METODICHE DEL DNA RICOMBINANTE
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- Jacopo Bondi
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1 METODICHE DEL DNA RICOMBINANTE
2 ISOLAMENTO DEGLI RNA
3 PRINCIPALI FASI DI UN PROTOCOLLO PER L ISOLAMENTO DEGLI ACIDI RIBONUCLEICI: PRECIPITAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI CON CON SALI ED ETANOLO OMOGENEIZZAZIONE ESTENSIVA DELL ORGANO IN UNA SOLUZIONE CONCENTRATA DI CLORIDRATO DI GUANIDINIO CONTENENTE 2- MERCAPTOETANOLO CENTRIFUGAZIONE ESTRAZIONE DEI LIPIDI E DELLE PROTEINE CON FENOLO
4 OMOGENEIZZATORE POLYTRON
5
6 RISOLUBILIZZAZIONE DEL SEDIMENTO DI ACIDI NUCLEICI E ULTRACENTRIFUGAZIONE SU UN CUSCINETTO DI 5,7 M CLORURO DI CESIO RISOLUBILIZZAZIONE DEL SEDIMENTO DI RNA ANALISI SU GEL DI AGAROSIO IN FORMALDEIDE
7 mrna rrna 28S (4718 NT) rrna 18S (1874 NT) rrna 5,8S e 5S, trna ( NT)
8 SELEZIONE DEL POLI(A)+ RNA
9 FIGURA 7.2 DNA RICOMBINANTE
10 mrna
11 IL POLI(A)+ RNA PUO ESSERE POI UTILIZZATO PER ESPERIMENTI DI: NORTHERN BLOT COSTRUZIONE DI UN cdna
12 NORTHERN BLOT
13 LA METODICA DEL NORTHERN BLOT CONSENTE DI ANALIZZARE UN TRASCRITTOMA PER VERIFICARE LA PRESENZA DI UN RNA MESSAGGERO DI INTERESSE. QUESTO PUO AD ESEMPIO SERVIRE A VERIFICARE SE UN GENE E ESPRESSO O MENO IN UN DETERMINATO ORGANO.
14 A QUESTO SCOPO E UTILIZZATA UNA SONDA IN GRADO DI RICONOSCERE SPECIFICAMENTE L RNA DI INTERESSE. LA SONDA E SPESSO RAPPRESENTATA DAL RELATIVO GENE CODIFICANTE, IL CUI FILAMENTO STAMPO PUO LEGARSI IN MODO SPECIFICO ALL RNA DI INTERESSE.
15 FIGURA 8.15 MANGIAROTTI, MODIFICATA FIL. STAMPO (-) 95 C 68 C FIL. CODIF. (+) RNA (+)
16 FIGURA 7.23A DNA RICOMBINANTE
17 RNA FIGURA 7.23B DNA RICOMBINANTE
18 LA DEFINIZIONE DEL PROFILO DI ESPRESSIONE DI UN GENE MEDIANTE NORTHERN BLOT PUO DARE IMPORTANTI INDICAZIONI SULLA SUA FUNZIONE.
19 MARCATURA DI SONDE LA MARCATURA DI SONDE DI DNA PUO ESSERE EFFETTUATA CON VARIE METODICHE. MOLTE DI QUESTE PREVEDONO L USO DI UNA DNA POLIMERASI PER RICOPIARE IL DNA IN PRESENZA DI UN NUCLEOTIDE MARCATO CON 32 P. OVVIAMENTE IL NUCLEOTIDE DOVRA ESSERE UN ALFA 32 P dntp. I DUE METODI DI MARCATURA PIU UTILIZZATI SONO LA NICK TRANSLATION E IL RANDOM PRIMING.
20 NICK TRANSLATION FIGURA 2.16 MANGIAROTTI
21 FIGURA 4.4A GENOMI II
22 FIGURA 1.11 GENOMI II, MODIFICATA LEGAME IDROLIZZATO DALLA DNASI I
23 RANDOM PRIMING DENATURAZIONE IBRIDAZIONE DEI PRIMER FRAM. KLENOW, dntps
24 RANDOM PRIMING IL FRAMMENTO DI KNENOW E OTTENUTO MEDIANTE DIGESTIONE DELLA DNA POLIMERASI I CON SUBTILISINA
25 CLONAGGIO DEL DNA CLONARE SIGNIFICA PRODURRE UNA SERIE DI CLONI, CIOE COPIE IDENTICHE DI UNA MOLECOLA O DI UN ORGANISMO. CLONARE UNA MOLECOLA DI DNA SIGNIFICA QUINDI PRODURRE UN ELEVATO NUMERO DI COPIE DELLA MOLECOLA DI DNA IN ESAME.
26 CLONAGGIO
27 IL CLONAGGIO DEL DNA CONSENTE DI AMPLIFICARE SPECIFICI GENI E DI ANALIZZARE LA LORO SEQUENZA NUCLEOTIDICA.
28 ESISTONO DUE PRINCIPALI STRATEGIE PER CLONARE UN FRAMMENTO DI DNA: CLONAGGIO NEI VETTORI, CHE SI REALIZZA CON L AUSILIO DI CELLULE CHE ASSISTONO LA DUPLICAZIONE DEL DNA CLONAGGIO MEDIANTE PCR (REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI), CHE SI REALIZZA IN PROVETTA, IN ASSENZA DI CELLULE
29 FIGURA 5.11 DNA RICOMBINANTE
30 VA EVIDENZIATO CHE SOLO UNA LIMITATA PERCENTUALE DEI BATTERI SOTTOPOSTI ALLA TRASFORMAZIONE ASSUME IL DNA PLASMIDICO. CIO RENDE NECESSARIA UNA FASE DI SELEZIONE.
31 IL CLONAGGIO NEI VETTORI SI BASA SULL USO DI: ENZIMI DI RESTRIZIONE DNA LIGASI
32 ENZIMI DI RESTRIZIONE
33 GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE SONO ENDODEOSSINUCLEASI DI ORIGINE BATTERICA CARATTERIZZATE DA UN ELEVATA SPECIFICITA DI SEQUENZA. ESSI SONO ANCHE DEFINITI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE O RESTRITTASI.
34 CIASCUN ENZIMA DI RESTRIZIONE RICONOSCE UNA SPECIFICA SEQUENZA NUCLEOTIDICA E TAGLIA IL DOPPIO FILAMENTO IN QUELLA POSIZIONE O IN PROSSIMITA DI ESSA.
35 FIGURA 4.9 GENOMI II
36 LE ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE SERVONO AL BATTERIO A DEGRADARE DNA ESTRANEO, DIFENDENDOSI COSI DALL INFEZIONE DA PARTE DEI FAGI
37
38 Un ceppo batterico, per ogni attività di restrizione, possiede una DNA metilasi che riconosce la medesima sequenza, la quale viene modificata aggiungendo gruppi metilici a residui di adenina o citosina. Di regola, la metilazione blocca il legame dell enzima di restrizione, rendendo il DNA resistente alla scissione.
39 SONO STATE ISOLATE CIRCA 2500 ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E CIRCA 300 SONO COMMERCIALMENTE DISPONIBILI.
40 PRINCIPALI CARATTERISTICHE DEGLI ENZIMI DI RESTRIZIONE DI TIPO II: RICONOSCONO SEQUENZE PALINDROMICHE, IN MAGGIORANZA DI 4 O 6 bp TAGLIANO LE DUE CATENE POLINUCLEOTIDICHE NELLA STESSA POSIZIONE DI SEQUENZA. IN DIPENDENZA DEI SITI DI TAGLIO POSSONO GENERARE FRAMMENTI DI DNA CON ESTREMITA SPORGENTI O PIATTE L IDROLISI DEL LEGAME FOSFODIESTERICO
41 AVVIENE SUL VERSANTE 3 DEL FOSFATO: CIO GENERA FRAMMENTI DI DNA LE CUI CATENE POLINUCLEOTIDICHE HANNO UN FOSFATO IN 5. UTILIZZANO MG ++ COME COFATTORE LA LORO ATTIVITA DIPENDE FORTEMENTE DALLE CONDIZIONI DI ph E FORZA IONICA SONO GENERALMENTE MOLTO SENSIBILI AL CALORE
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43 TABELLA 4.3 GENOMI II
44 NUMERO BASI FREQUENZA TEORICA DI TAGLIO
45 FIGURA 4.10 GENOMI II
46 DNA LIGASI
47 FIGURA 4.13 GENOMI II
48 ENZIMI DI RESTRIZIONE E DNA LIGASI PERMETTONO DI MANIPOLARE IL DNA IN VITRO ED OTTENERE MOLECOLE DI DNA RICOMBINANTE CIOE FORMATE DA SEGMENTI DI DNA DI ORIGINE DIVERSA
49 FIGURA 5.7 DNA RICOMBINANTE
50 I VETTORI DI CLONAGGIO PLASMIDICI TIPICAMENTE CONTENGONO: UN ORIGINE DI REPLICAZIONE UN MARCATORE DI SELEZIONE UN POLYLINKER POLYLINKER ORI AMP
51 FIGURA 4.16 GENOMI II
52 L INSERIMENTO DI UN FRAMMENTO DI DNA IN UN PLASMIDE PUO ESSERE OSTACOLATO DA UNA RILIGAZIONE DEL PLASMIDE. IN QUESTI CASI I BATTERI OTTENUTI DALLA TRASFORMAZIONE CON LA MISCELA LIGASICA SARANNO IN PARTE PARENTALI ED IN PARTE RICOMBINANTI.
53 FIGURA 4.16 GENOMI II, MODIFICATA + PLASMIDE RICOMBINANTE PLASMIDE PARENTALE
54 LA SELEZIONE DEI RICOMBINANTI PUO ESSERE EFFETTUATA ESTRAENDO I PLASMIDI DA VARI CLONI BATTERICI ED EFFETTUANDO UNA DIGESTIONE CON L ENZIMA DI RESTRIZIONE PER VERIFICARE IL RILASCIO DELL INSERTO.
55 IN ALTERNATIVA LA SELEZIONE DEI RICOMBINANTI PUO ESSERE NOTEVOLMENTE FACILITATA DALL UTILIZZO DI VETTORI DI CLONAGGIO SPECIFICI QUALI I VETTORI puc
56 FIGURA 4.19 GENOMI II puc18 puc18
57 Galattosio + 5-Bromo-4-cloro-3-indolil- B-D-galattoside (X-Gal) INCOLORE 5-Bromo-4-cloro-3- indolo BLU
58 FIG FONDAMENTI DI BIOL. MOL.
59 IL CLONAGGIO DI UN GENE IN PLASMIDI APPROPRIATI, DENOMINATI VETTORI DI ESPRESSIONE, CONSENTE LA PRODUZIONE IN BATTERI DI PROTEINE DI INTERESSE FARMACEUTICO, QUALI L INSULINA, L ERITROPOIETINA E L ORMONE DELLA CRESCITA.
60 UN VETTORE DI ESPRESSIONE E UN VETTORE DI CLONAGGIO MODIFICATO CONTENENTE ELEMENTI DI CONTROLLO DELL ESPRESSIONE GENICA IN GRADO DI ASSICURARE LA TRASCRIZIONE DEL DNA CLONATO E LA TRADUZIONE DEL RELATIVO TRASCRITTO.
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62 STRUTTURA TIPICA DI UN VETTORE DI ESPRESSIONE PROCARIOTICO ORI AMP
63 ATG TAA, TAG O TGA SEQUENZA DI SHINE-DALGARNO REGIONE 35 REGIONE 10 TERMINATORE DELLA TRASCRIZIONE POLYLINKER
64 CLONAGGIO DEL DNA NEL FAGO LAMBDA
65 I VETTORI DI CLONAGGIO PLASMIDICI POSSONO ACCOGLIERE FRAMMENTI DI DNA LUNGHI POCHE MIGLIAIA DI COPPIE DI BASI. FRAMMENTI DI DNA PIU LUNGHI POSSONO ESSERE CLONATI NEL CROMOSOMA DEL FAGO LAMBDA. IN QUESTO CASO L AMPLIFICAZIONE DEL DNA VIENE OTTENUTA INFETTANDO E.COLI CON IL FAGO RICOMBINANTE.
66 IL CROMOSOMA DEL FAGO LAMBDA E COSTITUITO DA UNA MOLECOLA DI DNA LINEARE DI CIRCA 50 KB PROVVISTA DI ESTREMITA COESIVE.
67 FIGURA 2.12 DNA RICOMBINANTE
68 FIGURA 4.21 GENOMI II
69 FIGURA 7.20 DNA RICOMBINANTE
70 FIGURA 4.23 GENOMI II
71 ISOLAMENTO DEL DNA GENOMICO
72 PRINCIPALI FASI DI UN PROTOCOLLO PER L ISOLAMENTO DI DNA GENOMICO 1. SCELTA DELL ORGANO 2. OMOGENIZZAZIONE IN PBS/EDTA 3. LISI DELLE CELLULE E DEI NUCLEI CON SDS 4. DIGESTIONE DELLE PROTEINE CROMATINICHE CON PROTEINASI K 5. ESTRAZIONE DEI FRAMMENTI PEPTIDICI E DEI LIPIDI CON FENOLO
73 6. DIGESTIONE DEGLI ACIDI RIBONUCLEICI CON RNASI A 7. PRECIPITAZIONE DEL DNA GENOMICO CON SALI ED ETANOLO 8. RISOLUBILIZZAZIONE DEL DNA 9. ANALISI DEL DNA MEDIANTE ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO
74 IL PBS O PHOSPHATE BUFFERED SALINE E ESSENZIALMENTE UNA SOLUZIONE FISIOLOGICA TAMPONATA. ESSA CONTIENE TAMPONE FOSFATO ph 7,4 E SALI (NaCl e KCl) IN CONCENTRAZIONI TALI CHE LA FORZA IONICA SIA PARI A 0,15 M. acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)
75 SOUTHERN BLOT
76 IL SOUTHERN BLOT E UNA METODICA CHE CONSENTE DI ANALIZZARE UN DNA GENOMICO PER VERIFICARE LA PRESENZA DI UN GENE DI INTERESSE.
77 LA METODICA DEL SOUTHERN PREVEDE LE SEGUENTI FASI: DIGESTIONE DEL DNA GENOMICO CON ENZIMI DI RESTRIZIONE ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO DENATURAZIONE DEL DNA NEL GEL TRASFERIMENTO DEL DNA SU MEMBRANA IBRIDAZIONE CON UNA SONDA MARCATA CON 32P
78 FIGURA 7.23 DNA RICOMBINANTE, MODIFICATA DNA TAGLIATO CON VARI ENZIMI DI RESTRIZIONE DENATURAZIONE CON ALCALI
79 FIGURA 7.23 DNA RICOMBINANTE
80 NORTHERN mrna DI INTERESSE (+) SONDA (+) (-) SOUTHERN GENE DI INTERESSE (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-)
81 LA SONDA UTILIZZATA IN UN ESPERIMENTO DI SOUTHERN BLOT PUO ESSERE RAPPRESENTATA DA UN GENE OMOLOGO ISOLATO DA UNA SPECIE DIVERSA.
82 FIGURA 7.5 GENOMI II
83 L IBRIDAZIONE TRA SONDA E DNA BERSAGLIO IN UN ESPERIMENTO DI ZOOBLOT E POSSIBILE PERCHE LA DOPPIA ELICA IBRIDA PUO TOLLERARE ALCUNI DISAPPAIAMENTI. IN GENERALE SI PUO RISCONTRARE UN CHIARO SEGNALE DI IBRIDAZIONE SE L IDENTITA DI SEQUENZA E MAGGIORE DEL 70 %.
84 DISAPPAIAMENTI O MISMATCH SONDA GENE DI INTERESSE
85 LA METODICA DEL SOUTHERN NON SOLO PERMETTE DI EVIDENZIARE UN GENE MA CONSENTE ANCHE DI DEFINIRNE LA MAPPA DI RESTRIZIONE, CIOE DI STABILIRE LA PRESENZA E LA LOCALIZZAZIONE DI SITI DI RESTRIZIONE NEL GENE ED INTORNO AD ESSO.
86 ESEMPIO: UN DNA GENOMICO E DIGERITO CON VARI ENZIMI DI RESTRIZIONE ED ANALIZZATO MEDIANTE SOUTHERN PER EVIDENZIARE UN GENE DI INTERESSE. Eco R1 Bam H1 Eco R1+ Bam H bp bp bp bp bp
87 I RISULTATI DEL SOUTHERN DEFINISCONO LA SEGUENTE MAPPA DI RESTRIZIONE B E B E B
88 PROGETTAZIONE DI SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE
89 GLI ESPERIMENTI DI SOUTHERN BLOT SONO POSSIBILI ANCHE QUANDO NON SIA DISPONIBILE UNA SONDA NATURALE (GENE OMOLOGO). IN QUESTI CASI SI RICORRE AD UN OLIGODEOSSINUCLEOTIDE SINTETICO (A SINGOLO FILAMENTO) PROGETTATO SULLA BASE DELLA SEQUENZA AMMINOACIDICA DELLA PROTEINA CODIFICATA.
90 FIGURA 7.6 DNA RICOMBINANTE (WATSON)
91 FIGURA 3.20 GENOMI II
92 LA SONDA OLIGONUCLEOTIDICA DEVE ESSERE SUFFICIENTEMENTE LUNGA DA RICONOSCERE SELETTIVAMENTE IL GENE DI INTERESSE (ALMENO 17 NUCLEOTIDI, MEGLIO 20) LA SONDA PUO ESSERE DEGENERATA, CIOE COSTITUITA DA UNA MISCELA DI OLIGONUCLEOTIDI
93 RETROTRADUZIONE DELLA PROTEINA DI INTERESSE
94 SIGLE DELLE BASI AZOTATE
95 GRAFICO DI DEGENERAZIONE OTTENUTO CON UNA FINESTRA DI 6 RESIDUI LIVELLO DI DEGENERAZIONE POSIZIONE DELLA SEQUENZA AMMINOACIDICA
96 INDIVIDUAZIONE DELLA SEQUENZA MENO DEGENERATA
97 SINTESI CHIMICA DI SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE LA SINTESI E EFFETTUATA IN FASE SOLIDA LA DIREZIONE DI SINTESI E 3 ->5 POSSONO ESSERE SINTETIZZATI OLIGONUCLEOTIDI LUNGHI FINO A 100 NUCLEOTIDI.
98 5 -GGATTTACCGATGACGATGA-3 G A-5 OH T A-G-5 OH A-G-T-5 OH
99 FIGURA 5.5 DNA RICOMBINANTE (WATSON) LA SINTESI PREVEDE L USO DI NUCLEOTIDI FOSFORAMMIDITI IN AMBIENTE ANIDRO DMT = DIMETOSSITRITILE
100 SONDE DEGENERATE CIOE MISCELE DI SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE POSSONO ESSERE SINTETIZZATE CON UN APPROCCIO COMBINATORIALE.
101 5 -GGATTTACCGATGACGATGA-3 5 -GCATTTACCGATGACGATCA-3 A A G + C T A-G A-C A-G-T A-C-T
102 MARCATURA DI SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE HO-CH2 * GAMMA 32P-ATP A * T4 POLINUCLEOTIDE CHINASI OLIGONUCLEOTIDE
103 COSTRUZIONE ED ANALISI DI GENOTECHE
104 L ISOLAMENTO DI UN GENE DA UNA DETERMINATA SPECIE ANIMALE O VEGETALE VIENE EFFETTUATO IN DUE FASI: 1. CLONAGGIO DI TUTTI I GENI DELLA SPECIE IN ESAME IN MODO DA OTTENERE UNA GENOTECA 2. ANALISI DELLA GENOTECA CON UNA SONDA SPECIFICA PER INDIVIDUARE IL CLONE CONTENENTE IL GENE DI INTERESSE
105 FIGURA 7.6 DNA RICOMBINANTE (WATSON) II EDIZIONE
106 GENOTECA IN E.COLI GENOTECA IN LAMBDA
107 UNA GENOTECA DI UNA DETERMINATA SPECIE (ALTRIMENTI DETTA BIBLIOTECA GENOMICA O LIBRARY GENOMICA) E UNA COLLEZIONE DI MICRORGANISMI, SPESSO RAPPRESENTATI DA E. COLI O DAL FAGO LAMBDA, CIASCUNO DEI QUALI OSPITA E REPLICA CON IL PROPRIO GENOMA UN SEGMENTO DI DNA DELLA SPECIE IN ESAME
108 FIGURA 7.20 DNA RICOMBINANTE
109 ---GGATCC---> <--CCTAGG--- Bam H1 ----G <---CCTAG ---GATC---> <---CTAG--- Sau3A GATC---> --- REAZIONE LIGASICA ----GGATC---> <---CCTAG--- SITO IBRIDO
110 FIGURA 13.6B GENOMI II
111 FIGURA 7.5 DNA RICOMBINANTE
112 FIGURA 7.5 DNA RICOMBINANTE
113 COSTRUZIONE ED ANALISI DI ARCHIVI DI cdna
114 LE MOLECOLE DI RNA NON POSSONO ESSERE CLONATE. SE SI VUOLE STUDIARE UNO SPECIFICO RNA MESSAGGERO OCCORRE PRIMA CONVERTIRLO IN cdna. UN cdna E UN DNA COMPLEMENTARE AD UN RNA MESSAGGERO, OTTENUTO IN VITRO UTILIZZANDO UNA TRASCRITTASI INVERSA RETROVIRALE. mrna TRASCRIZIONE INVERSA cdna
115 ESSENDO OTTENUTO DA UN MRNA CHE HA GIA SUBITO IL PROCESSO DI SPLICING, IL cdna RISULTA PRIVO DI INTRONI. LO STUDIO DI UN cdna RISULTA QUINDI PIU SEMPLICE DELLO STUDIO DEL RELATIVO GENE.
116 UN ARCHIVIO DI cdna, ALTRIMENTI DETTO LIBRARY DI cdna, E UNA COLLEZIONE DI cdna, DERIVANTI DA UNO SPECIFICO TRASCRITTOMA, CLONATI IN E.COLI O NEL FAGO LAMBDA. UN ARCHIVIO DI cdna E UTILIZZATO PER ISOLARE SPECIFICI cdna.
117 FIGURA 5.32 GENOMI II
118 FIGURA 7.4 DNA RICOMBINANTE
119 FIGURA 7.5 DNA RICOMBINANTE
120 FIGURA 7.5 DNA RICOMBINANTE
121 REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI
122 LA REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI O POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) CONSENTE DI CLONARE IL DNA IN PROVETTA, RIPRODUCENDO LE CONDIZIONI UTILI ALLA REPLICAZIONE DEL DNA
123 PCR
124 FIGURA GENOMI II
125 REAGENTI UTILIZZATI NELLA PCR
126
127 FIGURA 4.28 GENOMI II
128 FIGURA 4.29 GENOMI II
129 I CICLI TERMICI DELLA PCR Denaturazione (1min a 94 C) Extension o polimerizzazione (1min a 72 C) Annealing o ibridazione (1min a C)
130 IL PRODOTTO DI PCR HA UNA TAGLIA MOLECOLARE PARI ALLA DISTANZA TRA I 5 - OH DEI DUE OLIGONUCLEOTIDI PRIMER PCR
131 FIGURA 4.30 GENOMI II
132 ESEMPIO DI ANALISI SU GEL DI AGAROSIO DI UN PRODOTTO DI PCR
133 CONFRONTO TRA LE DUE STRATEGIE DI CLONAGGIO CLONAGGIO IN UN VETTORE PLASMIDICO CLONAGGIO MEDIANTE PCR
134 PREGI DELLA PCR: ELEVATA VELOCITA DI ESECUZIONE ELEVATA SENSIBILITA
135 PUNTI DEBOLI DELLA PCR: LE DNA POLIMERASI TERMOFILE POSSONO INTRODURRE MUTAZIONI POSSIBILI AMPLIFICAZIONI ASPECIFICHE DOVUTE A TRACCE DI DNA CONTAMINANTE LIMITATA LUNGHEZZA DEL DNA AMPLIFICABILE
136 PRINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PCR: DNA FINGERPRINTING PER ANALISI MEDICO-FORENSI ISOLAMENTO DI GENI ISOLAMENTO DI cdna (RT-PCR) ASSEMBLAGGIO GENI SINTETICI TAILING DI MOLECOLE DI DNA MUTAGENESI SITO-DIRETTA DIAGNOSI DI MALATTIE INFETTIVE DIAGNOSI MALATTIE GENETICHE
137 FIGURA 4.3 GENOMI II GLI OLIGO SERVONO DA SONDE
138 RT-PCR AAAAAA INSIEME DI mrna (TRASCRITTOMA) AAAAAA TTTTTT TRASCRIZIONE INVERSA AAAAAA TTTTTT INSIEME DI cdna PRIMER SPECIFICI PER IL cdna DI INTERESSE TTTTTT 1 CICLO PCR AAAAAA TTTTTT SUCCESSIVI CICLI PCR cdna DI INTERESSE AMPLIFICATO
139 TAILING
140 TABELLA 27.6 DNA RICOMBINANTE
141 LA TIPIZZAZIONE DEL DNA CONSENTE DI DETERMINARE IL PROFILO GENETICO DI UN INDIVIDUO. TALE ANALISI E UTILE IN VARI CAMPI DELLA MEDICINA LEGALE, AD ESEMPIO PER: ANALISI DI PATERNITA RICONOSCIMENTO RESTI CORPOREI TRACCIARE IL PROFILO GENETICO DELL AUTORE DI UN CRIMINE
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144 ARCHIVI DI ESPRESSIONE LA RICERCA DI UN cdna PUO ESSERE REALIZZATA ANCHE QUANDO NON SIA DISPONIBILE ALCUNA SONDA DI DNA. OCCORRE PERO DISPORRE DI ANTICORPI IN GRADO DI RICONOSCERE LA PROTEINA CODIFICATA.
145 FIGURA 7.10 DNA RICOMBINANTE
146 ASSEMBLAGGIO GENI SINTETICI
147 SE VOGLIAMO OTTENERE IL DNA CODIFICANTE UNA PROTEINA LA CUI SEQUENZA AMMINOACIDICA E COMPLETAMENTE NOTA, QUESTO PUO ANCHE ESSERE OTTENUTO PER VIA SINTETICA, A PATTO CHE LA SUA SEQUENZA NUCLEOTIDICA NON SIA TROPPO LUNGA. QUESTA STRATEGIA E SPESSO FINALIZZATA ALLA COSTRUZIONE DI UN SISTEMA DI ESPRESSIONE PER LA PRODUZIONE IN ALTE RESE DELLA PROTEINA IN ESAME.
148 LA COSTRUZIONE DI UN GENE SINTETICO PREVEDE LE SEGUENTI FASI: 1.PROGETTAZIONE DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICA 2.ASSEMBLAGGIO DEL GENE A PARTIRE DA OLIGONUCLEOTIDI SINTETICI
149 LA PROGETTAZIONE DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICA PREVEDE INNANZITUTTO LA RETROTRADUZIONE DELLA SEQUENZA AMMINOACIDICA DELLA PROTEINA. TALE OPERAZIONE E ESEGUITA SECONDO CRITERI DETTATI DAL CODON USAGE.
150 FIGURA 3.20 GENOMI II
151 CODON USAGE DI E. COLI
152 IN SEGUITO ALLA RETROTRADUZIONE, LA STRUTTURA SECONDARIA DEL TRASCRITTO E RIDOTTA MEDIANTE L INTRODUZIONE DI MUTAZIONI SILENTI
153 MUTAZIONI SILENTI TTT -> TTC Phe -> Phe
154 In linea di principio, la costruzione di un gene sintetico potrebbe essere realizzata mediante la sintesi chimica delle due catene polinucleotidiche antiparallele seguita dalla loro ibridazione a formare un DNA a doppio filamento. In realtà tale possibilità è preclusa dalla limitata lunghezza degli oligonucleotidi ottenibili mediante sintesi chimica. Oligonucleotidi più lunghi di 80 basi possono infatti essere ottenuti solo con rese molto basse, in dipendenza del fatto che il rendimento di accoppiamento dei singoli cicli della sintesi chimica non raggiunge mai il 100%. Inoltre i trattamenti acidi ai quali gli oligonucleotidi sono ciclicamente sottoposti per la deprotezione del 5' -OH possono produrre una parziale depurinazione del DNA. Per questi motivi, le ditte che producono oligonucleotidi su commissione sconsigliano le ordinazioni di oligo più lunghi di 80 basi e
155 generalmente consigliano che oligonucleotidi più lunghi di 50 basi siano sottoposti a procedure di purificazione. Ciò premesso, geni sintetici lunghi svariate centinaia di coppie di basi possono essere ottenuti solo sintetizzando numerosi oligonucleotidi che posti in tandem coprano l'estensione delle due catene deossinucleotidiche desiderate.
156
157 Sebbene molte ditte siano oggi in grado di fornire oligonucleotidi già fosforilati, la procedura su descritta presenta l inconveniente di richiedere l'utilizzo di oligo purificati su gel o mediante HPLC. Infatti, solo se gli oligo sono della giusta taglia potranno esibire i 3'-OH e 5'-P giustapposti per l'azione della DNA ligasi.
158 UNA METODICA ALTERNATIVA BASATA SULLA PCR CONSENTE DI OTTENERE GENI SINTETICI A PARTIRE DA OLIGONUCLEOTIDI NON FOSFORILATI E NON PURIFICATI. QUESTA METODICA E BASATA SUL PRINCIPIO DEL TAILING.
159 TAILING
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162 POSSONO ESSERE ASSEMBLATI AGEVOLMENTE GENI SINTETICI LUNGHI FINO A 450 BP (PROTEINA CODIFICATA DI 150 AMMINOACIDI). GENI PIU LUNGHI RICHIEDONO MAGGIORE IMPEGNO.
163
164 MUTAGENESI SITO-DIRETTA
165 LA TECNICA DELLA MUTAGENESI SITO- DIRETTA CONSENTE DI INTRODURRE MUTAZIONI IN CORRISPONDENZA DI SITI SPECIFICI DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICA. IL DNA DA SOTTOPORRE A MUTAGENESI E SPESSO RAPPRESENTATO DAL DNA CODIFICANTE UNA PROTEINA OGGETTO DI STUDIO, CLONATO IN UN VETTORE DI ESPRESSIONE.
166 MUTAGENIZZANDO SPECIFICI CODONI E POSSIBILE OTTENERE VERSIONI MUTATE DELLA PROTEINA DI INTERESSE. LE PROTEINE MUTANTI POSSONO POI ESSERE STUDIATE NELLE LORO PROPRIETA FUNZIONALI E PARAGONATE CON LA PROTEINA WILD TYPE (DI TIPO SELVATICO, NATURALE O NON MUTATA) PER CAPIRE LE BASI STRUTTURALI DELLA FUNZIONE PROTEICA. IN QUESTO SENSO, LA MUTAGENESI SITO-DIRETTA RAPPRESENTA UN STRUMENTO MOLTO POTENTE PER LO STUDIO DEL RAPPORTO STRUTTURA- FUNZIONE DELLE PROTEINE.
167 LA MUTAGENESI SITO-DIRETTA E AD ESEMPIO MOLTO UTILIZZATA PER LO STUDIO DEGLI ENZIMI. MUTAGENIZZANDO UN RESIDUO AMMINOACIDICO DELL ENZIMA E VALUTANDO L EFFETTO SULLE PROPRIETA CATALITICHE SI PUO STABILIRE SE IL RESIDUO IN ESAME FA PARTE O MENO DEL SITO ATTIVO. QUESTO TIPO DI APPROCCIO E UTILIZZATO ANCHE SE SONO DISPONIBILI DETTAGLIATE INFORMAZIONI STRUTTURALI.
168
169 LA MUTAGENESI E GENERALMENTE EFFETTUATA IN MODO DA SOSTITUIRE IL RESIDUO IN ESAME CON UN ALANINA. IN LINEA DI PRINCIPIO LA MUTAZIONE A GLICINA SAREBBE PREFERIBILE PERCHE RIMUOVE COMPLETAMENTE LA CATENA LATERALE. CIO NONOSTANTE SI EVITA PER NON INTRODURRE UNA ECCESSIVA FLESSIBILITA NELLA CATENA PRINCIPALE.
170 I RESIDUI AMMINOACIDICI CHE MUTATI AD ALANINA PRODUCONO UNA MARCATA DIMINUZIONE DELL ATTIVITA ENZIMATICA POSSONO ESSERE CONSIDERATI PARTE DEL SITO ATTIVO.
171
172 IL RUOLO DEI RESIDUI AMMINOACIDICI DEL SITO ATTIVO PUO POI ESSERE APPROFONDITO VALUTANDO L EFFETTO DELLE MUTAZIONI SUI PARAMETRI CINETICI DELL ENZIMA (kcat e Km).
173 LA kcat E UN INDICE DELL EFFICIENZA CATALITICA DELL ENZIMA. LA SUA UNITA DI MISURA E sec -1. Km E UN INDICE DELL AFFINITA DELL ENZIMA PER IL SUBSTRATO. LA SUA UNITA DI MISURA E M -1. kcat E Km SI MISURANO ESEGUENDO SAGGI DI ATTIVITA A VARIE CONCENTRAZIONI DI SUBSTRATO.
174
175 ANALISI CINETICA ENZIMATICA DEL MUTANTE M1
176 IL MUTANTE M1 HA UNA Km SUPERIORE A QUELLA DELL ENZIMA WILD TYPE CIOE HA UNA MINORE AFFINITA PER IL SUBSTRATO. SE NE DEDUCE CHE IL RESIDUO MUTATO E COINVOLTO NEL LEGAME DEL SUBSTRATO.
177 ANALISI CINETICA ENZIMATICA DEL MUTANTE M2
178 IL MUTANTE M1 HA UNA kcat INFERIORE A QUELLA DELL ENZIMA WILD TYPE CIOE HA UNA MINORE EFFICIENZA CATALITICA. SE NE DEDUCE CHE IL RESIDUO MUTATO E COINVOLTO NELLA CATALISI ENZIMATICA.
179
180 LA CONOSCENZA DELLA MAPPA DEL SITO ATTIVO DI UN ENZIMA HA IMPORTANTI IMPLICAZIONI PER LO SVILUPPO DI INIBITORI
181 LA MUTAGENESI SITO-DIRETTA E AMPIAMENTE UTILIZZATA ANCHE NEL CAMPO DELL INGEGNERIA PROTEICA, PER OTTENERE ENZIMI CON CARATTERISTICHE PIU ADATTE A PARTICOLARI APPLICAZIONI INDUSTRIALI O BIOMEDICHE.
182
183 LE CARATTERISTICHE ENZIMATICHE CHE POSSONO ESSERE ALTERATE INCLUDONO: TERMOSTABILITA STABILITA IN SOLVENTI ORGANICI RESISTENZA A PROTEASI
184 ESISTONO NUMEROSE TECNICHE DI MUTAGENESI SITO-DIRETTA. LE PIU IMPORTANTI SONO: MUTAGENESI A CASSETTA MUTAGENESI PER ESTENSIONE DEL PRIMER MUTAGENESI MEDIANTE PCR
185 MUTAGENESI A CASSETTA
186 LA MUTAGENESI PER ESTENSIONE DEL PRIMER RICHIEDE CHE IL GENE DA MUTAGENIZZARE SIA PRIMA CLONATO NEL CROMOSOMA DEL FAGO M13 PER OTTENERE DNA A SINGOLO FILAMENTO.
187 CICLO REPLICATIVO DEL FAGO M13 IL GENE DA MUTAGENIZZARE VA CLONATO NELLA RF DEL FAGO
188 FIGURA 7.1 ANALISI DEI GENI E GENOMI
189 ALCUNI VETTORI DI ESPRESSIONE CONTENGOLO L ORIGINE DI REPLICAZIONE DI M13 E PER QUESTO POSSONO GENERARE DNA A SINGOLO FILAMENTO DIRETTAMENTE UTILIZZABILE PER LA MUTAGENESI
190 MAPPA DEL VETTORE DI ESPRESSIONE pet- 22
191 MUTAGENESI PER ESTENSIONE DEL PRIMER FRAMMENTO DI KLENOW DELLA DNA POLIMERASI, dntps, DNA LIGASI
192 FIGURA 3.20 GENOMI II
193 MUTAGENESI MEDIANTE PCR DELL ESTREMITA DI UN GENE
194 MUTAGENESI MEDIANTE PCR DELLA PARTE CENTRALE DI UN GENE
195 LA TECNICA DELLA MUTAGENESI SITO- DIRETTA PUO ANCHE ESSERE UTILIZZATA PER LO STUDIO DI PROMOTORI DELLA TRASCRIZIONE, AD ESEMPIO PER VERIFICARE SE UNA DATA SEQUENZA E SENSIBILE AD UNO SPECIFICO FATTORE TRASCRIZIONALE
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