Introduzione alla diagnostica biologica o competenze del biologo nell ambito della biologia clinica

Transcript

1 Introduzione alla diagnostica biologica o competenze del biologo nell ambito della biologia clinica Maria R. Capobianchi Laboratorio di Virologia Istituto Nazionale per le Malattie Infettive L. Spallanzani Roma Roma, 12 giugno 2013

2 Historical background 1936: Opening of Infectious Disease Hospital Lazzaro Spallanzani Early 90 s: Construction of the new hospital, pushed by the emergent AIDS epidemic. 1996: Designation as Research Institute 1999: Designation as National Institute for Infectious Diseases (INMI). At present, INMI covers an area of >130,000 m 2 with 15 buildings One building hosts the clinical facility

3 Historical background 1936: Opening of Infectious Disease Hospital Lazzaro Spallanzani Early 90 s: Construction of the new hospital, pushed by the emergent AIDS epidemic. 1996: Designation as Research Institute 1999: Designation as National Institute for Infectious Diseases (INMI). At present, INMI covers an area of >130,000 m 2 with 15 buildings occupying a total of 33,000 m 2. One building hosts the clinical facility Two building are dedicated to diagnostic and research laboratories

4 Historical background 1936: Opening of Infectious Disease Hospital Lazzaro Spallanzani Early 90 s: Construction of the new hospital, pushed by the emergent AIDS epidemic. 1996: Designation as Research Institute 1999: Designation as National Institute for Infectious Diseases (INMI). At present, INMI covers an area of >130,000 m 2 with 15 buildings occupying a total of 33,000 m 2. One building hosts the clinical facility Two building are dedicated to diagnostic and research laboratories A new building, almost completed, includes 10 high isolation units and new BSL-4 and -3

5 MISSION Health care: state of the art clinical care for patients with infectious diseases (HIV, viral hepatitis, severe, emerging/re-emerging infections, immunocompromised host); Surge capacity: global response to emerging/re-emerging diseases, including highly contagious, naturally occurring and deliberately caused (BT) infections Translational research: integration between clinical, epidemiological and pre-clinical research with the aim of enhancing the diagnosis, care and prevention of infectious diseases.

6 Organization Department of Epidemiology and Basic Research Department of Clinical Research Infect Dis- Liver Diseases Infect Dis- Severe Infections Infect Dis- HIV/AIDS Infect Dis- Tropical Diseases Infect Dis- Respiratory infections Long term care/rehabilitation Department of Diagnostic Research Services Virology (high containment laboratories) Microbiology Clinical Pathology Biorepository and Tissue Banking Imaging Morbid Anatomy Hospital Pharmacy AIDS referral center Clinical epidemiology and trials Occupational infections Observational studies and diseases registry Cellular biology & electron microscopy Gene expression & experimental hepathology Cellular Immunology Molecular microbiology Monitoring of antiretroviral drugs resistance Department of SOT (liver, kidney, pancreas) Surgery Intensive Care Transplant Hepatology

7 Emergency response INMI is a front line institution involved in the development of an integrated response to both natural and deliberate infectious events. It has both clinical and laboratory facilities that can be promptly mobilised for emergency response National Reference Centre for BW treat, Smallpox, SARS, VHFs, Avian/pandemic flu, Chikungunya...

8 INMI clinical center

9 INMI clinical center Clinical wards for isolation of patients with airborne and highly contagious infections. Inpatient care capacity: about 200 beds (until 340)

10

11 UOC VIROLOGIA Mission Sede Responsabile Équipe Strumentazione Attività ed indicatori di efficacia Attività istituzionale Attività libero-professionale(intramoenia) Informazioni Attività didattica e di ricerca

12 Eccellenza diagnostica UOC VIROLOGIA Mission Ottimizzazione delle risorse e incremento della offerta di prestazioni diagnostiche Integrazione con le altre UO dell INMI Elaborazione e adozione di percorsi diagnostici integrati Supporto diagnostico a livello nazionale, H24, per le infezioni virali emergenti Supporto diagnostico a livello regionale, H24, per lo screening infettivologico dei donatori di organo/tessuti Attività di ricerca Supporto virologico alle sperimentazioni cliniche dell INMI Sperimentazione di metodi diagnostici innovativi Formazione del personale

13 UOC di VIROLOGIA Sede SEDE: Padiglione Baglivi; parte del parco strumentale dedicato alle attività di ricerca è collocato presso il Padiglione Del Vecchio ORARIO DI APERTURA: H24 CONTATTI Telefono: /674 Fax:

14 UOC VIROLOGIA Diagnosi Avanzata Routinaria Di base Applicata Ricerca L attività di ricerca fornisce spunti e conoscenze per l innovazione diagnostica Il trasferimento di conoscenze è un processo continuo

15 UOC di VIROLOGIA Responsabile Direttore: dott. Maria Rosaria Capobianchi Telefono: Fax:

16

17 UOC di VIROLOGIA Équipe Il direttore della UOC 10 dirigenti biologi 1 capotecnico 17 tecnici di Laboratorio 1 infermiera professionale 4 ausiliari 7 ricercatori biologi e 1 tecnico con contratto di collaborazione scientifica

18 UOC VIROLOGIA Strumentazione (1) Il Laboratorio possiede una dotazione strumentale di altissimo Il Laboratorio possiede una dotazione strumentale di altissimo livello tecnologico. La maggior parte dei sistemi diagnostici sono interfacciati con il sistema gestionale WLab: il risultato del test eseguito dallo strumento direttamente su provetta madre viene inviato, previo controllo dell operatore, al sistema gestionale per la validazione e la refertazione da parte del dirigente. In particolare, per gli esami sierologici: la maggior parte degli esami viene eseguita su sistemi diagnostici ad alta processività, completamente automatizzati (chemiluminescenza); i test meno frequenti ed i test di seconda battuta o conferma si eseguono su analizzatori a minor processività, parzialmente automatizzati(elisa, ELFA, Blot)

19 UOC VIROLOGIA Strumentazione (2) Per gli esami molecolari: i test più frequenti (carica virale HIV, HCV e HBV) vengono eseguiti in Real Time PCR su sistemi diagnostici completamente automatizzati, ad alta processività le altre determinazioni molecolari ed il sequenziamento vengono eseguiti su analizzatori automatizzati, a minor processività la più recente introduzione nel parco tecnologico è un sistema di sequenziamento ad alta processività di ultima generazione; il sistema è utilizzato al momento in ambito di ricerca, principalmente nel campo della caratterizzazione molecolare dei virus

20 UOC VIROLOGIA Attività e indicatori di efficacia Report trimestrali dell andamento quali-quantitativo dell attività diagnostica Riduzione dei tempi di refertazione Pubblicazioni Certificazione del Sistema di Gestione della Qualità (SGQ dal 2003) secondo la norma UNI EN ISO 9001:2008, per le attività diagnostiche e per la gestione dei laboratori di biosicurezza e relativa attività di formazione Report programmi di controlli di qualità esterni(veq)

21 UOC VIROLOGIA Attività istituzionale (1) Il Laboratorio di Virologia è sede di numerosi centri di riferimento, fra cui: Centro di riferimento regionale per la diagnostica molecolare avanzata Polo nazionale di riferimento per la gestione di emergenze infettivologiche, sia dovute a comparsa di una nuova malattia altamente contagiosa che ad azioni di bioterrorismo Centro di riferimento nazionale per la SARS Centro di riferimento regionale per la pandemia influenzale Centro di riferimento nazionale per l infezione da virus Chikungunya Centro di riferimento regionale per le infezioni nei trapianti Centro di riferimento nazionale per lo screening dell infezione da Virus West Nile nei donatori di organo

22 UOC VIROLOGIA Attività istituzionale (2) Il laboratorio svolge attività diagnostica routinaria e avanzata per: utenti interni (UO degenza ordinaria, DH e Day Service), a prenotazione diretta degli esami tramite il collegamento in rete con il programma gestionale utenti ambulatoriali, ad accesso diretto dell utente, con impegnativa SSN del medico (di base o specialista), al CUP del Poliambulatorio che esegue i prelievi e prenota gli esami tramite il programma gestionale altri Enti e Istituzioni, sia della Regione Lazio che di altre Regioni italiane, con richiesta degli esami sul modulo aziendale (Allegato A2) e consegna dei campioni, tramite corrieri autorizzati, presso l Accettazione del Laboratorio

23 UOC VIROLOGIA Attività istituzionale (3) Inoltre, il Laboratorio svolge attività H24 in urgenza per: il Coordinamento Regionale Trapianti Lazio (CRT), per il quale esegue in maniera centralizzata gli esami per l accertamento della sicurezza infettivologica delle donazioni di organo/tessuti. La centralizzazione ha consentito l unificazione del flusso informativo relativo ai test eseguiti in urgenza, ed ha rappresentato una svolta importante nella gestione delle fasi preliminari all attività trapiantologica della Regione il Centro Nazionale Trapianti (CNT), per il quale esegue attività di consulenza virologica, ed offre la disponibilità ad eseguire esami non facilmente reperibili nei laboratori che assistono i centri trapianto (es. ricerca di West Nile Virus(WNV) RNA e relativi anticorpi) utenti interni (UO degenza INMI) ed altri Ospedali, per i quali esegue accertamenti microbiologici urgenti (liquor, malaria, antigeni batterici urinari)

24 UOC VIROLOGIA Informazioni Tutte le informazioni utili per gli utenti, contenute nei documenti del SGQ, sono scaricabili sul sito alla pagina Virologia : GPU(Guida Pratica Utenti) con gli Allegati tra cui l Elenco degli esami virologici Procedura per l'accettazione dei campioni diagnostici provenienti da utenti esterni(deliberazione aziendale) Tali documenti forniscono accurate indicazioni riguardo a: esami effettuabili presso il laboratorio, con la corrispondente tipologia di campione e di provetta/contenitore modalità di richiesta degli esami istruzioni per la raccolta e modalità di trasporto dei campioni metodidianalisieunitàdimisura tempi di risposta e modalità di consegna dei referti

25 UOC VIROLOGIA Attività diagnostica Il laboratorio garantisce l identificazione e la caratterizzazione di agenti virali utilizzando metodi colturali, sierologici e molecolari. L attività si articola in quattro grandi aree: Sierologia Caratterizzazione molecolare Ricerca e identificazione di agenti virali Laboratori di biosicurezza

26 UOC VIROLOGIA Sierologia (1) Sierologia I test sierologici vengono utilizzati per la diagnosi di malattie virali attraverso la ricerca di parti di virus (antigeni virali) o di anticorpi verso i vari componenti proteici dei virus stessi. La diagnosi viene in genere effettuata con i metodi ELISA, chemiluminescenza, ELFA, IF, FC, etc. Gli anticorpi rilevabili possono essere totali oppure distinti nelle frazioni delle Immunoglobuline: IgG o IgM. Sono disponibili anche test accessori o di conferma, basati su metodi in Western Blot o Immuno Blot.

27 UOC di VIROLOGIA Sierologia (2) Menu disponibile Menu disponibile Test di screening di IV generazione(hiv Ab/AgCombo); HIV p24 Testdiscreeningpervirusepatitici(HAV,HBV,HCV,HDV,HEV) IgG ed IgM per infezioni in ambito prenatale-connatale (CMV e Rosolia); test di avidità IgG ed IgM per Morbillo, Parotite, Parvovirus B19 Pannello sierologico per virus erpetici (EBV, VZV, HSV-1 e 2, HHV-6, HHV-8) Pannelli di anticorpi fissanti il complemento (FC) per Virus cardiotropi, enterotropi, neurotropi, pneumotropi Test di conferma o test accessori basati su WB o IB per HIV, HCV, CMV edebv IgG e IgM per virus emergenti/riemergenti (Chikungunya, Dengue, Hantavirus, West Nile, e altri), basati su IF, ELISA e neutralizzazione

28 UOC di VIROLOGIA Caratterizzazione molecolare (1) Caratterizzazione molecolare L area riguarda la ricerca e la quantificazione di acidi nucleici virali (RNA o DNA) in cellule, liq. biologici, biopsie, prelievi autoptici, etc. La determinazione quantitativa dei genomi virali con metodi altamente sensibili e standardizzati serve per il monitoraggio del livello della carica virale in relazione all utilizzo di protocolli terapeutici per alcune malattie quali l AIDS o le Epatiti, o al monitoraggio delle infezioni post-trapianto, ed è utile nella valutazione della necessità di iniziare, modificare o interrompere una terapia Sono disponibili anche metodi quantitativi e qualitativi elaborati in house, sulla base dei dati di letteratura o di esperienza originale, basati su PCR(DNA)eRT-PCR(RNA)informatoclassicoerealtime. La tipizzazione virale viene eseguita in genere mediante sequenziamento di prodotti di PCR, e viene impiegata per l identificazione e caratterizzazione di varianti, l identificazione di genotipi, la ricerca di mutazioni associate a resistenza, etc.

29 UOC di VIROLOGIA Caratterizzazione molecolare (2) Menu disponibile Il pannello offerto per la diagnosi virologica molecolare comprende la quasi totalità dei virus di importanza medica nell uomo. Si riportano alcune applicazioni salienti: Determinazione quantitativa HIV-1, HIV-2, HCV, HBV CMV, EBV e BKV (Monitoraggio Virologico dei trapianti) HSV-1 e 2, VZV, HHV-6, HHV-8, JCV, Parvovirus B19 Determinazione qualitativa HDV, HEV, GBV-C, TTV, ADV, Enterovirus, V. influenzali, Morbillo, Parotite, Rosolia, Astrovirus, Norovirus, Rotavirus, HTLV I/II, JEV, TBE, WNV, YFV, Alkhurma e altri virus rari Tipizzazione virale Sequenziamento e farmacoresistenza HIV, HCV, HBV, Genot. HCV, Tipizz. ADV, Influenza A, HPV, Dengue etc.

30 UOC di VIROLOGIA Caratterizzazione molecolare (3) Pannelli molecolari Pannelli molecolari In considerazione del fatto che spesso le malattie virali si presentano con sintomi simili che non possono essere collegati ad uno specifico agente, e allo scopo di favorire l appropriatezza della richiesta, il laboratorio ha predisposto pannelli di esami molecolari raggruppati per presentazione clinica e tropismo. Virus Cardiotropi: (Enterovirus, Parvovirus B19, ADV, CMV, EBV, HHV- 6) Virus Enterotropi:(ADV, Enterovirus, Astrovirus Norovirus, Rotavirus) Virus Neurotropi: (JCV, CMV, EBV, HSV1/2, VZV, Enterovirus, Morbillo, Parotite) Virus Respiratori: (Influenza A e B, ADV e Bocavirus,,Coronavirus e Parainfluenza , Rinovirus e Enterovirus, RSV e Metapneumovirus)

31 UOC di VIROLOGIA Ricerca e identificazione di agenti virali (1) Ricerca e identificazione di agenti virali L area riguarda principalmente i metodi colturali per l isolamento virale. Comprende anche la ricerca di anticorpi specifici mediante saggio di neutralizzazione. E un approccio di alta specializzazione che viene utilizzato soltanto in laboratori particolarmente attrezzati con personale esperto in virologia classica e dotati di strutture ad elevato livello di biocontenimento utilizza un pannello di colture cellulari di origine umana o animale che consente la moltiplicazione di un eventuale agente virale presente nel campione biologico risulta particolarmente utile quando si vuole ricercare un agente in un quadro per sindromi oppure quando, come ad esempio nella reinfezione o riattivazione da CMV, si vuole dare un significato diagnostico alla positività dei test di biologia molecolare.

32 UOC di VIROLOGIA Ricerca e identificazione di agenti virali (2) Menu disponibile Coltivazione e identificazione di virus su vari substrati cellulari (Fibroblasti diploidi, Vero, Hep2, MDCK, A549) Isolamento rapido del CMV mediante shell vials Titolazione di anticorpi neutralizzanti per controllo vaccinazione(poliovirus YFV e altri)

33 UOC di VIROLOGIA Laboratori di biosicurezza Laboratori di biosicurezza Sono nati in risposta all esigenza di creare un ambiente idoneo per quelle attività diagnostiche e di ricerca che richiedono particolare misure di protezione per gli operatori e per l ambiente; il loro utilizzo è progressivamente cresciuto, sull onda delle emergenze infettivologiche che hanno caratterizzato gli ultimi anni. Tali laboratori sono inseriti in un contesto normativo e scientifico di livello internazionale, e sono partner in alcuni network di cooperazione sopranazionale finalizzati al potenziamento delle capacità diagnostiche della rete dei laboratori europei. Nei laboratori di biosicurezza, a scopo diagnostico, viene eseguita l iniziale manipolazione e la inoculazione su colture cellulari di materiali biologici provenienti da pazienti sospetti di albergare Virus di livello 3 e 4 Gli isolati virali così ottenuti vengono caratterizzati con metodi biologici (all interno dei laboratori di biosicurezza) o, dopo averne inattivato l infettività, con metodi molecolari, in condizioni di biosicurezza standard

34 UOC di VIROLOGIA diagnostica avanzata Il laboratorio offre, pertanto, oltre ad esami di diagnostica virologica routinaria, anche esami di diagnostica avanzata: isolamento virale e caratterizzazione biologica e molecolare degli isolati esami che necessitano di condizioni di elevato biocontenimento (BSL3 e 4) esami basati sul sequenziamento genico, utilizzato per l identificazione e la caratterizzazione di varianti virali test genotipici e fenotipici virali per la ricerca di mutazioni associate a resistenza (HIV,HBVedHCV)eperladeterminazionedeltropismo(HIV) esami molecolari finalizzati alla gestione di eventi epidemici, comprendenti la caratterizzazione molecolare e l analisi filogenetica per l identificazione di cluster nosocomiali di infezioni virali test genotipici per la rilevazione di polimorfismi legati alla resistenza a terapie antivirali

35 UOC di VIROLOGIA Virus emergenti/riemergenti Riguardo ai virus emergenti/riemergenti e ai virus responsabili di malattie rare, l elenco degli esami Menu diagnostico disponibile presso l INMI per i principali virus emergenti con le relative istruzioni, è scaricabile dal sito Tali esami sono richiedibili previo contatto diretto con il Laboratorio.

36 UOC di VIROLOGIA Percorsi diagnostici L esperienza e la qualificazione acquisita nel corso degli anni, unica nel panorama nazionale, ha reso possibile lo sviluppo di percorsi diagnostici di eccellenza, tra i quali: Menu di laboratorio per la diagnosi ed il monitoraggio delle epatiti virali (inclusa la determinazione di genotipo e la valutazione di farmacoresistenza) Diagnostica virologica nel monitoraggio dei trapianti Menu di laboratorio per la diagnosi ed il monitoraggio dell infezione da HIV (inclusa la determinazione di genotipo e la valutazione di tropismo e di farmacoresistenza) Diagnosi eziologica delle infezioni respiratorie ad eziologia virale Diagnosi di virus emergenti e riemergenti

37 UOC di VIROLOGIA Attività didattica e di ricerca (1) L attività di formazione impegna il laboratorio di Virologia sia nella organizzazione che nella partecipazione ad eventi formativi Molti degli eventi promossi hanno conseguito l'accreditamento ECM. In particolare, sono stati svolti numerosi eventi formativi relativi alle emergenze infettivologiche, condotti in collaborazione con l UOC Microbiologia e Banca Biologica, ed è sempre attivo il programma di formazione continua per gli operatori destinati alle attività nei laboratori di biosicurezza Il direttore ed i dirigenti del laboratorio svolgono regolarmente attività di docenza in corsi formativi e di aggiornamento per dirigenti, personale infermieristico e tecnico-sanitario dell Istituto, su tematiche di laboratorio correlate alla clinica. Sono, inoltre, relatori invitati in Corsi di formazione, Congressi Nazionali ed Internazionali nei settori di eccellenza dell Istituto Tutto il personale partecipa in ruolo di discente a corsi di aggiornamento formativo, organizzati dall Istituto ed a corsi di aggiornamento su strumenti evoluti e tecnologie innovative

38 UOC di VIROLOGIA Attività didattica e di ricerca (2) Il laboratorio coniuga, nell ambito delle malattie infettive, le attività di assistenza con la ricerca scientifica, svolta in collaborazione con altre UO INMI. Le aree di ricerca riguardano: HIV, epatiti, HPV, patogeni emergenti, patogenesi delle infezioni virali, meccanismi di difesa antivirale, innovazione diagnostica, biosicurezza. Oltre ai temi indicati, il laboratorio fornisce supporto alle sperimentazioni cliniche ed alle altre attività di ricerca condotte nell Istituto, fornendo tutta la gamma necessaria di attività diagnostica virologica routinaria ed avanzata.

39 UOC di VIROLOGIA Attività didattica e di ricerca (3) Si elencano più in dettaglio alcuni temi di ricerca: Fattori virali coinvolti nella patogenesi e nella risposta alle terapie dell infezione da HIV, HCV ed HBV Fattori dell ospite che condizionano l andamento naturale e la risposta alle terapie nell infezione da HIV, HCV ed HBV Caratterizzazione molecolare e filogenetica di virus coinvolti in episodi di trasmissione nosocomiale Allestimento e validazione di metodi diagnostici innovativi per le infezioni virali, con particolare riferimento ai metodi molecolari Studi dei reservoir virali nelle infezioni croniche Infezioni nell ospite immunocompromesso, inclusi i soggetti trapiantati o esposti a terapie immunosoppressive Caratterizzazione molecolare e biologica di patogeni nuovi ed emergenti Sviluppo di percorsi integrati per la biosicurezza

40 INMI Biorepository

41 INMI Biorepository Research Projects Clinical Trials: discovery, validation, and/or product registration Registries: large cohort studies that will be of significant value in the future. Valuable clinical sample (to be used, i.e, for diagnostic assay validation) Transplant (donor/receiver) Organ biopsies (liver, heart) Forensic investigation Collection of cells, virus strains