Il Genoma mitocondriale (mtdna) umano

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1 Il Genoma mitocondriale (mtdna) umano

2 e/ Il genoma umano 23 coppie di cromosomi + mtdna Nucleo della cellula Autosomi Localizzato nei mitocondri X Y DNA nucleare 3,2 x 10 9 bp (sequenziato completamente nel 2001) Cromosomi sessuali DNA mitocondriale mtdna bp (sequenziato completamente nel 1981)

3 Genoma circolare extra-nucleare di coppie di basi (bp) DNA mitocondriale umano (mtdna)

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5 DNA mitocondriale umano (mtdna) 1 Regione di controllo ( ) Filamento leggero-l ricco in citosine Filamento pesante-h ricco in guanine Regione codificante (37 geni) 2 rrna (12S e 16S) 22 trna 13 proteine (OXPHOS) ND1-ND6 e ND4L (complesso I: NADH-Ubichinone ossidoreduttasi) Cyt b (complesso III: ubichinolo-citocromo b ossidoreduttasi) COI-COIII (complesso IV: citocromo c ossidasi) ATP 6, ATP 8 (complesso V: ATP sintetasi)

6 I complessi della catena respiratoria nel mitocondrio

7 Regione di controllo ( ) IT H1 trna Phe HSP1 LSP CSB 3 CSB 2 CSB 1 IT L O H O H trna Pro nt 500 TFAM TFAM TFAM nt 400 TFAM nt 300 TFAM nt 200 nt 100 nt HVS-III ( ) HVS-I ( ) HVS-II ( ) HVS-III ( ) CSB1, CSB2, CSB3 sequenze conservate Origine di replicazione filamento H HVS-II (44 340) HVS-I ( )

8 Replicazione dell mtdna La replicazione è semi-conservativa ed indipendente dalla fase del ciclo cellulare il turn-over dei mitocondri richiede sintesi del DNA anche in cellule in G0 mentre l ndna si replica solo in fase S Coinvolte: DNA polimerasi g, Fattori TF, RNA primers no proofreading Il modello classico della replicazione del DNA mitocondriale (Clayton) descritta nell Uomo (valido per tutti i Vertebrati) La modalità di replicazione secondo il modello è asincrona entrambi i filamenti si replicano come leading strand, ma in tempi diversi, formando una struttura detta D-loop (ansa) dapprima inizia a replicarsi il filamento pesante (da OH) l origine del filamento leggero entra in funzione quando la replicazione del filamento H giunge a tre quarti, dove incontra una struttura a forcina che viene riconosciuta dalla DNA polimerasi, attivando una particolare primasi ->inizio replicaz. Modello alternativo: nei mammiferi è stata proposta una modalità bidirezionale sincrona di replicazione, che parta contemporaneamente dalla regione OriH, oppure nelle immediate vicinanze (Holt et al.2000; Bowmaker et al.2003).

9 Replicazione dell mtdna (basi molecolari) La replicazione di entrambe le eliche richiede la presenza di RNA primer di innesco. A livello dell' OH i primer sono prodotti dall'rna polimerasi mitocondriale, mentre a livello dell'ol sono prodotti da una RNA primasi specifica. L RNA polimerasi ha bisogno di TFAM per aprire il DNA, e due fattori TFBM. Si può formare una struttura ibrida a tripla elica (R-loop), su cui agisce una endoribonucleasi (Mitochondrial RNA-processing, MRP) che la processa a livello delle CSB (conserved sequence blocks). La proteina MRP lascia un primer per la DNA polimerasi γ (POLG) Questa è formata da due subunità, quella maggiore ha attività polimersica ed esonucleasica 3 5, che inizia la replicazione del filamento pesante. La subunità minore aumenta la processività Intervengono proteine accessorie, come un importante DNA elicasi (TWINKLE) e una Topoisomerasi che mantiene aperto il DNA che deve rimanere svolto a lungo dato il sistema di replicazione chiamata mtssb (single strand binding protein), che presenta un elevata similarità di sequenza con l omologa in E. coli.

10 Replicazione dell mtdna (basi molecolari)

11 Regione di controllo ( ) IT H1 trna Phe HSP1 LSP CSB 3 CSB 2 CSB 1 IT L O H O H trna Pro nt 500 TFAM TFAM TFAM nt 400 TFAM nt 300 TFAM nt 200 nt 100 nt HVS-III ( ) HVS-II (44 340) HVS-I ( ) HVS-I ( ) HVS-II ( ) HVS-III ( ) CSB1, CSB2, CSB3 sequenze conservate LSP promotore filamento L HSP1 primo promotore filamento H IT L sito d inizio della trascrizione per L IT H1 sito maggiore d inizio della trascrizione per H TFAM siti di legame per fattore di trascrizione mitocondriale A

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13 Si osservano deviazioni dal codice genetico universale in molti gruppi tassonomici. Il codice genetico universale è mantenuto nei protisti (es. Reclinomonas americana) e nelle piante. La deviazione più frequente si osserva per in codone UGA che invece di essere un codone di stop codifica per il Triptofano. Variazione nel codice genetico barriera al trasferimento ulteriore di geni dal genoma mitocondriale a quello nucleare

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15 Mutazione e Fissazione Gli errori nella trasmissione genetica Mutazioni puntiformi Inserzioni Delezioni Riarrangiamenti di vario tipo sono alla base dei processi evolutivi che da una forma di vita primitiva hanno prodotto la diversità delle forme di vita attuali La fissazione all interno di una popolazione può risultare da: selezione naturale capacità differenziata di riproduzione di individui geneticamente distinti (o genotipi) all interno di una popolazione determinata dal proprio livello di adattamento all ambiente rispetto ad altri individui della stessa specie contrasta la fissazione di mutazioni svantaggiose; favorisce la fissazione di mutazioni vantaggiose e non ha alcuna influenza sulle mutazioni neutrali deriva genica casuale (neutral genetic drift) può produrre la fissazione di mutazioni neutrali attraverso un processo stocastico per cui la frequenza dell allele mutato può aumentare nel tempo in seguito ad un processo di tipo esclusivamente casuale

16 Mutazioni del DNA mitocondriale Il DNA mitocondriale può andare incontro a mutazioni genetiche di due categorie riarrangiamenti strutturali o mutazioni puntiformi. I riarrangiamenti strutturali osservati riguardano spesso delezioni più raramente duplicazioni derivate da eventi di ricombinazione fra molecole diverse Per quanto riguarda le delezioni, il D-loop viene sempre conservato, in quanto indispensabile per la replicazione. Si possono avere mutazioni puntiformi, generalmente sostituzioni o delezioni di singoli nucleotidi. Singole mutazioni possono causare la perdita di funzionalità del trna.

17 Mutazioni del DNA mitocondriale Somatiche Numerose, non vengono trasmesse alla generazione successiva Rilevanti per la salute solo quando si accumulano in grande quantità Aumentano con l età Sia mutazioni puntiformi che delezioni Conseguenze differenti nei diversi tessuti (cervello, muscolo) Germinali Rare e vengono trasmesse alla generazione successiva Polimorfismi o mutazioni patogene

18 Mutazioni della linea germinale Mutazioni neutrali Possono essere perse per deriva genetica Possono fissarsi e raggiungere frequenze polimorfiche Secondo la definizione classica di polimorfismo l allele più raro dovrebbe avere una frequenza minima pari a 1% Esistono da molto tempo Omoplasmia Mutazioni lievi Non riducono significativamente la fitness dell individuo Possono fissarsi Mutazioni lievi + Mutazioni somatiche Effetti clinici Mutazioni gravi Effetti clinici Eliminate per selezione Eteroplasmia Eventi recenti

19 I meccanismi associati sono tuttora spesso sconosciuti PATOLOGIE ASSOCIATE ALL mtdna trna-ile mutations CARDIOPATHY 3243A->G MELAS 16S CPEO DDM L UUR ND1 1555A->G DEAFNESS (aminoglycosides) I M ND2 D-loop T F 12S V P 3460G-A 11778G->A 14484T->C Q A N C Y W LHON S UCN cyt. b mutations MYOGLOBINURIC Cyt.b MYOPATHY E ND6 ND5 L CUN S AGY H ND4 ND4L R ND3 G COIII COI ATPase6/8 trna-ser mutations D COII K DEAFNESS 8993T->G 8344A->G NARP/MILS MERRF D E L E T I O N PEO, KSS, Pearson

20 Mutazioni nei geni coinvolti nella sintesi proteica A1555G nel gene per l rrna 12S Sordità neurosensoriale non sindromica di tipo familiare A3243G nel gene per il trnaleu(uur) MELAS - Encefalomiopatia mitocondriale con acidosi lattica ed episodi di ictus CPEO - Sindrome esterna progressiva cronica di oftalmoplegia (paralisi dei muscoli oculari) Cardiomiopatia (elevata % mutante) Diabete senile e sordità (bassa % mutante) A8344G nel gene del trnalys MERRF - epilessia mioclonica con le fibre rosse stracciate e progressivo indebolimento muscolare T4291C nel gene trnaile Vasta gamma di disordini metabolici quali epilessia, ipercolesterolemia e ipomagnesemia (Wilson et al. 2004)

21 Mutazioni missenso ND1-G3460G; ND4-G11778A e ND6-T14484C LHON - neuropatia ottica di Leber ND6-G14459A: Distimia (nevrosi depressiva) in associazione con la LHON ATP6-A8993G in funzione del livello di eteroplasmia: NARP sindrome con neuropatia, atassia e retinite pigmentosa Degenerazione maculare, ritardo mentale etc. MILS - sindrome di Leigh ad eredità materna (grave forma di NARP) DELEZIONI CPEO - oftalmoplegia (paralisi dei muscoli oculari) esterna cronica progressiva KSS - sindrome di Kearn-Sayre (oftalmoplegia, retinite pigmentosa e miopatia cardiaca) Sindrome di Pearson (anemia sideroblastica, pancitopenia ed insufficienza del pancreas esocrino con malassorbimento intestinale)

22 Neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON) colpisce generalmente uomini tra i venti e i trent anni fu descritta nel 1871 da Theodore Leber (oculista tedesco) colpisce prima un occhio con comparsa di uno scotoma centrale in poche settimane, poi l altro, dopo 1-2 mesi dopo alcune settimane di peggioramento nella fase acuta, la funzione visiva si stabilizza e soltanto in rari casi la vista può migliorare o riprendersi in buona parte in alcuni casi si ha un esordio più fulmineo descritte mutazioni mitocondriali associate alla LHON solo tre sono comuni: la G3460A-ND1, la T14484C-ND6 e la G11778A-ND4 del complesso I altre mutazioni, inizialmente associate alla patologia, sono in realtà dei polimorfismi popolazionistici tra i fattori ambientali predisponenti la malattia, o che possono determinare una certa variabilità clinica: forte consumo di tabacco e di alcolici

23 Trasmissione materna

24 Modelli di studio della genetica mitocondriale CIBRIDI di cellule di mammifero in coltura È interessante studiare le interazioni tra genoma mitocondriale e nucleare A questo scopo vengono prodotte e analizzate linee transmitocondriali, in cui il DNA mitocondriale proviene da un altra linea cellulare Giuseppe Attardi ottenne linee ρ0, ovvero prive di mtdna trattando con etidio bromuro (concentrazione nanomolare) cellule in coltura. Questo è un forte inibitore della DNA polimerasi mitocondriale (γ), e porta pertanto nel tempo a completa deplezione di mtdna Non tutti i tipi cellulari rispondono allo stesso modo con trattamento con etidio bromuro, alcune DNA polimerasi γ sono meno sensibili a questo inibitore cellule ρ0 hanno nuove esigenze nutrizionali richiedono un maggiore apporto di glucosio, di piruvato per riossidare il NADH ridotto durante la glicolisi, e pirimidine specialmente Uracile (nucleotide Uridina monofosfato UMP) neosintetizzate nel mitocondrio.

25 Citoplasto Piastrine Sinaptosomi (terminali presinaptici isolati da tessuto omogeneizzato) Enucleazione fisica o chimica (es. actinomicina D, un antibiotico prodotto dallo Streptomyces, si lega alla doppia elica del DNA)

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