VITAMINE A / E PLASMATICHE IN UV FAST Codice Z18610

Transcript

1 VITAMINE A / E PLASMATICHE IN UV FAST Codice Z18610 INTRODUZIONE Le vitamine A ed E sono due vitamine solubili nei grassi necessarie alla vita del regno animale per una crescita e sviluppo adeguati. La vitamina A (retinolo) possiede molteplici funzioni in quanto è essenziale non solo per la visione, ma anche per il differenziamento dei tessuti epiteliali e mesenchimali, per la spermatogenesi, per il mantenimento e lo sviluppo della placenta. Recenti studi hanno dimostrato che il β-carotene e altri carotenoidi svolgono anche il ruolo di antiossidanti e ciò risulta importante al fine di ridurre il rischio di insorgenza di tumori originati da radicali liberi e da forti ossidanti. La vitamina E (tocoferolo) è essenziale per un normale sviluppo muscolare e possiede anch essa attività antiossidante, prevenendo cioè l autossidazione degli acidi grassi fortemente insaturi ed evitando così la loro polimerizzazione. L azione antiperossidante del tocoferolo è attribuibile alla sua azione di rottura delle reazioni a catena che portano alla formazione dei radicali liberi, protagonisti della perossidazione dei lipidi insaturi. Particolarmente reattivi sono i radicali dell ossigeno che con l acqua ossigenata portano alla formazione del radicale ossidante OH in grado di distruggere molte strutture cellulari. Dal momento che retinolo e tocoferolo sono instabili quando esposti alla luce ed alle temperature usate per trattare i cibi, per integrare gli alimenti si usano spesso le forme acetate di queste due vitamine, che sono più stabili. I sistemi enzimatici dell organismo possono facilmente convertire questi derivati nelle loro forme attive. Il dosaggio di queste vitamine nel plasma fino a qualche anno fa veniva effettuato mediante tecniche colorimetriche o fluorimetriche, separatamente o con metodi sequenziali e simultanei. Queste tecniche, tuttavia, presentavano alcune difficoltà quali il recupero variabile, la necessità di impiegare grandi volumi di campione (fino a 2ml), la sensibilità a varie sostanze interferenti sia di origine endogena (β-carotene e fitofluene) che esogena e sono ora praticamente abbandonate in seguito all introduzione di numerosi metodi cromatografici che consentono il dosaggio simultaneo o separato del retinolo e dell α-tocoferolo. Il metodo da noi utilizzato si basa su un proposed selected method modificato in modo da consentire l impiego di un campionatore automatico. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N 001 Vitamine A/E plasmatiche in UV - FAST Luglio

2 CARATTERISTICHE DEL KIT Principio del metodo : Il presente metodo consente di determinare le concentrazioni plasmatiche delle VITAMINE A ed E. Ad una aliquota di plasma ( 100 µl ) viene aggiunto un Reagente di Precipitazione e, dopo centrifugazione, il sovranatante viene trasferito in provetta e iniettato in HPLC. Recupero del Metodo : > 98% Sensibilità analitica (LLOD) : Minima concentrazione analizzabile (LLOQ) : Linearità : Vitamina A : 0,06 µg/ml Vitamina E : 0,08 µg/ml Vitamina A : 0,014 µg/ml Vitamina E : 0,4 µg/ml 0,4 100 µg/ml Accuratezza intra serie (errore relativo %) VITAMINA A : Ci Cs 1,2 µg/ml 6,7 µg/ml 4,9% 3,7% Accuratezza inter serie (errore relativo %) VITAMINA A : Ci Cs 1,2 µg/ml 6,7 µg/ml 6,0% 3,8% Riproducibilità intra serie (coefficiente di variazione %) VITAMINA A: C LLOQ Cm Cs 0,4 µg/ml 0,7 µg/ml 1,0 µg/ml 5,2% 2,6% 1,5% Riproducibilità inter serie (coefficiente di variazione %) VITAMINA A : C LLOQ Cm Cs 0,4 µg/ml 0,7 µg/ml 1,0 µg/ml 6,3% 5,6% 2,2% Accuratezza intra serie (errore relativo %) VITAMINA E : Ci Cs 4,6 µg/ml 42,2 µg/ml 4,3% 2,1% Accuratezza inter serie (errore relativo %) VITAMINA E : Ci Cs 4,6 µg/ml 42,2 µg/ml 4,6% 3,5% Riproducibilità intra serie (coefficiente di variazione %) VITAMINA E : C LLOQ Cm Cs 6,53 µg/ml 13,7 µg/ml 16,4 µg/ml 6,6% 2,2% 0,8% 2

3 Riproducibilità inter serie (coefficiente di variazione %) VITAMINA E : C LLOQ Cm Cs 6,53 µg/ml 13,7 µg/ml 16,4 µg/ml 6,7% 4,8% 2,1% Range di normalità : Vitamina A : 0,20 0,80 µg/ml Vitamina E : 3,00 12,00 µg/ml Contenuto della Confezione : Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili 3 anni a 2 8 C. Il Calibratore liofilo 36 mesi dalla data di preparazione a 2 8 C. Reagente A Soluzione deproteinizzante con Standard Interno, 2 x 10 ml Reagente B Calibratore Plasmatico liofilo, 1 x 1 ml Vedi Avvertenze Reagente M - Fase Mobile, 2 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Strumento HPLC isocratico con loop da 20 µl o 50 µl Detector spettrofotometrico UV/VIS λ = 298 nm Registratore di cromatogrammi Preparatore automatico del campione Autocampionatore Computer gestionale Modalità di prelievo ematico : Provetta con anticoagulante EDTA Fase pre-analitica : Se non si analizza subito, congelare il campione a -20 C. Stabile per circa 3 mesi 3

4 PROCEDURA PREANALITICA Diluire 100 µl di Sol. Deproteinizzante contenente lo Standard Interno con 100 µl di H 2 O. Iniettare 50 µl di questa soluzione e verificare che il picco dello standard interno abbia un tempo di ritenzione ( RT ) compreso fra 1,5 e 2,5 minuti (vedere Figura 1). PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Preparazione dei campioni Dispensare in provetta: Calibratore Campione Reagente B Calibratore Plasmatico 100 µl Campione 100 µl Reagente A Sol. Deproteinizzante 200 µl 200 µl Attenzione: si consiglia di deproteinizzare direttamente sul Vortex per almeno 30 secondi FASE 2 : Centrifugare a rpm per 5 minuti. FASE 3 : Trasferire 200 µl di sovranatante in una vial di vetro. N.B.: il campione così preparato è stabile 3 giorni a 2-8 C INIEZIONE : Iniettare 20 o 50 µl nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Release N 001 Vitamine A/E plasmatiche in UV - FAST Luglio

5 VITAMINE A / E PLASMATICHE Avvertenze REAGENTE B : CALIBRATORE PLASMATICO LIOFILO Lot. 004 VITAMINA A VITAMINA E Modalità d uso : i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema HPLC. Per la ricostituzione aggiungere 1 ml di acqua di grado HPLC. Devono essere mescolati per 15 minuti e quando tutto il materiale è dissolto sono pronti per l uso. Conservazione e stabilità : i Calibratori sono stabili 36 mesi dalla data di preparazione se conservati a - 20 C. Dopo la ricostituzione sono stabili 1 giorno a 2 8 C e 1 mese a 20 C. Conservarli al buio. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 1 x 1 ml Precauzioni : il plasma umano usato per la costruzione di questi Calibratori è esente da virus dell epatite B e HIV. In ogni caso va considerato come potenzialmente infettivo e trattato con cura. 0,8 µg/ml 16,72 µg/ml PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO λ GAIN TEMPO DI INTEGRAZIONE 298 nm 0,001 AUFS 10 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica POROSHELL 120 EC-C18 4,6 x 50 mm, 2.7 µm, è tassativo l uso del Prefiltri Javelin (1 x 10 pz.) cod. S CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova POROSHELL 120 EC-C18 4,6 x 50 mm, 2.7 µm. Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Acetonitrile o Metanolo (20 : 80 v/v) e successivamente 30 ml di una soluzione di H 2 O : Acetonitrile o Metanolo (80 : 20 v/v)al flusso di 1,0 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,0 ml/minuto e scaricare i primi 20 ml. Al termine, iniettare il Test chimico e verificare la congruità della separazione. NON è possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA Non è necessario effettuare il lavaggio della colonna alla fine di ogni seduta analitica. STOCCAGGIO DELLA COLONNA Stoccare la colonna pulita nella Fase Mobile. LAVAGGIO AGO DI INIEZIONE PARAMETRI HPLC L ago di iniezione va lavato con una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile o Etanolo (80 : 20 v/v). LOOPS 20 o 50 µl Flusso di lavoro consigliato 1,0 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 70 bar 5

6 ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z18016 Calibratore per Vitamine A/E plasmatiche 4 x 1 ml Z18017 Controllo per Vitamine A/E plasmatiche -Livello 1 5 x 1 ml Z18018 Controllo per Vitamine A/E plasmatiche -Livello 2 5 x 1 ml Z18019 Controllo per Vitamine A/E plasmatiche Livelli 1 e 2 2 x 5 x 1 ml Z Colonna analitica POROSHELL 120 EC-C18 (4,6 x 50 mm, 2.7 µm) 1 PZ S Prefiltri Javelin 1 x 10 PZ S29307U Vial di vetro a volume ridotto da 1,5 ml a 15 ul + tappini 1 x 100 PZ 6

7 VITAMINE A / E PLASMATICHE ( Cromatogrammi di riferimento ) Fig. 1 : Soluzione Standard interno Fig. 2 : Calibratore plasmatico R.T. 2.0 Standard Interno R.T. 1.2 Vitamina A 0,8 µg/ml R.T. 2.0 Standard Interno R.T. 4.7 Vitamina E 16,72 µg/ml 7

8 VITAMINE A / E PLASMATICHE ( Cromatogrammi di riferimento ) Fig. 3 : Controllo plasmatico livello 1 Fig. 4 : Controllo plasmatico livello 2 R.T. 1.2 Vitamina A 1,23 µg/ml R.T. 1.2 Vitamina A 6,7 µg/ml R.T. 2.0 Standard Interno R.T. 2.0 Standard Interno R.T. 4.7 Vitamina E 4,64 µg/ml R.T. 4.7 Vitamina E 42,2 µg/ml 8