Gli esami di laboratorio per la diagnosi dell abuso alcolico

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1 Problematiche correlate all uso di alcol e droghe Milano, 23 settembre 2015 Gli esami di laboratorio per la diagnosi dell abuso alcolico A. Salomone

2 World Health Organization (WHO) memorandum harmful drinking (alcohol abuse): modalità di uso dell alcol che ha già determinato effetti avversi fisici o mentali hazardous drinking (at-risk): livello di consumo alcolico (regolare o anche occasionale) che risulterà con altissima probabilità nocivo per il consumatore. Il consumo di alcol a rischio non ha ancora prodotto effetti che possano comportare una chiara diagnosi di abuso alcolico o di alcol dipendenza, ma le modalità del bere eccedono gli orientamenti medici e pongono il consumatore a rischio di danno. harmful e hazardous alcohol consumption devono essere i bersagli primari dell intervento precoce e della prevenzione secondaria di un programma sanitario

3 Di quali soggetti stiamo parlando? - Lavoratori a basso rischio (per sé e per terzi) - Lavoratori ad alto rischio (autisti, piloti, agenti di sicurezza) - Soggetti a cui è stata ritirata la patente di guida - Pazienti in cura presso i SerT

4 SCREENING: Visita medica Anamnesi Questionario Diagnosi di abuso alcolico Analisi di biomarcatori DIRETTI: EtOH EtG EtS PEth FAEE Sangue Urine Capello INDIRETTI: AST ALT γ-gt MCV CDT ALP Colesterolo Trigliceridi Siero (sangue)

5 Biomarcatori indiretti AST, ALT, γ-gt, MCV, CDT forte variabilità intere intra-individuale età sesso BMI etnia Danno epatico a seguito del consumo di alcol patologie epatiche, uso / abuso di farmaci e droghe illecite Indagine retrospettiva a breve-medio termine Determinazione semplice, veloce economica, automatizzata colorimetric assays optical measurement HPLC-UV, immunoassays Protocolli standard condivisi: NO ; valori di cut-off: NO Sensibilità e specificità diverse, ma individualmente sono considerati poco sensibili e poco specifici

6 Transferrina Carboidrato Carente (Carbohydrate-Deficient Transferrin), CDT Sulla base di un ampio consenso scientifico si definisce CDT un insieme di glicoforme della transferrina di cui le componenti rappresentative sono: asialo-tf, monosialo-tf, e disialo-tf. Nei soggetti che non abusano di alcol si ritrovano frazioni di disialo e asialotransferrina minori del 2 % del totale, mentre questo valore aumenta significativamente nei soggetti abusatori. In particolare la glicoforma disialotransferrina è considerata di riferimento quale marcatore di abuso alcolico. L asialotransferrina in teoria sarebbe più specifica ma compare solo quando la disialotransferrina è elevata

7 La CDT nel consumo alcolico L elevato consumo alcolico (etanolo e acetaldeide) inibisce la glicosilazione epatica della transferrina e, di conseguenza, aumentano in percentuale le isoforme meno glicosilate (disialo, monosialo e asialo)

8 Transferrina Carboidrato Carente (Carbohydrate-Deficient Transferrin), CDT Determinazione analitica il siero e la matrice d elezione per il dosaggio della CDT. Subito dopo il prelievo e possibile conservare il siero a 4-6 C per una settimana o a -20 C per tempi superiori. Campioni lipemici e/o emolizzati possono creare problemi di interpretazione del risultato. Congelamento e scongelamento anche se ripetuti non alterano la concentrazione della CDT. Le metodiche attualmente in uso sono di tipo immunologico e di tipo separativo.

9 Transferrina Carboidrato Carente (Carbohydrate-Deficient Transferrin), CDT - Metodiche immunologiche: utilizzano la formazione del legame tra la CDT e un anticorpo specifico antitransferrina. - Metodiche separative: HPLC come tecnica d elezione ed elettroforesi capillare zonale (CZE). Queste tecniche hanno il vantaggio di separare ed evidenziare le singole glicoforme della transferrina consentendo l identificazione di varianti o di possibili patologie

10 Biomarcatori diretti Ethyl glucuronide metabolita diretto dell etanolo per coniugazione con l acido glucuronico FAEEs metaboliti diretti dell etanolo per reazione con acidi grassi liberi Correlazione diretta con la quantità di alcol assunta sangue urina matrice cheratinica Determinazione in matrice cheratinica per indagini retrospettive a lungo termine TEMPO 1 cm/mese

11 Biomarcatori diretti EtilGlucuronato, EtG metabolita non ossidativo che si forma per coniugazione con l acido glucuronico: acido etil β-d-6-glucuronico (meno dello 0.1%, range % dell etanolo assunto viene trasformato in EtG) idrosolubile, non volatile e stabile presente in tutti i fluidi corporei e nei tessuti cheratinizzati lunga emivita (2 3 ore) attualmente isolato e dosato in cromatografia (LC-MS) specifico sensibile efficiente

12 ALCOL ETILICO EtilGlucuronato nelle urine L EtG, metabolita diretto dell etanolo, marker specifico di consumo alcolico, può essere determinato nelle urine fino a circa 80 ore dalla cessazione dell assunzione di alcol. In un gruppo di 106 pazienti sono state analizzate 286 urine, ottenendo concentrazioni di EtG comprese nell intervallo mg/l, valore medio mg/l, con un tempo di rivelabilità dall astensione del consumo di h, valore medio h (Friedrich Martin Wurst et al., Alcohol & Alcoholism Vol. 34, No. 1, pp , 1999).

13 ALCOL ETILICO EtilGlucuronato nel sangue la concentrazione massima di EtG nel siero (variabilità interindividuali significative) si raggiunge in ore dall assunzione di etanolo la concentrazione massima di EtG nel siero si raggiunge più tardi di ore rispetto alla C max dell etanolo calcoli teorici indicano che la concentrazione di EtG nel siero rimane determinabile fino a 17 ore dall assunzione la ricerca di EtG nel sangue può essere risolutiva quando è necessario distinguere l ingestione ante-mortem di etanolo dalla formazione post-mortale dell alcol (presenza di etanolo nel sangue e assenza nell umor vitreo per fenomeni putrefattivi) Gudrun Høiseth et Al. Forensic Science International 2007 Oct 25; 172(2-3):

14 ALCOL ETILICO EtilGlucuronato nei capelli La determinazione dell EtG nei capelli consente di discriminare i consumatori occasionali da quelli abitudinari. Un risultato positivo indica un elevato consumo di alcol. Proposta di valori di cut-off: concentrazioni di EtG (pg/mg) < 8 astemi (Teetotalers) 8-25 consumatori occasionali (Social Drinkers, g/die di etanolo) > 25 consumatori cronici (Heavy Drinkers, > 60 g/die di etanolo). M. Yegles, F. Pragst. Cut-offs for the detection of alcohol abuse by measurement of fatty acid ethyl esters and ethyl glucuronide in hair. Workshop of the Society of Hair Testing (SOHT), Strasbourg, September 2005

15 Biomarcatori diretti

16 Una concentrazione superiore al cut-off di 0.5 ng/mg per la somma dei quattro esteri nei primi 3 cm di capello analizzato può indicare un consumo cronico di alcol

17 The cut-off for EtG in hair strongly suggesting chronic excessive alcohol consumption is proposed at 30 pg/mg scalp hair, measured in 0-3 cm (up 0-6 cm) proximal segment Protocolli standard e valori di cut-off condivisi The cut-off for the sum of the four fatty acid esters in hair to strongly support chronic excessive alcohol consumption is proposed at 0.5 ng/mg scalp hair, measured in 0-3 cm proximal segment. If the 0-6 cm proximal segment is used the proposed cut-off is 1.0 ng/mg scalp hair EtG should be the first choice in abstinence assessment. A concentration 7 pg/mg EtG in the 0-3 up to 0-6 cm proximal scalp hair segment is not in contradiction to the self-reported abstinence of a person during the corresponding time period before sampling

18 EtG over FAEE (extracts from Consensus of SoHT 2014) EtG appears not to be influenced by hairspray, gel, wax, oil, grease or ethanol-containing hair care products Regular use of ethanol-containing hair care products (e.g. hairspray or hair lotions) lead to false positive FAEEs Possibility of alternative sampling (chest hair) when head hair is not available (not enough data for FAEEs) EtG should be the first choice in abstinence assessment, while the analysis of FAEEs alone is not recommended

19 Chapter 4, Alcohol Biomarkers in Hair, Prof. F. Pragst

20 Research activity Assessment of alcohol abuse and abstinence Chemometric evaluation of nine alcohol biomarkers in a large population of clinicallyclassified subjects: pre-eminence of ethyl glucuronide concentration in hair for confirmatory classification Pirro V, Valente V, Oliveri P, De Bernardis A, Salomone A, Vincenti M. Analytical Bioanalytical Chemistry 2011, 401(7): A study of distribution of ethyl glucuronide in different keratin matrices Pirro V, Di Corcia D, Pellegrino S, Vincenti M, Sciutteri B, Salomone A. Forensic Science International 2011, 210(1-3): Multivariate strategies for screening evaluation of harmful drinking Pirro V, Oliveri P, Sciutteri B, Salvo R, Salomone A, Lanteri S, Vincenti M. Bioanalysis 2013, 5(6): How has screening of harmful drinking changed over the years? Vincenti M., Salomone A, Pirro V., Bioanalysis 2013, 5(24), Interpretation of group-level factors from a large population dataset in the determination of ethyl glucuronide in hair Salomone A, Pirro V., Lombardo T., Di Corcia D., Pellegrino V., Vincenti M. Drug Testing and Analysis 2014, DOI /dta Determination of basic ethyl glucuronide levels in hair for the assessment of alcohol abstinence Pirro V, Di Corcia D, Seganti F, Salomone A, Vincenti M. Forensic Science International /j.forsciint

21 Direct over indirect markers (extracts from our research activity) Hair EtG can be used as a unique biomarker for the confirmatory diagnosis of chronic alcohol abuse? Which of the indirect biomarkers can be utilized to screen for alcohol misuse?

22 1 studio CAD + ASL TO4 + ASL TO2 Studio sperimentale: soggetti - 9 biomarcatori Astinenti Bevitori occasionali Abusatori cronici Pirro et al. (2011) Analytical Bioanalytical Chemistry 401:

23 EtG vs. CDT Pirro et al. (2011) Anal. Bioanal. Chem. 401:

24 PCA: analisi esplorativa 175 soggetti 5-9 marcatori Non-drinkers Social drinkers Heavy drinkers Quando EtG: marcatore l EtG è rimosso, molto la separazione sensibile e specifico tra consumatori cronici CDT & e MCV: non-cronici marcatori specifici, diminuisce ma drasticamente non sensibili (CDT > MCV) γ-gt, AST & ALT: scarsa sensibilità e specificità (γ -GT > AST, ALT)

25 EtG CDT EtG nel capello vs. CDT come marcatore di conferma Sample index Log(EtG) Sample index Log(CDT) 30 pg/mg 2.0% non-harmful drinkers Harmful drinkers CURVE ROC EtG alta sensibilità (91%) e alta specificità (97%) CDT bassa sensibilità (51%) e alta specificità (90%) 2 studio: 423 soggetti

26 Accertamento dell astinenza dal consumo di alcolici mediante analisi dell EtG nel capello concentrazioni HEtG < LOD (unita di pg/mg) cut-off attuale proposto: 7 pg/mg g alcol/giorno EtG capello < 7 pg/mg 44 astemi e astinenti 93% dei campioni: HEtG < 1 pg/mg Media HEtG 0.8±0.4 pg/mg 0-3 cm Revision del cut-off

27 Chain-of-custody Sampling Report on-line Transportation Payment ( 70) Reception Analysis (ISO 17025)

28 cumulative % % poistive samples Zona di prelievo 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 Etil glucuronato (cut off 30 pg/mg) 11,4 9,9 2,6 Matrice cheratinica (25533campioni) head hair chest hair axillary hair Distribuzione dei risultati positivi 100% Capello: 20,973 Ascella: 1,946 Torace: % 60% 40% 20% 0% capello (20973 campioni) 1 2 torace (1946 campioni) > 200 pg/mg 100 pg/mg 50 pg/mg 30 pg/mg

29 VALUTAZIONE INTERINDIVIDUALE 11 su 32 falsi positivi analizzando peli pubici EtG peli pubici > capello > peli ascellari Sovrastima sottostima

30 % positivi Età e genere Uomini: 18,920 Donne: 1, anni: 4, anni: 5,878 >40 anni: 9,731 EtG (cut-off 30 pg/mg) head hair (20293 samples) years years over 40 years 6.6 % 12.3 %

31 Stagionalità Campioni capello: 4, % 12 % Inverno vs. Autunno Estate vs. Primavera Statisticamente non differenti Inverno e Autunno vs. Estate e Primavera 11 % 7 % Statisticamente differenti

32 Studio di possibili fattori di bias: fattori biologici e personali - Età - Indice di massa corporea - Sesso M/F - Trattamenti cosmetici forti - Età (intersezione con fattori sociologici) - Indice di massa corporea (non c è dipendenza) - Sesso M/F (non c è dipendenza) - Trattamenti cosmetici forti e/o ripetuti

33 Possibili fattori di bias: trattamenti cosmetici chimici e fisici No contaminazione esterna da prodotti contenenti alcol. Un solo caso di contaminazione descritto in letteratura da prodotti contenenti EtG (Sporkert et al. 2012) Prodotti decoloranti (forti ossidanti) possono degradare e dilavare la matrice cheratinica e ridurre la concentrazione riscontrata di EtG Non trattati Piastrati Decolorati Analisi SEM (microscopio elettronico a scansione)

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39 Cut-Off FAEEs Sensibilità Specificità 0.5 ng/mg 97% 76% 0.8 ng/mg 83% 88% 1.0 ng/mg 66% 91%

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48 CONCLUSIONI I marcatori indiretti possono essere utilmente impiegati in valutazioni di screening su popolazioni ampie di soggetti (es. lavoratori), considerando i dati dopo un opportuna sintesi (es. trattamento statistico) EtG nel capello rappresenta un insostituibile marcatore di abuso alcolico cronico, da utilizzare senza eccezione in tutti i casi sospetti (es. ritiro della patente di guida), nonché nelle mansioni di particolare rischio (es. disponibilità di armi, autisti di autobus, piloti, ecc.) Il campionamento di pelo toracico può sostituire quello del capello per la determinazione dell EtG, benchè l intervallo cronologico non sia ben definito La determinazione di EtG nel capello è raccomandato per la valutazione di astinenza da alcol. Un cut-off di 1-2 pg/mg è verosimilmente idoneo allo scopo

49 SCREENING : mondo del lavoro Commisurare gli strumenti accertativi ai rischi che la mansione comporta per i terzi (maestro vs. autista di scuolabus) in relazione al rapporto costi/benefici Accettare il conseguente rischio di non riuscire a riconoscere tutti i consumatori problematici di alcol e/o di sostanze stupefacenti

50 CONFERMA : (presunta colpa) - Allontanamento da mansione lavorativa - Sospensione della patente di guida - Concessione del porto d armi Utilizzare SEMPRE gli strumenti accertativi più efficaci a riconoscere inequivocabilmente il consumo di sostanze stupefacenti e/o il consumo problematico di alcol NON accettare il rischio di non riconoscere tutti i consumatori problematici di alcol

51 GRAZIE!

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