Metodi multiresiduo utilizzati per il controllo ufficiale dei residui di prodotti fitosanitari negli alimenti

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1 GRUPPO DI LAVORO APAT - ARPA - APPA FITOFARMACI Metodi multiresiduo utilizzati per il controllo ufficiale dei residui di prodotti fitosanitari negli alimenti Marco Morelli - Arpa Emilia-Romagna Hanno collaborato: A. Carioli, A.Bovolenta, M.Pesci, F.Rossi Arpa Emilia-Romagna M. Lorenzin Appa Trento Roma, 21 dicembre 2007

2 Mancanza di un metodo di prova normato e/o ufficiale Le agenzie preposte al controllo dei residui di fitofarmaci nei prodotti ortofrutticoli,, da sempre avvertono l esigenza di un metodo analitico ufficiale.

3 Quale riferimento per i laboratori? Rapporti Istisan 97/23 - Istituto Superiore di di Sanità Gruppo di di lavoro per i i residui di di antiparassitari della Commissione permanente di di coordinamento interregionale per i i problemi relativi al al controllo ufficiale dei prodotti alimentari metodi multiresiduo per l analisi di di residui di di antiparassitari in in prodotti vegetali

4 Quali proposte di metodi? B1: estrazione con acetone, filtrazione, ripartizione in diclorometano, purificazione su cartuccia gel di silice B2: estrazione con acetone + metanolo (1+1,v+v), ne segue una filtrazione. Un aliquota della soluzione di estrazione viene diluita con acqua e purificata su C18. Gli analiti sono eluiti dalla SPE-C18 mediante miscela n-esano + etere etilico, 1+1, v+v B3: estrazione con etile acetato in presenza di Na 2 HPO 4 12H 2 O, filtrazione e purificazione mediante GPC. B4: Il campione è mescolato insieme a terra di diatomee. La miscela è trasferita in una colonna di vetro, eluizione con diclorometano e purificazione mediante GPC. B5: Il campione è estratto con acetone. La soluzione di estrazione è, poi, separata mediante filtrazione, anche con l ausilio di celite. La soluzione acetone/acqua è trasferita in una cartuccia riempita di terra di diatomee. Parte dell'acetone è rimosso con un flusso di azoto. I residui di antiparassitari sono recuperati eluendo la cartuccia con diclorometano. Fonte: Rapporto Istisan 97/23

5 Particolarità. Questo comporta che i i metodi di di prova tratti da da queste pubblicazioni non sempre sono accettati dagli Enti preposti alla valutazione di di conformità alla UNI EN come metodi ufficiali e/o normati Fonte: SINAL DG0007 rev. 5

6 Atteggiamento propositivo Il gruppo di lavoro AAAF,, a cui fanno riferimento la maggior parte delle agenzie, si è fatto promotore di uno studio con la collaborazione di molti laboratori del sistema agenziale che, da tempo, si occupano dell analisi dei residui dei fitofarmaci nei vegetali

7 Perché questa esigenza? Dotare il sistema delle Agenzie di un metodo di prova comune (armonizzazione( armonizzazione) per l analisi dei residui di PF nell ortofrutta Disporre di un metodo di prova conte- nente dati di precisione ed accuratezza Avere una strumentazione che permetta di allineare i LdR e di LdQ fra i laboratori preposti al controllo ufficiale Nota: Nota: LdR = limite di rilevabilità: minima concentrazione di analita rilevabile con ragionevole affidabilità da una certa procedura analitica LdR = limite di rilevabilità: minima concentrazione di analita rilevabile con ragionevole affidabilità da una certa procedura analitica LdQ = limite di quantificazione: minima concentrazione di analita che può essere analizzata con ragionevole affidabilità da una certa LdQ = limite di quantificazione: minima concentrazione di analita che può essere analizzata con ragionevole affidabilità da una certa procedura analitica procedura analitica Fonte: Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolo dell incertezza di misura I manuali ARPA Fonte: Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolo dell incertezza di misura I manuali ARPA

8 Il metodo deve essere validato UNI CEI ISO punto Validazione La validazione è la conferma attraverso l esame e l apporto di evidenza oggettiva che i requisiti particolari per l utilizzazione siano soddisfatti E un processo di verifica con il quale si controlla se il metodo soddisfa conveniente- mente i requisiti prefissati

9 Come procedere? Eseguire uno studio collaborativo fra i laboratori del sistema delle agenzie (es.: L 93/2001 linea 4b: residui di prodotti fitosanitari nelle acque) Obiettivo: disporre di un metodo di prova comune (ufficiale) per l analisi dei residui di PF nei prodotti ortofrutticoli Svantaggio: percorso lungo e oneroso Oppure?

10 Oppure come procedere? Valorizzare l attività svolta negl anni dai laboratori delle ARPA-APPA APPA e valutare se vi sono dati e condizioni per proporre e redigere uno o più metodi di prova per l analisi dei residui dei PF su matrici ortofrutticole

11 Quali Azioni intraprese? Recensione delle informazioni necessarie per dare evidenza oggettiva delle caratteristiche dei metodi di prova adottati dai laboratori Raccolta dei dati: delle validazioni effettuate dai laboratori per accreditare i loro metodi di prova dei proficiency test, nazionali e/o internazionali, a cui hanno partecipato negli anni le agenzie

12 Laboratori partecipanti collaborazione fattiva delle seguenti agenzie ARPA Val d Aosta ARPA Torino APPA Trento ARPAV Verona ARPA Ferrara ARPA Firenze ARPA Arezzo A TUTTI un un ARPA Perugia particolare ringraziamento, per il il contributo fornito, che ha ha permesso la la realizzazione del lavoro ARPAC Napoli DAP Palermo DAP Ragusa ARPA Macerata ARPA Bari

13 Dai laboratori delle ARPA: raccolta informazioni Quantità di campione Utilizzo di Terra diatomee Solvente/Mix estrazione Utilizzo sistemi di Automazione Purificazione campione Lab. Quant. (g) Si/No Tipo Tipo ml Si/No Si/No Tipo 1 25 No (1) No Si SPE 2 10 Si A CH 2 Cl 2 4 x 35 No Si GPC 3 10 Si D CH 2 Cl No No 4 10 Si G EtAc 25 Si Si GPC 5 10 Si CH 2 Cl Si silica gel 6 10 Si M CH 2 Cl No No 7 15 Si Z CH 2 Cl Si Si GPC 8 5 Si Z EtAc 40 Si Si GPC 9 50 No Acetone 200 SPE Si J CH 2 Cl No No Si EtAc 80 Si Si GPC Si A CH 2 Cl Si GPC Si Z CH 2 Cl No Si GPC (1): miscela acetone/metanolo 1:1 Lab. con numero di colore rosso: utilizzo di terre di diatomee Legenda A: Merck - Extrelut bustine D: Merck G: Bulk isolute sorbent J: Extrelut NT Refil Pak WWR International M: chemtek analitica Z: hidromatrix Varian Pag. 1 di 3

14 Dai laboratori delle ARPA: raccolta informazioni Quantificazione standard in solvente o in matrice Quantificazione Multilivello o singolo livello Quantificazione Utilizzo di standard di processo Lab. Solvente/matrice Tipo Numero Si/No 1 Solvente Multi livello 3 2 Solvente Multi livello 3 3 Solvente Multi livello 3 4 Solvente Singolo 1 5 Solvente Singolo 1 6 Solvente Singolo 1 7 Solvente Singolo 1 8 matrice Singolo 1 9 Solvente Multi livello 4 10 Solvente Multi livello > 6 11 Solvente Multi livello 6 12 Solvente Multi livello 4 13 Solvente Multi livello 4 No Si No Si No No No Si Si Si Si No No Lab. con numero di colore rosso: utilizzo di terre di diatomee Pag. 2 di 3

15 Dai laboratori delle ARPA: raccolta informazioni Codice Laboratorio Analisi strumentale: rivelatori utilizzati GC NPD GC FPD GC ECD GCMS 1 Si Si Si Si 2 Si Si Si 3 Si No Si Si 4 Si No Si No 5 Si Si Si 6 Si Si Si 7 Si Si Si Si 8 Si Si Si Si 9 Si Si Si 10 Si No Si Si 11 Si No Si Si 12 Si No Si Si 13 Si No Si Si Lab. con numero di colore rosso: utilizzo di terre di diatomee Pag. 3 di 3

16 Cosa è emerso dall indagine? B2: estrazione con acetone + metanolo (1+1,v+v), ne segue una filtrazione. Un aliquota della soluzione di estrazione viene diluita con acqua e purificata su C18. Gli analiti sono eluiti dalla SPE-C18 mediante miscela n-esano + etere etilico, 1+1, v+v B4: B4: Il campione è mescolato insieme a terra di diatomee. La miscela è trasferita in una colonna di vetro, eluizione con diclorometano e purificazione mediante GPC. Fonte: Rapporto Istisan 97/23

17 Punto B.2 Rapporto ISTISAN 97/23 Estrazione con acetone+metanolo (1+1, v/v), purificazione su C18 Triturazione/omogeneizzazione del campione. 50 g di campione sono omogeneizzati con 100 ml di una miscela acetone+metanolo (1+1, v/v) Analisi strumentale: GC con rivelatori selettivi, e/o GC- MS Estrazione con cartucce SPE. Gli analiti sono eluiti dalla SPE-C18 (C8) mediante miscela n-esano n + etere etilico, 1+1, v+v,, (n-esano). Separare la soluzione di estrazione mediante filtrazione. La soluzione viene trasferita nel matraccio da 250 ml e portata a volume con acqua. Travasare 50 ml di soluzione (pari a 10 g di campione) in beuta e addizionare 400 ml di acqua

18 Punto B.4 Rapporto ISTISAN 97/23 Estrazione per dispersione su terre di diatomee, purificazione mediante GPC Triturazione/omogeneizzazione del campione. Un aliquota di omogeneizzato vegetale (15 g) viene miscelata con terra di diatomee (20 g). Analisi strumentale: GC-MS(/MS) e/o LC- MS(/MS) Eventuale purificazione, mediante cromatografia a permeazione di geli (GPC). La miscela può essere estratta mediante sistemi di estrazione automatici (tipo ASE) Oppure mediante cromatografia su colonna. Eluizione con circa 150 ml di diclorometano ( ) Portare a piccolo volume con evaporatore rotante ed a secco con corrente di azoto Raccogliere l eluato ed i lavaggi in beuta da 200 ml

19 Laboratori e Proficiency test (PT) N Si/No anni Enti 1 Si 10 EUPT 2 3 Si 4 EUPT FAPAS ARPAV 4 Si 4 EUPT 5 6 Si 9 EUPT AAAF 7 Si 10 EUPT I.S.S. AAAF Is.Pa.Ve. 8 Si 7 EUPT I.S.S. C.O.O. AAAF 9 Si AAAF FAPAS 10 Si 8 EUPT I.S.S. 11 Si 6 EUPT I.S.S. C.O.O. 12 Si EUPT AAAF FAPAS 13 Si 1 EUPT Legenda I.S.S. = Istituto Superiore di Sanità EUPT = European Commission's PT AAAF = ARPA - gruppo di lavoro AAAF C.O.O. = Centro Operativo Ortofrutticolo - Coop Italia 10: laboratori hanno partecipato all European Commission s PT

20 PT: a cosa servono? documentare la riferibilità delle misure quando non siano disponibili campioni di prima linea o materiali certificati; validare i metodi di prova con riferimento alla ISO 5725; certificare materiali di riferimento Guide ISO valutare la competenza tecnica dei laboratori Proficiency tests o prove valutative riferimento Guida ISO 43 Fonte: Sito internet del Sinal (

21 Perché partecipare ai PT? Regolamento (CE) n. n. 396/ Art comma 3: 3: Tutti i i laboratori incaricati dell'analisi dei campioni, ai ai fini dei controlli ufficiali sui residui di di antiparassitari, partecipano alle prove interlaboratorio comunitarie per i i residui di di antiparassitari,, organizzate dalla Commissione Sanco/3131/2007 p.to 66: The laboratory must participate regularly in in relevant proficiency tests

22 L Unione Europea nelle linee guida SANCO/3131/2007: Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in in food and feed nel punto Analytical methods validation and performance criteria Method validation:

23 Matrici rappresentative Fonte:Guidelines for forsingle-laboratory Validation of of Analytical Methods for fortrace- levelconcentrations of of Organic Chemicals annex annex 1 level

24 Viene ribadito Deve essere effettuata con molta attenzione e cura la scelta: le le matrici: vengono individuate e selezionate sulla base of of their biological or or analytical similarity (es.: occorre valutare il il contenuto di di acqua, di di clorofilla, di di grassi, di di zuccheri e di di acidità) degli analiti: occorre valutare le le caratteristiche chimico-fisiche delle sostanze attive (polarità, degradabilità, basicità, ecc.)

25 Analiti rappresentativi Sanco/3131/2007 Il sistema di determinazione deve essere calibrated con gli analiti rappresentativi [1] per ogni serie di analisi (tab. 1) 42 gli analiti rappresentativi devono essere scelti con molta attenzione, per fornire la prova che la selezione realizzata è accettabile per tutti gli altri analiti. [1] Un analita usato per valutare la prestazione più probabili e utilizzando un altro analita nell'analisi. I dati accettabili per un analita rappresentativo sono dati presunti per mostrare che quella prestazione è soddisfacente. L'analita rappresentativo deve includere quelli per p cui ci si aspetta la prestazione peggiore.

26 Validazione del metodo Nel documento FAO/IAEA Guidelines for single laboratory validation of analytical methods for trace-level concentrations of organic chemicals annex 3 al al punto 3 validazione del metodo si si riporta: The laboratory selected. representative pesticides and representative commodities for validating the method FAO: Food and Agricolture Organization of of U.S.A. IAEA: International Atomic Energy Agency of of U.S.A.

27 Le matrici dei PT, in base alle loro caratteristiche, possono essere così raggruppate Gruppo Proprietà Matrice I II Alto contenuto di acqua e clorofilla Alto contenuto di acqua e basso o assente contenuto di clorofilla Lattuga, cetriolo, zucchino Mele, actinidia, uva, pomodoro, peperone III Alto contenuto di acidità arance Nei 3 gruppi di di matrici,, rientrano la la maggior parte dei prodotti ortofrutticoli analizzati e portati sulle tavole dei consumatori

28 Risultati dei PT P.A. Soddisfacenti Discutibili Non Soddisfacenti Analizzati n. % n. % n. % ,5 ll ,5 Aggiornamento dati al dicembre 2005

29 Come valorizzare le informazioni provenienti dai PT? Utilizzare le informazioni derivanti dai PT per sottolineare e ribadire la validità del criterio: delle matrici rappresentative dei parametri rappresentativi

30 Sono state considerate solo le matrici appartenenti ad un determinato gruppo (es.: I, II) Sono stati fatti confronti statistici solo fra p.a. comuni a più matrici del medesimo gruppo Verifica del criterio delle matrici rappresentative es.: la s.a. diazinone comune a più matrici (lattuga e cetriolo) Sono stati utilizzati solo le s.a. con z-score z soddisfacenti (-2( z 2) Il confronto è stato fatto con l applicazione di test statistici (Shapiro( Shapiro-Wilk, Dixon, Grubb,, ecc.) al 95% di probabilità

31 Gruppo II Rappresentatività delle matrici Parametri Matrice 1 Matrice 2 Matrice 3 Matrice 4 Azoxistrobina actinidia pomodoro Clortalonil actinidia pomodoro Diazinone peperone pomodoro mela Endosulfan peperone pomodoro Iprodione Metidation Procimidone peperone pomodoro Tiabendazolo Gruppo I actinidia pomodoro mela mela uva uva uva uva t Test/Anova Parametri Matrice 1 Matrice 2 Matrice 3 t Test Deltametrina cetriolo zucchino Metalaxil cetriolo zucchino Vinclozolin cetriolo zucchino = nessuna differenza significativa al 95% di probabilità Diazinone cetriolo lattuga

32 Conferma criterio matrici rappresentative da quanto è emerso dai risultati ottenuti, per le matrici esaminate (Gr. I, I, II), al 95% di probabilità, c è confrontabilità delle matrici e quindi da quanto si è potuto constatare il il criterio della rappresentatività delle matrici risulta confermato

33 Legenda: Pow: octanol/water partition coefficient Verifica del criterio dei parametri rappresentativi Nell Annex 3 Worked example of method validation, as applied to a method for pesticides residues sono riportati i i criteri per la la scelta delle s.a. rappresentative Il Il documento considera le le seguenti caratteristiche per valutare le le s.a.:.: solubilità in in acqua Log P ow ow tensione di di vapore idrolisi in in acqua come DT

34 Principio attivo Parametri ordinati per Solubilità in acqua (mg/l) solubilità in acqua Principio attivo Solubilità in acqua (mg/l) difenilammina 53 Solubilità in acqua (mg/l) mevinfos azinfos metile 28 kresoxim m 2 monocrotofos nuarimol 26 fludioxonil 1,8 metalaxil 8400 fosmet 25 clorpirifos 1,4 tolilfluanide 4000 dimetoato 23,8 diclofluanide 1,3 oxadixil 3400 fenexamide 20 tolclofos metile 1,1 pirimicarb 3000 quinalfos 17,8 clorotalonil 0,81 propoxur 1900 propizamide 15 bromopropilato 0,5 metidation 200 ciprodinil 13 endosulfan 0,32 imazalil 180 iprodione 13 metossicloro 0,1 tetraconazolo 156 paration 11 quintozene 0,1 malation 145 azoxistrobina 6 permetrina 0,006 miclobutanil 142 procimidone 4,5 lambda cialotrina 0,005 pirimetanil 121 tiabendazolo 3 cipermetrina 0,004 carbaril 120 clorpirifos metile 2,6 deltametrina 0,0002 diazinone 60 vinclozolin 2,6 Principio attivo Fonte: The Pesticide Manual 13 edizione editor CDS Tomlin BCPC 2003 Fonte: The Pesticide Manual 13 edizione editor CDS Tomlin BCPC 2003

35 Classi di solubilità in acqua dei p.a. I I p.a. sono stati suddivisi considerando la la loro solubilità in in acqua. Sono state costituite n. n. 5 classi di di p.a. in in base al al loro valore, in in mg/l, di di solubilità in in acqua alla temperatura di di 20 C. Classe Solubilità in acqua A x 1 N. p.a. B 1< x C 10 < x D 100 < x E x > La colonna N. p.a.. indica quante s.a. oggetto di PT rientrano nelle 5 classi di solubilità predisposte.

36 Esempio: s.a. appartenenti alla CLASSE B 1 < x 10 Sol. 1 < x 10 Sol. 1 < x 10 Sol. (mg/l) (mg/l) (mg/l) Anilazina 8 Diclofluanide 1,3 Mepanipirim 3,1 Azinfos etile 4,5 Dicloran 7 Pirazofos 4,2 Azoxistrobina 6 Etion 2 Pirimifos etile 2,3 Benfuracarb 8,1 Fenoxicarb 7,9 Pirimifos m 9 Bitertanolo 2 Fention 4,2 Procimidone 4,5 Cloroneb 8 Fentoato 10 Propizamide 15 Clorpirifos 1,4 Fludioxonil 1,8 Tiabendazolo 3 Clorpirifos m 2,6 Fosalone 3,05 Tebufenpirad 2,6 Clozolinate 2 Iodofenfos 2 Tolclofos m 1,1 Diclobutrazolo 9 Kresoxim m 2 Vinclozolin 2,6 Carattere grassetto per le s.a. dei proficiency test

37 Confronto fra parametri rappresentativi Sono stati fatti confronti fra più p.a.. appartenenti alla stessa classe di di solubilità e nella stessa matrice Sono state effettuate elaborazioni statistiche (Test di: Shapiro Wilk, Dixon, Grubb, Anova) confrontando i i risultati conseguiti nei PT dai laboratori, per valutare, al 95% di probabilità (*) (*), la confrontabilità dei parametri (*) (*) Qualora Qualora il confronto evidenziasse differenze statisticamente significative al 95% di probabilità, è stata il confronto evidenziasse differenze statisticamente significative al 95% di probabilità, è stata considerata considerata l applicazione del test di Anova al 99% di probabilità. l applicazione del test di Anova al 99% di probabilità.

38 Parametri rappresentativi: esempio di alcuni confronti Matrici gruppo II Matrici gruppo III (arancia) Matrici classi n. pa parametri p.a. classi n. pa parametri p.a. Pomodoro A 3 Bromopropilato Clortalonil endosulfan B 3 azoxistrobina clorpirifos clorpirifos m uva D 3 Carbaril, pirimetanil Tetraconazolo C 3 azinfos m diazinone paration Matrici gruppo I matrice cetriolo lattuga classi Legenda: nessuna differenza significativa al 95% A C n. pa 3 4 parametri Deltametrina Permetrina endosulfan Diazinone Fosmet Paration propizamide p.a.

39 Parametri rappresentativi: Considerazione sui confronti Fra i i p.a. appartenenti alla stessa classe di solubilità, nell ambito dei gruppi di matrici esaminati, viene confermato il il criterio dei parametri rappresentativi

40 Confronti (1) sul metodo B4 (1) (1) : : confronti fra fra i i risultati dei PT di di più p.a. appartenenti alla stessa classe di di solubilità e nella stessa matrice. Sono stati stati utilizzati test test statistici per per confrontare i i risultati i conseguiti nei nei PT PT dai dai laboratori, per per valutare, al al 95% 95% di di probabilità (*) (*),, l eventuale differenza qualora: siano portate all analisi diverse quantità, in in g, g, di di campione utilizzo di di diversa tipologia di di terra terra di di diatomee impiego o meno dell automazione nell estrazione influenza della purificazione sul sul risultato analitico confronto fra fra i i diversi tipi tipi di di solvente di di estrazione impiego di di un un diverso volume di di solvente di di estrazione la la quantificazione con con retta retta ((multilivello) ) o con con uno uno standard esterno l influenza dello standard di di processo nell analisi quantitativa confronto fra fra risultati conseguiti preparando lo lo standard in in matrice m o in in solvente (*) (*) Qualora Qualora il il confronto confronto avesse avesse evidenziato evidenziato differenze differenze statisticamente statisticamente significative significative al al 95% 95% di di probabilità, probabilità, i i test test venivano venivano ripetuti ripetuti al al 99% 99% di di probabilità. probabilità.

41 Riassunto confronti sul metodo Gruppo I (Matrici: cetriolo e lattuga) matrice classi n. pa parametri p.a. cetriolo lattuga A 3 C 4 Deltametrina Permetrina endosulfan Diazinone Fosmet Paration propizamide Q.tà Terra diatomee ASE Solv tipo (*) (*) matrice classi n. pa parametri Purific vol sol. Std Solv. Retta o singolo Std proc. cetriolo A 3 Deltametrina Permetrina endosulfan (*) lattuga C 4 Diazinone Fosmet Paration propizamide Legenda: nessuna differenza significativa al 95% (*) - nessuna differenza significativa al 99% (Alcuni esempi)

42 Riassunto confronti sul metodo Matrici classi n. pa pa Gruppo II (matrici: pomodoro e uva) p.a. Q.tà Terra diatomee ASE Purif. Pomodoro A 3 Bromopropilato Clortalonil endosulfan (*) uva D 3 Carbaril, pirimetanil Tetraconazolo Matrici classi n. pa pa Solv tipo vol solv. Std Solv. Retta o singolo Std proc. Pomodoro A 3 Bromopropilato Clortalonil endosulfan uva D 3 Carbaril, pirimetanil Tetraconazolo Legenda: nessuna differenza significativa al 95% (*) - nessuna differenza significativa al 99% (Alcuni esempi)

43 Riassunto confronti sul metodo classi n. pa parametri p.a. B 3 Gruppo III (matrice: Arancia) azoxistrobina clorpirifos clorpirifos m Q.tà Terra diatomee ASE Solv tipo C 3 azinfos m diazinone paration classi n. pa parametri Purific vol solv. Std Solv. Retta o singolo Std proc. B 3 azoxistrobina clorpirifos clorpirifos m (*) C 3 azinfos m diazinone paration Legenda: nessuna differenza significativa al 95% (*) - nessuna differenza significativa al 99% (Alcuni esempi)

44 Per quanto attiene i confronti a sostegno del metodo di prova B4 Si rileva al 95% di probabilità per le seguenti fasi del metodo: Fase preparativa/estrattiva quantità, in g, di campione portata all analisi impiego di diversa tipologia di terra di diatomee utilizzo o meno di sistemi automatici di estrazione * diversi tipi di solvente di estrazione * un diverso volume di solvente di estrazione nessuna influenza della purificazione sul risultato analitico * Quantificazione con retta (multilivello( multilivello) ) o con uno standard esterno Impiego o meno dello standard di processo utilizzo dello standard in matrice o in solvente * * pochi casi al 99% di probabilità

45 Considerazione Dai risultati dei PT e dai confronti fatti, al 95% di probabilità (*) (*), emerge che il il metodo di prova più utilizzato dai laboratori (B4),, analizzando p.a. in un ampio range di solubilità,, e per le matrici riconducibili ai gruppi I, I, II II e III è robusto (*) pochi casi al 99% di probabilità

46 Metodo B4: Matrici oggetto di validazione e livelli di concentrazione Cod. Lab. Gr II Gr II Gr I Gr I Gr III Gr II altri 1 2 m ela (0,03-0,2) zucchine (0,03-0,2) 3 pere (0,1) lattuga (0,1) limone (0,1) 4 mela (0,1) farina (0,2-0,4) 5 pere (0,1-0,3) pom odoro (0,1-0,4) 6 mela (0,2-3) 7 m ela (0,15) zucchine (0,13) 11 mela (0,1) farina (0,3) 12 mela lattuga(0,02) 13 mela (0,04-0,2) zucchine (0,04-0,2) limone (0,04-0,2) pomodoro (0,04-0,2) farina (0,04-0,2) Cod. Lab. 8m 9m 10 m 11m 12m Cachi (0,01) Uva (0,1-1) Vino(0,01-0,04) patate (0,1) fagiolo (0,04-0,2)

47 Dati di validazione dei metodi di prova dei laboratori Sono state considerate solo le s.a. comuni a più laboratori è stato verificato che lo scarto tipo di ripetibilità (S r ), in fase di validazione, rispettasse la condizione: ½ σ R S r ⅔ σ (*) R Disponendo di livelli di concentrazione differenti, i dati, per essere confrontati, sono stati normalizzati rispetto all incremento teorico (*): σ R scarto tipo valutato con la relazione di Horwitz.

48 parametro matrice cod.lab. n it M S r CV% σ H S r /σ H 2/3 R% ,05 0,048 0, ,2 0,01056 Ok 98 azoxistrobin mele ,1 0,076 0, ,1 0,01669 Ok ,25 0,228 0, ,1 0,04554 Ok ,45 0,412 0, ,9 0,07537 Ok ,05 0,041 0, ,4 0,00902 Ok ,09 0,074 0, ,2 0,01629 Ok 80 Clortalonil mele ,23 0,178 0, ,8 0,03688 Ok ,1 0,086 0, ,4 0,01883 Ok ,15 0,132 0, ,4 0,02857 Ok 88 mele 7 6 0,15 0,147 0, ,1 0,03132 Ok ,49 0,415 0, ,2 0,07576 Ok 84 diazinone pere 3 8 0,1 0,08 0, ,4 0,01768 Ok ,05 0,048 0, ,6 0,01056 Ok 98 mele ,025 0,019 0, ,00407 Ok ,1 0,082 0, ,01797 Ok 83 pere 3 5 0,39 0,43 0, ,2 0,07816 Ok 110 dimetoato mele 7 6 0,15 0,145 0, ,8 0,03103 Ok 97 pere 3 8 0,1 0,095 0, ,6 0,02085 Ok 95 Legenda: It: incremento teorico n: n: numero delle prove M: media dei risultati Sr= scarto tipo di di ripetibilità CV%: coefficiente di di variazione σ H: H: scarto tipo di di riproducibilità secondo la la Horwitz R%: recupero percentuale Gr.. II Risultati validazione parametro matrice cod.lab. n it M S r CV% σ H S r /σ H 2/3 R% 7 6 0,15 0,153 0, ,6 0,0324 Ok ,8 0,733 0, ,4 0,12295 Ok ,25 0,229 0, ,1 0,04578 Ok 92 metidation mele ,1 0,086 0, ,5 0,01894 Ok ,05 0,04 0, ,3 0,0088 Ok ,025 0,023 0, ,00506 Ok ,1 0,089 0, ,2 0,01958 Ok ,15 0,131 0, ,5 0,02839 Ok ,03 0,029 0, ,00645 Ok 105 procimidone mele 2 6 0,18 0,181 0, ,03746 Ok ,2 0,148 0, ,8 0,03163 Ok ,05 0,047 0, ,3 0,01034 Ok 88 mele 7 6 0,15 0,135 0, ,4 0,02923 Ok ,72 0,566 0, ,3 0,09862 Ok 79 endosulfan a pere 3 7 0,1 0,076 0, ,9 0,01672 Ok 76 mele ,025 0,019 0, ,2 0,00418 Ok 75 pomodoro ,025 0,018 0, ,7 0,00396 Ok 72 endosulfan b pere 3 8 0,1 0,093 0, ,02052 Ok 93 mele ,005 0,006 0, ,00132 Ok ,15 0,138 0, ,4 0,02975 Ok 92 endosulfan s mele 6 5 0,55 0,482 0, ,3 0,08609 Ok ,005 0,005 0, ,8 0,00113 Ok 98

49 Parametro Gruppo matrice Concentrazione Recupero min Max R% CV% n cod. Lab azinfos met III limone 0,05 0, arancia 0,21 0, EUPT4 0,05 0, II mele 0,25 0, azoxistrobina 0,45 0, III arancia 0,25 0, arancia 0,263 0, EUPT4 clorpirifos III arancia 0,05 0, limone 0,05 0, clorpirifos met III arancia 0,04 0, ,159 0, EUPT4 0,05 0, clortalonil II mele 0,1 0, ,15 0, zucchino 0,05 0, I lattuga 0,1 0, ,109 0, EUPT5 Cetriolo 0,143 0, EUPT3 0,15 0, diazinone mele 0,49 0, II pere 0,1 0, mele 0,025 0, III Limone 0,05 0, ,1 0, Legenda: min: concentrazione minima Max: concentrazione massima R%: recupero espresso in % CV%: coefficiente di variazione % n.: numero prove Gruppi I, II e III: Riassunto risultati con dati di precisione e recupero Parametro Gruppo matrice Concentrazione Recupero min Max R% CV% n cod. Lab dimetoato II pere 0,1 0, mele 0,15 0, ,15 0, mele 0,72 0, endosulfan a II pere 0,1 0, Mele, pomodoro 0,025 0, endosulfan b II pere 0,1 0, mele 0,005 0, ,15 0, endosulfan s II mele 0,55 0, ,005 0, endosulfan II pomodoro 0,344 0, EUPT6 0,15 0, metidation II mele 0,8 0, ,1 0, ,025 0, ,15 0, procimidone II mele 0,03 0, ,2 0, ,05 0, zucchino 0,02 0, vinclozolin I Lattuga 0,1 0, cetriolo 0,216 0, EUPT3

50 Considerazione Considerate le elaborazioni statistiche, di cui ai gruppi I, II e III precedenti,, si dispongono di informazioni (precisione( e accuratezza) ) per il metodo di prova B4 limitatamente alle s.a. ed ai gruppi di matrici: Gruppo I - alto contenuto di acqua e di clorofilla: diazinone, vinclozolin Gruppo II - alto contenuto di acqua e basso o assente contenuto di clorofilla: azoxistrobina, clortalonil, diazinone, dimetoato, endosulfan alfa, endosulfan beta, endosulfan solfato, metalaxil, metidation, procimidone, tiabendazolo Gruppo III - alto contenuto di acidità: azinfos m, azoxistrobina,, clorpirifos, clorpirifos m, diazinone

51 Proposta di metodo di prova Pesare: Da 5 a 15 g di campione omogenato con circa g di terra di diatomee Miscelare accuratamente il campione e la terra di diatomee (t.d.).) sino ad ottenere un materiale pulvirulento senza grumi Estrazione di tipo: Manuale: caricando su colonna la miscela campione + t.d. Automatica: caricando nelle celle dell apparecchiatura la miscela campione + t.d Mescolare il il campione con Terra di diatomee Estrazione con apparecchiatura automatica Estrazione su colonna

52 Eluizione con un volume di: V1 ml se etile acetato (con V1 compreso fra 25 e 80 ml) V2 ml se diclorometano (con V2 compreso fra 100 e 150 ml) Raccogliere l eluato evaporare il solvente Eventuale purificazione del campione (in G.P.C.).) Analisi strumentale stessi rivelatori impiegati dai laboratori per le medesime matrici ed i medesimi p.a. nei proficiency test e nella fase di validazione Raccogliere l eluato ed i lavaggi in beuta da 200 ml 3 ml di campione ripresi con etile acetato e cicloesano, purificati in GPC, e ripresi 0.5 ml di miscela n-esano acetone, 1:1 Portare a piccolo volume con evaporatore rotante ed a secco con corrente di azoto Analisi strumentale: GC e/o GC-MS

53 Proposta del gruppo di lavoro AAAF Il Il metodo di prova viene proposto al Ministero della Salute quale metodo di prova per il il controllo dei residui dei prodotti fitosanitari nell ortofrutta

54 Quale il futuro? Draft pren15662 april 2007: Food of of plant origin determination of of pesticide residues using GC-MS and/or LC-MS(/MS) following acetonitrile extraction/partitioning and clenup by by dispersive SPE QuEChERS - method Quale il il limite? Nessun rapporto di di concentrazione (uso di di acetonitrile) Strumentazione costosa (LC-MS(/MS) e GC-MS(/MS))

55 Metodo QuEChERS: alcune fasi

56 Bibliografia Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolo dell incertezza di misura I manuali Arpa I50451/LM Validazione e calcolo dell incertezza di misura dei metodi di prova chimici ARPA Emilia-Romagna Regolamento (CE) n. 396/2005 concernente i livelli massimi di residui di antiparassitari nei o sui prodotti alimentari e mangimi di origine vegetale e animale e che modifica la direttiva 91/414/CEE del Consiglio SANCO/10232/2006: Quality control procedures for pesticide residues analysis SANCO/3131/2007: method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed Rapporti Istisan 97/23, 97/24 e 6/06 SINAL documento DG 0007 e PT0002 FAO/IAEA Guidelines for single laboratory validation of analytical methods for trace-level concentrations of organic chemicals Annex 3 Worked example of method validation, as applied to a method for pesticides residues The Pesticide Manual 13 edizione editor CDS Tomlin BCPC 2003

57 GRUPPO DI LAVORO APAT - ARPA - APPA FITOFARMACI Un Grazie a tutti per l attenzione! Dr Marco Morelli Arpa Regione Emilia-Romagna Tel fax mamorelli@arpa.emr.it