificazione possibile anche utilizzando acidi nucleici degradati o di bassa qualità), della velocità e facilità d uso (in poche ore si possono ottenere milioni di copie della sequenza di acido nucleico target), sono limitate dall esiguo numero di sequenze note di acidi nucleici rispetto alla totalità di quelle dei patogeni riconosciuti come tali e dalla necessità di una maggiore «complessità», anche strutturale, dei Laboratori che intendono avvalersi di queste tecnologie (9, 10). In aggiunta, poiché i microrganismi morti possono contenere acido nucleico amplificabile, un risultato ottenuto da una tecnica molecolare non necessariamente dimostra la presenza di patogeni vitali in un determinato campione clinico; è questo il caso della tubercolosi, in cui micobatteri non vitali rimangono a lungo nel polmone, rendendo difficoltosa la valutazione degli effetti della terapia. Questa peculiare situazione clinica ha fatto sì che venissero messe a punto tecniche di amplificazione che shiftano il target dal DNA bacillare alle molecole di mrna bacillare, generalmente dotate di un tempo di emivita molto più breve di quelle di rrna e del DNA stesso, riflettendo in modo molto più accurato la vitalità di questi batteri.

8 IL NESSO EZIOLOGICO La validità dei dati ottenuti con le indagini di laboratorio effettuate con metodi colturali e non colturali deve sempre essere accertata in base alla possibilità di stabilire il «nesso eziologico» (1, 2). È evidente, infatti, che l interesse della presenza di un microrganismo esiste se questa è correlabile con l episodio morboso oggetto dello studio, secondo i criteri valutativi dettati dallo stato dell arte. La vecchia distinzione dei microbi in patogeni e non patogeni (che pure ha avuto una funzione fondamentale salvando gli studi tassonomici dai dubbi suscitati dalle prime teorie sulla variabilità biologica) oggi non è più accettabile. Specialmente sul piano pratico e in un attenta rivisitazione del concetto di patogenicità, tale rifiuto non può essere aprioristico e impone un oculato impiego della terminologia. Dal punto di vista teoretico, i «patogeni» della suddetta vecchia suddivisione (quelli, per intenderci, perfettamente in regola con il rispetto dei postulati di Koch) sono certamente caratterizzati da attributi che li distinguono dalle specie che, in passato, erano giudicate non patogene (2, 4, 6, 8). In altri termini, questi patogeni, per così dire, classici e che vengono definiti convenzionali sono quelli in grado di provocare infezione e malattia in soggetti in stato di normalità o le cui difese immunitarie (intese in senso lato, secondo l etimo) sono integre. Distinti da questi microbi si presentano quelli che un tempo venivano considerati «non patogeni» e che, invece, possono provocare infezione e malattia soltanto in un ospite i cui poteri di difesa siano compromessi. E, con diretto riferimento a questa situazione condizionante, vengono per l appunto chiamati patogeni condizionali. I primi hanno una definita fisionomia di intervento che generalmente sfocia in uno stato patologico specifico, così che la loro dimostrazione lascia ben pochi dubbi sulla conclusione del procedimento diagnostico. Per contro, i patogeni condizionali, responsabili di fatti patologici relativamente non specifici, possono esser presenti anche in assenza di malattia in un soggetto in stato di normalità. Di conseguenza, alla loro dimostrazione in coincidenza di un evento patologico potrà esser attribuita importanza soltanto se se ne stabilisce il rapporto con la situazione dell ospite. Tale ragionamento deve esser ricollegato a quanto accennato a proposito del microbiota residente. Infatti, la stragrande maggioranza dei microrganismi che intervengono come patogeni condizionali è autoctona e, pertanto, componente delle comunità residenti della cute e delle mucose. Le difficoltà diagnostiche connesse con le situazioni descritte sono ovvie e sottolineano in maniera inequivocabile la già detta esigenza di ricercare una correlazione tra i dati strettamente microbiologici e quelli derivabili dallo studio clinico del paziente. Merita, infine, di esser ricordato che i patogeni condizionali possono anche provenire dall ambiente esterno. L importanza dello stato di compromissione delle difese del paziente emerge clamorosamente in diverse condizioni, come l AIDS, i trattamenti terapeutici immunosoppressivi, i traumi e le ustioni gravi, e anche la nutrizione parenterale, i dispositivi vascolari, le manovre endoscopiche ecc., che tanto spesso aprono un varco all ingresso dei microrganismi. Si tratta di chiari esempi di quanto oggi sia immanente il pericolo delle infezioni opportunistiche che possono esser causate sia da patogeni condizionali sia da patogeni convenzionali; il che, evidentemente, deve guidare l impostazione e l iter della relativa diagnosi microbiologica. Spessissimo la soluzione dei connessi problemi metodologici e interpretativi si sostanzia nel quesito: «questi microrganismi, presenti anche in un soggetto normale, sono responsabili dell episodio morboso studiato?». In ogni caso, una volta stabilito il nesso eziologico, se i dati di laboratorio emergono da indagini colturali, il ceppo isolato (di batteri o di micoplasmi o di miceti) viene sottoposto alle prove volte a determinare la sensibilità agli antimicrobici. I risultati in tal modo ottenuti dovranno esser attentamente valutati per la scelta del chemioantibiotico, considerando evidentemente le sue caratteristiche di farmacocinetica, di tossicità ecc. Diagnosi indiretta L enorme progresso compiuto dall immunologia ha certamente notevoli ricadute positive sulla diagnosi indiretta delle malattie da infezione. In tale operazione è insito il concetto del pressoché esclusivo riferimento alla dimostrazione degli anticorpi attraverso l impiego di antigeni microbici noti. Con questi procedimenti, però, l acquisizione del risultato si colloca in un momento più avanzato dell arco evolutivo del processo morboso rispetto a quello della disponibilità dei dati ottenibili con la diagnosi diretta. A titolo di mera citazione, possono esser ricordate come tecniche classiche l agglutinazione diretta, la fissazione del complemento, la flocculazione, l agglutinazione passiva, la neutralizzazione, l emo-agglutino-inibizione, nonché, come più moderne, l immunofluorescenza, la radioimmunologia (RIA), l immunoenzimatica (EIA), la chemioluminescenza (CLIA).

9 Abbastanza recentemente hanno preso piede alcune tecniche che permettono di porre in evidenza sia l isotipo di appartenenza degli anticorpi presenti sia la diretta specificità di tali anticorpi verso ben precisi antigeni, specialmente virali, facenti parte del corredo epitopico del microrganismo responsabile della stimolazione immunogena studiata. Nel primo caso, è ben nota la differenza di significato che si deve attribuire alla presenza delle IgM (prime a comparire e a scomparire), alle IgG (a comparsa più tardiva e a più duratura permanenza in circolo) e alle stesse IgA, sulla cui rilevanza diagnostica non vi è completo accordo. Con l immunofluorescenza e con i metodi immunoenzimatici, radioimmunologici e chemioluminescenti è agevole arrivare a tale differenziazione, che parrebbe avere una più precisa indicazione nella diagnosi sierologica delle malattie da virus e da protozoi. È evidente che i risultati raggiungibili con questi sistemi permettono di precisare la cronologia della risposta anticorpale o di arrivare alla sua individuazione con maggiori margini di sicurezza. Per quanto attiene alle IgM, si può affermare che la loro presenza può testimoniare l infezione recente e il movimento anticorpale rilevato può essere cronologicamente riferito all episodio morboso considerato. È doveroso, però, ricordare che in alcune malattie è stata dimostrata la permanenza in circolo delle IgM per periodi molto lunghi e, comunque, per un tempo notevolmente superiore a quello che le caratterizza nella classica curva della risposta a un immunogeno; inoltre, in caso di riscontro di IgM, è sempre necessario escludere la possibilità di un risultato falsamente positivo. Per tali motivi si sono implementate metodiche che aumentano la specificità del test mediante particolari tecniche analitiche (IgM a cattura, antisiero anti-fr ecc.) (5). Rimane il fatto che datare l insorgenza di un infezione può essere un procedimento complesso e delicato, con importanti ricadute sulla prognosi, come nel caso delle infezioni contratte durante la gravidanza. Ai fini della valutazione del rischio di danni fetali, insieme a indagini strumentali e di amplificazione genica, si ricorre oggi al test di avidità delle IgG (5, 6). Il termine di avidità anticorpale indica la forza con cui un anticorpo multivalente si lega a un antigene multivalente. Gli anticorpi prodotti nel corso della risposta primaria hanno un avidità per l antigene molto più bassa rispetto a quella degli anticorpi prodotti durante la risposta secondaria. Il grado di avidità degli anticorpi aumenta progressivamente e lentamente nel tempo ed è sinonimo di maturazione della risposta immune. Indici di avidità bassa indicano presenza di IgG a bassa avidità e sono da ascrivere a infezioni primarie in fase acuta o recente. Indici di avidità alta (presenza di IgG ad alta avidità) indicano, invece, assenza di infezione primaria in atto o recente. Nei soggetti immunocompetenti, indici a bassa avidità sono ritrovabili per un periodo di settimane dall inizio della sintomatologia. Utilizzando antigeni prodotti in momenti diversi della catena delle sintesi virus-comandate, si possono dimostrarne i rispettivi anticorpi in modo da individuare le tappe evolutive dell infezione studiata; è questo il caso della ricerca degli anticorpi verso il virus di Epstein-Barr (anti-vca, EA e EBNA) e verso il virus dell epatite B (anti-hbs e anti-hbc). Sul piano pratico, le informazioni così ottenute assumono rilevante importanza diagnostica e prognostica. Altro metodo interessante è l «immunoblotting», nel quale le proteine antigeniche del microrganismo studiato, separate mediante corsa elettroforetica e riportate su strisce di nitrocellulosa, vengono cimentate con il siero in esame. Gli immunocomplessi che si formano in corrispondenza degli antigeni separati vengono posti in evidenza facendo ricorso ad anti-immunoglobuline umane opportunamente marcate. La presenza delle bande in corrispondenza dei vari immunocomplessi evidenzia la pluralità della risposta anticorpale cui si è fatto cenno. Solo per citare qualche esempio, può esser ricordata l applicazione di tale sistema nella sierologia delle infezioni da HIV, HCV, Borrelie, CMV ecc.(2, 5). VALUTAZIONE DELLA QUALITÀ (QA) E CONTROLLO DI QUALITÀ (QC) La valutazione della qualità delle indagini microbiologiche è un concetto che è diventato parte integrante della gestione del paziente malato basata sull outcome clinico. In generale, il Quality Assessment (QA) si prefigge il monitoraggio continuo e il miglioramento dell attendibilità e dell efficacia delle pratiche correlate alla cura del paziente. Il benchmarking è un importante strumento di QA e produce due tipi di informazione: misure comparative di performance tra Dipartimenti all interno di un Organizzazione o tra Istituzioni simili per tipologia e complessità; pratiche che producono performances ottimali (6). Nell ambito del Laboratorio di Microbiologia, il benchmarking, sfruttando anche programmi di valutazione esterna di qualità (VEQ), viene promosso per migliorare l utilizzo dei test, per determinarne il valore clinico, per la riduzione del tempo di risposta, per la valutazione dell outcome clinico ecc., coinvolgendo anche aree diagnostiche e assistenziali diverse dal Laboratorio. Dopo che i dati comparativi sono stati stratificati e analizzati, i miglioramenti della diagnosti-

10 ca analitica sono implementati sulla base dei metodi che si dimostrano migliori nel contesto clinico. In aggiunta a queste attività di revisione continua di tutti i processi operativi, vengono istituiti programmi di controllo di qualità (QC) che verificano giornalmente la qualità dei campioni, le metodiche dei test, i reagenti, i terreni di coltura, gli strumenti, il personale, con una sistematica revisione dei risultati. L obiettivo delle pratiche di QA e QC è che i dati prodotti dal Laboratorio di Microbiologia e le informazioni cliniche che ne scaturiscono rimangano, nel tempo, accurati, affidabili e riproducibili. LA COMUNICAZIONE DEI RISULTATI La risposta del Laboratorio di Microbiologia al quesito posto dal clinico può essere rappresentata dai risultati dei vari test validati nella loro completezza in un unica mandata (referto finale) oppure rilasciati di volta in volta, come risultati preliminari di un processo analitico in divenire. Un esempio della prima soluzione include i risultati della ricerca di antigeni, colture negative, test di amplificazione genica; della seconda, le colture positive accompagnate da un report della colorazione di Gram e da un test di antibioticosuscettibilità. In ogni caso, devono possedere alcuni requisiti: a) devono essere tempestivi. I risultati devono essere disponibili per il clinico in un frame temporale che permetta l adozione di decisioni cliniche appropriate; b) devono essere redatti in un format leggibile, interpretabile, privo di ambiguità; c) devono essere descritti in una forma che sia priva di errori tipografici o trascrizionali. Il sistema informatico gestionale (LIS) deve essere in grado di ridurre il rilascio di dati di laboratorio errati o ingannevoli. Il supporto informatico è la chiave di volta per rendere disponibili in modo efficace i risultati dei vari test, poiché c è evidenza, in letteratura, che spesso le informazioni provenienti dal Laboratorio non vengano sufficientemente valutate, interpretate e utilizzate dai clinici (7). Di fronte a questa evidenza, sono state implementate molte iniziative volte a migliorare la qualità, la tempestività, l interpretazione della risposta di Laboratorio. Molti LIS, ad esempio, provvedono al calcolo del tempo di trasporto del campione, che viene riportato nel referto finale. Il tempo di trasporto è rappresentato dall intervallo di tempo che passa dalla raccolta del campione da parte del clinico alla presa in carico dello stesso da parte del Laboratorio; questa informazione può essere fondamentale per la valutazione di alcuni risultati colturali. Un altro importante parametro è rappresentato dal tempo di inoculo dei terreni di coltura, specie quando il Laboratorio è distante dal luogo di prelievo del campione. Molti LIS riportano nel referto il «tempo di semina» del campione, sia per identificare quelli che hanno subito un processo analitico ritardato, sia per calcolare il tempo trascorso nei casi di colture «in progress» che hanno dato esito: «nessuna crescita». Ovviamente, queste procedure possono essere implementate solo nel caso in cui i Reparti di cura, o le Strutture sanitarie assistenziali in generale, siano connessi in rete con il LIS del Laboratorio e dispongano, a loro volta, di un interfaccia informatica per la richiesta degli esami e la visualizzazione dei risultati. Un altro formidabile strumento per migliorare significativamente la qualità dell assistenza è rappresentato dalla possibilità di inserire commenti nel referto, fornendo una consulenza interpretativa al clinico per aiutarlo a formulare una diagnosi corretta; questa modalità di reporting si è resa necessaria anche per l introduzione di test sempre più complessi e innovativi, che hanno spesso un forte impatto sul processo decisionale clinico, per il continuo aggiornamento della tassonomia dei microrganismi, per la diffusione di pratiche basate sulle prove di efficacia e sull attivazione di numerose linee guida (7). L aumento delle comunicazioni informatiche, fra gli enormi e indiscussi vantaggi, produce anche un immensa mole di dati e di informazioni che il medico deve gestire e, pertanto, l attivazione di «filtri» interpretativi che facilitino il ragionamento clinico trova una sempre più ampia applicazione nei Laboratori di Microbiologia. Un esempio tipico è dato dall interpretazione del quadro microscopico di un preparato delle vie aeree inferiori colorato al Gram. L identificazione presuntiva del microrganismo è molto più utile della semplice descrizione morfologica, quale potrebbe essere, ad esempio, «presenza di coccobacilli Gram negativi»; aggiungere a questa descrizione il commento «verosimile H. influenzae» sostanzia l informazione di un notevole valore clinico. Inoltre, nei casi di difficile interpretazione, oggi è possibile includere immagini digitali di preparati colorati (Gram, Ziehl Neelson, Lugol ecc.) in files che possono essere messi in rete e valutati a distanza da specialisti di Centri di riferimento, in modo da usufruire di una «second opinion». Infine, lo sviluppo dell Information Technology e, in particolare, la crescente possibilità di utilizzare sistemi esperti e algoritmi diagnostici facilitano la diffusione della pratica e della qualità del commento interpretativo.

11 L IMPATTO DELL AUTOMAZIONE E DELL INFORMATION TECHNOLOGY In uno scenario dove le risorse economiche da destinare al perseguimento e al mantenimento della salute della popolazioni sono sempre più compresse, la strada dell efficienza e dell efficacia ha portato all adozione di politiche sanitarie tese al miglioramento della qualità dell assistenza sanitaria non attraverso una visione parcellizzata dei costi e al loro contenimento, ma all ottimizzazione del risultato economico globale (7, 8, 11, 12). Le spinte a un simile cambiamento sono giunte da un processo che sta avvenendo su scala mondiale e che porta a una revisione generale della rete dei Laboratori clinici, con la formazione di un network di Laboratori territoriali, con adeguato bacino di utenza, con un congruo repertorio di test, interconnessi con grandi Laboratori centrali, di secondo-terzo livello, dove si concentri l esecuzione di tutte quelle metodiche ad alta tecnologia il cui utilizzo diventi cost-effective in relazione alla massa dei campioni trattati. L aumento di richieste di prestazioni sanitarie che sale da una popolazione in progressivo invecchiamento e il continuo sviluppo di nuove tecnologie ha fatto sì che anche la diagnostica microbiologica tenda a evolvere prendendo in considerazione l automazione di tutto il processo diagnostico, comprese le fasi pre-analitiche e post-analitiche. Si sono sviluppati analizzatori capaci di gestire simultaneamente un gran numero di procedure analitiche in completa automazione: identificazione positiva del campione tramite codice a barre, centrifugazione on board, trasporto del campione sull analizzatore, processo del campione da provetta primaria (prelievo, diluizione e dispensazione del siero), distribuzione dei reagenti, incubazione e lettura, refertazione dei risultati e utilizzo di software con algoritmi integrati di sistema esperto per la validazione dei risultati e per la gestione dei dati epidemiologici. Il consolidamento e l automazione consentono oggi di gestire grosse routines (centinaia di campioni in poche ore) con un ottimizzazione dei flussi di lavoro (13). Molte soluzioni integrate (Total Lab Automation) prevedono il collegamento fisico di diversi strumenti per mezzo di una catena-nastro trasportatore, fino a realizzare un unico sistema, dove la fase di accettazione e di preparazione (fase pre-analitica), di gestione dei campioni durante tutto il loro ciclo analitico (fase analitica), di elaborazione della risposta (refertazione) e archiviazione dei campioni (fase post-analitica) sono gestite da software (middleware) interconnessi con il LIS, a sua volta collegato bidirezionalmente con i Reparti ospedalieri, Medici di base, Strutture sanitarie territoriali (8, 10-12, 14). Una simile epocale rivoluzione è stata possibile solo grazie all enorme sviluppo negli ultimi anni dell Information Technology, che è diventata un vero e proprio sistema di gestione, esplicando in maniera integrata funzioni particolarmente significative: supporto al controllo dei costi, controllo di qualità on line, supporto alla gestione del manuale della qualità. In questo scenario la nuova disciplina è diventata elemento strategico nel management clinico del paziente. In questo contesto essa ha permesso di sviluppare e favorire l «appropriatezza in medicina» che, come scrive il Prof. Plebani (7) «è il grado con il quale viene erogato un sistema di cura e di promozione della salute consistente nel rispetto ai bisogni clinici dell individuo e in accordo con lo stato più aggiornato delle conoscenze e delle pratiche cliniche (current knowledge and best practice). In tal senso, i due capisaldi di appropriatezza in medicina sono: un servizio centrato sui bisogni clinici del paziente e la competenza nell esecuzione delle procedure e, più in generale, nell erogazione dell assistenza». Bibliografia 1. Meloni G.A.: Il prelievo dei campioni per l esame microbiologico. In: Burlina A. Guida Clinica all Esame di Laboratorio, C.G. Ed. Med. Scient., Torino, 57-69, Meloni G.A.: Basi biologiche ed espressione della patogenicità nei protisti. In: Aggiornamenti di Patologia Clinica, UTET, Torino, , La Placa M.: Principi di Microbiologia Medica. Esculapio Editrice, Forbes B.A., Sahm D.F., Weissfeld A.S.: Bailey and Scott s Diagnostic Microbiology. C.V. Mosby Company, ST. Louis, Balows A., Hausler Jr. W.J., Herrmann K.L. Isenberg H.D., Shadomy H.J.: Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology, Washington, Isenberg H.D. Essential procedures for Clinica Microbiology. American Society for Microbiology, Washington, Plebani M., Mussap M.: Information Technology, automazione e appropriatezza: le logiche organizzative e le logiche diagnostiche. Riv. Med. Lab.-JLM, vol. 5(2), Giavarina D., Soffiati G.: L automazione nella prevenzione degli errori. RIMeL/IJLaM, 2 (Suppl.), Eisestein B.I.: New molecular techniques for microbial epidemiology and the diagnosis of infections diseases. J. Infect. Dis., 161, , Mackay I.M.: Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect., 10, , 2004.

12 11. Pradella M., Pastorino A.: L information technology nella prevenzione e nella sicurezza del dato di laboratorio. RIMeL/IJLaM, 2 (Suppl.), Dorizzi R.: Una roadmap per la Information Technology in Medicina di Laboratorio. RIMeL/IJLaM, 3, Colombrita D., Bassani L., Caruso A.: Nuove frontiere nella diagnostica microbiologica. Bollettino di Microbiologia e Indagini di Laboratorio news Sirse Editore, vol. 11(3), Bates D.W., Gawande A.A.: Improving safety with Information Technology. N. Engl. J. Med., 348, , ANTONIO CONTI Specialista in Microbiologia e Virologia Responsabile UOS di Microbiologia e Terapia antibiotica Laboratorio Analisi cliniche e Microbiologia Ospedale Orlandi, Bussolengo (Vr) ULSS 22 Regione Veneto

13 TABELLE E IMMAGINI

14 TABELLA 1 Metodi per l identificazione dei virus (da Yolken H., Lennette D. Algorithms for detection and Identification of Virus. Manual of Clinical Microbiology, 7h Edition, modificata) Virus Applicabilità Coltura cellulare Microscopia Met. molecolari Immunoassay Adenovirus A B C A CMV A B A A Enterovirus A D A C EBV D B A A HSV 1-2 A A A B HIV B B A B HCV D D A A HBV D B A A HPV D B A C RSV A A C A Morbillivirus B B B C Rubella virus B A B A Influenza virus A A C B Legenda: A = il test è generalmente utile per la diagnosi; B = il test è utile per la diagnosi in alcune circostanze e per alcune specifiche forme di infezione; C = il test è raramente utilizzabile per la diagnosi, ma può essere disponibile in Laboratori di riferimento per studi epidemiologici o per la diagnosi in situazioni inusuali; D = il test generalmente non viene utilizzato per la diagnosi di infezione.

15 TABELLA 2 Metodi di amplificazione genica (da Tang I.W.,Persing D.: Molecular detection and identification of Microrganisms. Manual of Clinical Microbiology, 7h Edition, modificata) Metodo Tipo di Enzima/i Temperatura Ac. nucleico amplificazione utilizzati d esercizio target PCR Target Taq DNA polimerasi Thermal DNA/RNA Cycler TMA Target RT, RNA pol., Isoterma RNA/DNA RNase H NASBA Target RT, RNA pol., Isoterma RNA/DNA RNase H SDA Target Restr. endonucleasi Isoterma DNA DNA polimerasi QβR Probe Qβ replicasi Isoterma DNA/RNA LCR Probe DNA ligasi Thermal DNA Cycler bdna Segnale Nessuno Isoterma DNA/RNA

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