ALLflow Elution Technologies Gluten Rapid Test

Transcript

1 ALLflow Elution Technologies Gluten Rapid Test Lateral Flow kit Cat. # ETGLTN-1005 Kit per la rilevazione rapida del glutine in campioni alimentari ed ambientali Manuale d uso Leggere attentamente il manuale prima di procedere all uso del kit Certificazione AOAC # Via San Geminiano, San Prospero (MO)- Italy (: : *: immunolab@generon.it : [1] Manuale d uso - ALLflow Gluten Rapid Kit - Rev. 3 22/02/2017

2 1 Principio del test e suo utilizzo Il test si basa sulla tecnologia Lateral Flow Device (LFD), un metodo analitico immunocromatografico in cui un anticorpo policlonale specifico per l identificazione di gliadina derivata da grano, orzo o segale è immobilizzato su un supporto solido. Questo test è stato progettato per lo screening di residui di glutine in materie prime, prodotti finiti, acque di lavaggio industriale (CIP - Clean in Place Solution), campionamenti da superficie mediante tamponi. Utilizzando il protocollo standard su matrici semplici con basso livello di interferenti è possibile rilevare indicativamente 5 ppm di glutine (5 µg/ml/100 cm2 con tamponi). Il range dinamico del metodo standard si attesta essere tra i 2.5 ppm e i 100,000 ppm. La metodica di analisi non necessita di ulteriori controlli interni, il test applicato su grano, orzo e/o segale non produce falsi positivi. Gli anticorpi utilizzati in questo test non evidenziano reattività incrociata con: Avena, Soia, Riso, Miglio, Mais, Sorgo, Uova, Semi di Lino, Amaranto, Spezie, Erbe Aromatiche e Patata. Il metodo (procedura standard) è stato validato per la rilevazione di glutine in grano saraceno, sciroppo di cioccolato, cereali secchi, latte di soia pastorizzato, farina di riso, soluzione CIP e mediante campionamento con tampone su una superficie di acciaio inossidabile. Come tutti i metodi di analisi per il settore alimentare anche questo test deve essere validato sulla specifica matrice di interesse per escludere la presenza di sostanze inibitrici che potrebbero determinare risultati non attendibili. Materiali inclusi nel kit 50 ml di Extraction Buffer 25 Lateral Flow Devices (LFDs) 26 microtubi da centrifuga da 2 ml Tamponi per il prelievo del campione, pipette di plastica Modalità di conservazione L Extraction Buffer può essere conservato a temperatura ambiente per 90 giorni. Per tempi più lunghi conservare a 4-8 C. Non congelare i componenti del kit. I reagenti non devono essere esposti alla luce o a fonti di calore (>30 C). Conservare in luogo pulito ed asciutto. Strumenti richiesti per l esecuzione dell analisi Bilancia (ACC4038), timer, cucchiaini, micropipette (ACC3014, ACC3015), vortex (ACC3003), centrifuga (ACC3064 o ACC3507), bagnomaria (ACC3914) o termoblocco (ACC6037), termometro. Indicazioni generali Ilbuffer contenuto nel kit è validato in modo lotto specifico per cui non è intercambiabile con altri lotti. Per evitare contaminazioni non utilizzare la stessa pipetta per analizzare più campioni. Attendere che tutto il materiale sia a temperatura ambiente prima di effettuare l analisi. Utilizzare la quantità richiesta di buffer e aver cura di conservare il rimanente in luogo refrigerato. Quattro gocce prelevate con una pipetta corrispondono a 100 µl circa. Per assistenza consultare i tecnici Generon ( - immunolab@generon.it) o in alternativa il sito dove sono disponibili istruzioni video per il corretto utilizzo del test. [2] Manuale d uso - ALLflow Gluten Rapid Kit - Rev. 3-22/02/2017

3 2 Preparazione di campioni alimentari (indicazioni generali) 2.1 Preparazione di campioni solidi (generici) 1. Prelevare un campione rappresentativo del prodotto e macinarlo fino ad ottenere un composto omogeneo. 2. Pesare 0.2 g del campione macinato in un tubo da microcentrifuga. 3. Aggiungere 1.8 ml di Extraction Buffer. 4. Agitare vigorosamente per almeno tre minuti (può essere utile un vortex). 5. Centrifugare per 30 secondi a circa 7000 rpm. 6. Prelevare la parte centrale del surnatante ed eseguire il test. La sensibilità raggiungibile con questo protocollo è indicativamente 5 ppm di glutine per matrici con basso livello di interferenti (come ad esempio farina di mais contaminata da semola di grano duro). Si raccomanda in ogni caso di eseguire valutazioni di sensibilità attraverso esperimenti di spiking (rafforzati) per determinare correttamente le performances analitiche sulla matrici in analisi (per supporto sulle specifiche applicazioni contattare Generon). 2.2 Preparazione di campioni liquidi 1. Aggiungere 900 µl di Extraction Buffer in un microtubo da centrifuga. 3. Aggiungere 100 µl del campione ben agitato. 4. Agitare vigorosamente. 5. Il campione estratto è ora pronto per l analisi. Nota bene: Se il campione si dovesse presentare troppo viscoso e non corre bene sulla strip, centrifugare oppure diluire 1:1 il campione con Extraction Buffer prima di ripetere il test (in caso di ulteriori difficoltà contattare Generon). 2.3 Preparazione di campioni contenenti cioccolata (solidi e liquidi) Fase 1 Campioni di cioccolata liquida 1. Inserire 500 µl del campione liquido ben mescolato in un microtubo da centrifuga. 2. Aggiungere 500 µl di Extraction Buffer già preriscaldata a 60 C. Mescolare bene e procedere alla fase 2. Campioni di cioccolata solida 1. Prelevare un campione rappresentativo del prodotto e macinarlo fino a ottenere un composto omogeneo. 2. Pesare 1 g del campione in una microtubo da centrifuga. 3. Aggiungere 1 ml di Extraction Buffer già preriscaldato a 60 C. Mescolare bene fino a che il cioccolato non si scioglie omogeneamente nella soluzione. Procedere alla fase 2. Fase 2 Campioni di cioccolata liquida e solida 1. Inserire 900 µl di Extraction Buffer in un nuovo microtubo da centrifuga. 2. Aggiungere nello stesso microtubo 100 µl del campione derivante dalla fase 1. Centrifugare per circa 15 secondi a rpm. 3. Il campione ora estratto è pronto per l analisi. [3] Manuale d uso - ALLflow Gluten Rapid Kit - Rev. 3-22/02/2017

4 3 Preparazione di campioni alimentari (indicazioni speciali) In questo capitolo vengono descritti metodi d uso validati da Generon su specifiche matrici agro-alimentari. Il rapporto di validazione è disponibile a richiesta. 3.1 Preparazione di campioni di farina mais (contaminati da polvere o frammenti di grano): 1. Macinare e pesare 0.2 g del campione in un microtubo da 2 ml. 2. Aggiungere 1,8 ml di soluzione di Extraction Buffer. 3. Agitare (caldamente consigliato il vortex) fino alla completa sospensione della polvere. 4. Incubazione del microtubo in termoblocco per 10 minuti a 80 C, avendo cura di agitare dopo il primo minuto, dopo il secondo e in seguito ogni 2 minuti fino al termine dei 10 prestabiliti. Ogni agitazione deve portare alla risospensione del pellet che eventualmente si può formare sul fondo del microtubo. 5. Agitare vigorosamente e centrifugare 1 minuto a circa 7000 rpm. 6. Prelevare la parte centrale del surnatante ed eseguire il test. La sensibilità riscontrata con questo protocollo su mais è di 2 ppm (± 0,5). Le matrici utilizzate per la validazione del protocollo sono state contaminate con semola macinata di grano duro. In caso si riscontri una positività è sempre consigliabile ripetere il campionamento e il test per confermare il risultato, in quanto il campione analizzato (0,2 g) potrebbe non essere abbastanza rappresentativo. [4] Manuale d uso - ALLflow Gluten Rapid Kit - Rev. 3-22/02/2017

5 4 Preparazione di campioni ambientali 4.1 Preparazione di campioni "Clean in Place Solution" (soluzione CIP) 1. Misurare 800 µl di Extraction Buffer in un microtubo. 2. Utilizzando la stessa pipetta, aggiungere 200 µl di soluzione CIP e agitare bene per circa 30 secondi. 3. Il campione estratto è ora pronto per l analisi. Per ottenere risultati migliori il ph del campione dovrebbe essere compreso tra 5 e 10. Se il ph non rientra in questo range, diluire il campionel 1:1 in Extraction Buffer (100 µl di campione µl di Extraction Buffer) fino a che il ph non rientra in questi parametri. Questo potrebbe ridurre la sensibilità. Se si analizzano diversi campioni, assicurarsi di non utilizzare la stessa pipetta per evitare contaminazioni. 4.2 Preparazione di campionamenti mediante tamponi (Swab) 1. Aggiungere 500 µl di Extraction Buffer in un microtubo. 2. Imbibire un tampone pulito con l Extraction Buffer contenuto nel microtubo. Eliminare dal tampone la soluzione in eccesso premendo delicatamente contro l interno del microtubo. 3. Strofinare la superficie di interesse con il tampone, muovendosi avanti e indietro. 4. Reinserire il tampone nel microtubo ruotandolo e agitandolo diverse volte in modo da rilasciare il campione all interno. Rompere a metà il tampone in modo da poter chiudere il tubo, chiudere e agitare vigorosamente. [5] Manuale d uso - ALLflow Gluten Rapid Kit - Rev. 3-22/02/2017

6 5 Procedure specifiche per l esecuzione del test Prima dell uso attendere che il test LFD raggiunga la temperatura ambiente. 1. Rimuovere un test LFD dalla confezione e posizionarlo su di una superficie pulita, piana ed asciutta. 2. Prelevare 100 µl di campione estratto dallo strato intermedio con una micropipetta o una pipetta di plastica pulita (4 gocce). 3. Aggiungere i 100 µl di estratto nell area di applicazione del campione (cavità rotonda) sulla cassetta Lateral Flow e impostare il timer a 11 minuti. Interpretazione dei risultati ottenuti Valutare il test tenendo presente i seguenti riferimenti: - La linea superiore (linea di controllo o control line), sarà all altezza della lettera C. - La linea inferiore (linea del test o test line), sarà all altezza della lettera T. Tabella riassuntiva dei risultati Controllare la situazione del test dopo 5 minuti seguendo le indicazioni della tabella sottostante: se dopo 5 minuti la linea di test è ancora assente e la linea di controllo presente, attendere gli 11 minuti. Tempo di lettura Linea Controllo Linea Test Validità Risultato 5 minuti Assente Presente o Assente Test non valido - 5 minuti Presente Assente Test non completato (attendere gli 11 minuti) - 5 minuti Presente Presente Valido Altamente positivo 11 minuti Presente Assente Valido Negativo 11 minuti Presente Presente Valido Positivo Dopo 15 minuti Lettura non attendibile [6] Manuale d uso - ALLflow Gluten Rapid Kit - Rev. 3-22/02/2017

7 6 Domande frequenti 1. Il campione non riesce a migrare lungo la strip entro i primi 5 minuti. Il campione potrebbe essere troppo viscoso e necessita di essere centrifugato se questo non è già stato fatto durante la preparazione. Se il campione è già stato centrifugato diluire ulteriormente il campione 1:1 con Extraction Buffer. Questo potrebbe ridurre la sensibilità del test. 2. Sulla linea di test compare una macchia rossa ma tutto il resto è chiaro. La causa potrebbe essere il particolato contenuto nel campione stesso che potrebbe aver attraversato il filtro posizionato sul LFD all interno della cassetta. Ripetere il test prendendo un nuovo test LFD e utilizzando il medesimo estratto dopo averlo centrifugato per eliminare il particolato. 3. Le farine o gli ingredienti che contengono una elevata concentrazione di gomme (ad esempio xantano) potrebbero non correre efficientemente lungo la strip. Per ovviare al problema prelevare 0.3 grammi di campione e diluirlo in 600 µl di etanolo al 60%, agitare per 30 secondi e in seguito centrifugare per 20 secondi. Successivamente prelevare 100 µl dalla fase liquida e caricare su un nuovo test. 7 Dichiarazione di non responsabilità Generon S.p.A. non si assume responsabilità di alcun tipo, esplicite o implicite, eccetto garantire che i materiali di cui i propri prodotti si compongono sono di qualità standard. In caso di materiale difettoso, Generon S.p.A. si impegna a fornire un prodotto sostitutivo. Generon S.p.A. non è tenuta a rispondere per qualunque danno, inclusi danni speciali o consequenziali o spese che derivano direttamente o indirettamente dall`uso di questo prodotto. L acquirente può duplicare questo documento, in tutto o in parte, solo per scopi interni, a condizione che questa nota venga riportata in tutte le copie. Nella duplicazione l acquirente si impegna a compiere ogni ragionevole sforzo per impedire l'uso non autorizzato e la distribuzione delle informazioni sulla proprietà. 8 Servizio di Validazione Matrice Specifica Generon mette a disposizione dei clienti tutta l esperienza del proprio staff di ricerca e sviluppo proponendo un servizio di validazione e verifica dell utilizzo dei prodotti sulle matrici di interesse. Grazie alla collaborazione con i nostri partner siamo in grado di fornire anche ottimizzazioni del protocollo analitico per superare eventuali difficoltà legate alla tipologia di matrice. Questi sono solo alcuni dei vantaggi che ti offre il servizio di validazione di Generon "Prova" del kit che non richiede il vostro tempo e che restituisce un alto contenuto informativo utilizzabile anche nel caso insorgano problemi analitici. Allineamento tra performance attese dal cliente e obiettivi di qualità di fornitura di Generon Conoscenza della linearità di misura e del limite di rilevabilità sperimentale prima dell inserimento del metodo all interno dei propri piani di controllo, che minimizza il rischio di falsi negativi o falsi positivi. Valutazione delle performance indipendente da test eseguiti con altri metodi Possibilità di avere campioni da utilizzare come controlli di processo analitico Relazione finale utilizzabile ai fini della stesura dei piani di controllo secondo le indicazione delle norme ISO [7] Manuale d uso - ALLflow Gluten Rapid Kit - Rev. 3-22/02/2017