Esercitazioni di Genomica

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1 Bioinformatica ai tempi del NGS, PhD CRIBI Biotechnology Center, University of Padua BMR Genomics srl, Spin-Off Giovanni Birolo, PhD CRIBI Biotechnology Center, University of Padua

2 Perché bioinformatica? Data generation is no longer the obstacle but data analysis on a mammoth scale is. Alison Chubb, PhD (November 2014)

3 Calendario 2 dicembre Formati e strumenti 3 dicembre Alcune applicazioni dell NGS (e formazione gruppi di interesse per argomento) 9 dicembre Analisi dati 16S / genomi batterici 16 dicembre Analisi dati Human Resequencing

4 Quando e come? Orario: PC con Linux (USB) o VirtualBox Iniziamo con una lezione frontale L esercitazione è fatta con tracce pubblicate nel blog (

5 Today s menu Strumenti della bioinformatica: Formati di file (FASTQ, SAM/BAM, VCF, BED) Pipelines (mettere insieme blocchetti per effettuare un analisi) IGV: Un programma semplice per visualizzare tracce generiche

6 Today s menu In particolare, nell esercitazione pratica: Scaricare file testuali dalla shell e visualizzarli con alcuni comandi utili Primo utilizzo di samtools Apertura di alcuni file con IGV Istruzioni on line: potete finire a casa!

7 Alcuni punti chiave 1. La maggior parte dei file bioinformatici sono file di testo semplice 2. Ci sono programmi robusti e ben fatti, molti nati per essere moduli in analisi complesse 3. Spesso dobbiamo metterli assieme: Perl è un linguaggio di programmazione usato come colla per costruire pipelines

8

9 Alcuni esempi di Editor di Testo: Gedit, in Ubuntu Text Wrangler, in OS X Notepad++, in Windows

10 Un esempio di Pipeline Ricerca di varianti di un paziente rispetto al reference Human being Variant calling VCF file DNA extraction SAM file Variant annotation Exome enrichment Local realignment Data mining NGS SAM file Magic wand FASTQ reads Alignment Found what I was looking for

11 Esempio: ricerca di varianti Formati di file Human being Variant calling VCF file DNA extraction SAM file Variant annotation Exome enrichment Local realignment Data mining NGS SAM file Magic wand FASTQ reads Alignment Found what I was looking for

12 Esempio: ricerca di varianti Programmi Human being Variant calling VCF file DNA extraction SAM file Variant annotation Exome enrichment Local realignment Data mining NGS SAM file Magic wand FASTQ reads Alignment Found what I was looking for

13 Esempio: ricerca di varianti Dove serve colla Human being Variant calling VCF file DNA extraction SAM file Variant annotation Exome enrichment Local realignment Data mining NGS SAM file Magic wand FASTQ reads Alignment Found what I was looking for

14 Formati di file

15 Fasta format >contig00001 length= numreads= TTTGGCGAACAGCCGGTCAATCTCTCCCGGCGTCGTTTCTGATTTCGGGCAGCGG CGGGCGCGCTGGTGCTGGGCGTCGGGTTGCCGGTCGGACAGAGCCGCGCACAGTC CGGCCGCAATGCCAGCCGGTACCCGGGTGCCAGCCTTTCTGGAAATACGCGCGGA CAGTGAAATTTCTGTCGCCCTTTATTGAAGGCGGGCAGGGGATTTTCACCGCCAT AGATTGTCGGTGAAGAACTGGACGCCGATCCGGCATCCTTCGTGGTGGAGAACGC CTGGTTCGCAATATCAGGTAATGGATAACGGGATGCGCATCACCGGCGGAAGCCA TGCGGACCAGCTATACCACCATGCGACGGCTCGGCGCGCTGGCACGACAGATGCT AGGCCGCTGCCGCTGAACTGGCGGTGCCGGTTACCAGCCTGCACACTGAGCCGGG AAGAGGAGTTCCTGCGCGATACCCATCGCCCGATGGCCGCGGTGCGGTTTCGTGC TGGATGCCGACGGCTACCCGCTGGCGCTGGAGGCGGTCAGCATCTGTGAAGGGCC AGGGGCTGGCCGGTCAGCACGGCGACACGCTGGATCCTACCGCGGTGGAAGGGTT GCAAAGCCTACGCCATTCCGCACGTTCGTATCGCGCAGATTTATCATAAAGGCCC GGCTGGGTTACTGGCGATCGGTCGGCAATTCGATGAATGACTTTTTCTATGAATG TCGATGAAATTGCCGAGCGGGGCAGGCTCGATCCGATGGCGCTCAGGCTGCATCT

16 Fasta format >contig00001 length= numreads= TTTGGCGAACAGCCGGTCAATCTCTCCCGGCGTCGTTTCTGATTTCGGGCAGCGG commento (non fa parte del nome) CGGGCGCGCTGGTGCTGGGCGTCGGGTTGCCGGTCGGACAGAGCCGCGCACAGTC CGGCCGCAATGCCAGCCGGTACCCGGGTGCCAGCCTTTCTGGAAATACGCGCGGA CAGTGAAATTTCTGTCGCCCTTTATTGAAGGCGGGCAGGGGATTTTCACCGCCAT AGATTGTCGGTGAAGAACTGGACGCCGATCCGGCATCCTTCGTGGTGGAGAACGC CTGGTTCGCAATATCAGGTAATGGATAACGGGATGCGCATCACCGGCGGAAGCCA TGCGGACCAGCTATACCACCATGCGACGGCTCGGCGCGCTGGCACGACAGATGCT AGGCCGCTGCCGCTGAACTGGCGGTGCCGGTTACCAGCCTGCACACTGAGCCGGG AAGAGGAGTTCCTGCGCGATACCCATCGCCCGATGGCCGCGGTGCGGTTTCGTGC TGGATGCCGACGGCTACCCGCTGGCGCTGGAGGCGGTCAGCATCTGTGAAGGGCC AGGGGCTGGCCGGTCAGCACGGCGACACGCTGGATCCTACCGCGGTGGAAGGGTT GCAAAGCCTACGCCATTCCGCACGTTCGTATCGCGCAGATTTATCATAAAGGCCC GGCTGGGTTACTGGCGATCGGTCGGCAATTCGATGAATGACTTTTTCTATGAATG TCGATGAAATTGCCGAGCGGGGCAGGCTCGATCCGATGGCGCTCAGGCTGCATCT

17 Formato ATTCAATAAAATTTTATCATAAATACCGAAATCCATCTAAAATGGTACCCGCTACAACAAAAGTAGTCATGACATGTGCAGGCGTG + TCAATAAAATTTTAGTACAATATGCTGCTTATCGGTTAACTCATCTACAAATAATTCTTCAAACTCTAATCGGAGCTTTTGATGGA + CTCAATAAAATTTTATCAATTCGATATTGAAGACTGTTTCTGTGAACATATAACGCTTTTGCTGCCTTGGATGCGTTTAAATTACA + TTTATTGACAATTTCATTTTACTCCTATGTCAAAAAAGCGTCAAGAAACCGCGTACATAAATTAAAATTTTCCGAAATTTAAAAGT + TTTATTGACAATTTCATTTTACTCCTATGTCAAAAAAGCGTCAAGAAACCGCGTACATAAATTAAAATTTTCCGAAATTTTAAAAG + <<4<;4:;8907;4;===>5;;:=188<;;;;;;;;);;;;;; <<<<=<<999099>>>0999*96;=?+899)5::-:

18 Formato ATTCAATAAAATTTTATCATAAATACCGAAATCCATCTAAAATGGTACCCGCTACAACAAAAGTAGTCATGACATGTGCAGGCGTG + TCAATAAAATTTTAGTACAATATGCTGCTTATCGGTTAACTCATCTACAAATAATTCTTCAAACTCTAATCGGAGCTTTTGATGGA + CTCAATAAAATTTTATCAATTCGATATTGAAGACTGTTTCTGTGAACATATAACGCTTTTGCTGCCTTGGATGCGTTTAAATTACA + TTTATTGACAATTTCATTTTACTCCTATGTCAAAAAAGCGTCAAGAAACCGCGTACATAAATTAAAATTTTCCGAAATTTAAAAGT + TTTATTGACAATTTCATTTTACTCCTATGTCAAAAAAGCGTCAAGAAACCGCGTACATAAATTAAAATTTTCCGAAATTTTAAAAG + <<4<;4:;8907;4;===>5;;:=188<;;;;;;;;);;;;;; <<<<=<<999099>>>0999*96;=?+899)5::-:

19 Formato BED Contiente features, ovvero annotazioni di porzioni di sequenze chr Hb_North_York 2619 Hemoglobin variant chr HBD c.1 G>A 2659 delta0 thalassemia chr Hb Sheffield 2672 Hemoglobin variant chr Hb A2-Lyon 2676 Hemoglobin variant chr Hb Aix-les-Bains 2677 Hemoglobin variant

20 Formato BED chr start end name span description chr Hb_North_York 2619 Hemoglobin variant chr HBD c.1 G>A 2659 delta0 thalassemia chr Hb Sheffield 2672 Hemoglobin variant chr Hb A2-Lyon 2676 Hemoglobin variant chr Hb Aix-les-Bains 2677 Hemoglobin variant

21 Formato SAM/BAM SAM (Sequence Alignment Format) è un formato di testo semplice che serve ad archiviare informazioni sugli allineamenti di sequenze È complesso da leggere per gli umani, facile per i computer (avviene il contrario per BLAST) È stato un grande miglioramento nelle analisi NGS

22 Da tenere in considerazione Come molti formati, ha un intestazione Come molti formati, è tabulare (campi separati da Tab) Alcune informazioni sono immediate, altre richiedono un computer per essere analizzate. Farete un esercizio su SAM tramite il blog, più tardi.

23 SAM ESEMPIO VISIVO

24 Il formato VCF VCF (Variant Calling Format) è un formato di testo semplice che serve ad archiviare informazioni sulle differenze di un genoma rispetto ad un reference. Pur essendo standard, è intrinsecamente variabile (può essere codificato in modi diversi) Alcune informazioni di base sono semplici da leggere. Anche in questo caso c è un intestazione.

25 Il formato VCF

26 Il nostro microscopio da bioinformatici: IGV

27 Integrative Genome Viewer IGV è un programma per visualizzare tracce genomiche. È gratuito e disponibile per tutte le piattaforme (Linux, Windows, OS X). Si seleziona il genoma su cui si vuole lavorare dalla lista o si carica il proprio genoma FASTA A questo punto si caricano le tracce che devono essere riferite a quel genoma (allineamenti, BED, VCF )

28 Can open: ALIGNMENTS (BAM) ANNOTATIONS (BED) VARIANTS (VCF)

29

30 VCF BAM BED/GFF

31 Un primo programma bioinformatico da riga di comando

32 BWA: Allineare sequenze BWA è un diffuso programma per allineare sequenze (tipicamente corte) contro un genoma di riferimento. Richiede di indicizzare il genoma di riferimento (FASTA) per renderlo usabile Fatto questo possiamo allineare le sequenze (FASTQ) contro il genoma indicizzato Il suo output è in formato SAM

33 BWA: Allineare sequenze 1) Un comando permette di indicizzare il genoma di riferimento per permettere gli allineamenti. Va effettuato una sola volta per reference, poi possiamo fare quanti allineamenti vogliamo 2) Un secondo comando permette di creare un file SAM contenente l allineamento di sequenze (FASTQ) contro un reference (FASTA).

34 Bignami BWA bwa index genome.fa bwa mem genome.fa reads.fastq > alignedreads.sam

35 Samtools Si tratta di un pacchetto per maneggiare file SAM e BAM. Li useremo oggi per convertire un file SAM in BAM, per ordinarlo per posizione e per indicizzarlo. Queste tre operazioni lo rendono visualizzabile in IGV.

36 Bignami Samtools samtools view -bs file.sam > file.bam samtools sort file.bam file-sorted samtools index file-sorted.bam

37 Adesso tocca a voi Buon lavoro

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