Produzioni biotecnologiche agroalimentari: Latti fermentati e Probiotici

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1 Produzioni biotecnologiche agroalimentari: Latti fermentati e Probiotici Dr. Monica Agnolucci Dip. di Scienze Agrarie, Alimentari e Agro-ambientali Università di Pisa Via del Borghetto Pisa (ITALY) Phone: Fax: monica.agnolucci@unipi.it

2 Il Latte alimentare Prodotto della mungitura regolare, ininterrotta e completa della mammella di animali in buono stato di salute e nutrizione (R.D. 9/5/29 n. 994 e successive modifiche) Se il latte non è di bovina, deve essere specificata la specie animale di provenienza

3 La sua composizione comprende: - Acqua circa 87%; - Zuccheri o glucidi: disaccaride lattosio (glucosio e galattosio) e altri quali glucosio, galattosio, N-acetilglucosammina e N-acetilgalattosammina, per gran parte legati alle proteine e in particolare alla k-caseina; - Frazione lipidica: il grasso del latte è costituito principalmente da trigliceridi; - Frazione azotata: proteine 75-78% caseine proteine organizzate sotto forma di micelle (αs 1, αs 2, β e k-caseina), 18-20% sieroproteine (β-lattoglobulina, α-lattoalbumina) e sostanze azotate non proteiche quali urea, creatina, creatinina e ammoniaca; - Acidi organici: 90% acido citrico; - Sali minerali oligoelementi: cloruri, fosfati, citrati, potassio, sodio, calcio e magnesio. Sodio, potassio e cloruri in forma di ioni liberi e la loro concentrazione correlata in maniera inversamente proporzionale con quella del lattosio. Calcio, magnesio, fosforo e citrati sono presenti nel latte sia associati alla caseina che allo stato libero; - Vitamine: nel latte crudo sono presenti le principali vitamine che, a seconda della loro differente solubilità in acqua, sono distribuite nella fase lipidica o acquosa del latte. I successivi trattamenti di trasformazione possono modificare sensibilmente la composizione vitaminica del latte

4 Il Latte alimentare Il latte contiene anche sostanze antibatteriche rappresentate da: - Immunoglobuline; - Sistema lattoperossidasi (lattoperossidasi + tiocianato + acqua ossigenata); - Lisozima; - Lattoferrina (chelante il ferro); - Agglutinine (lattenine); Potere batteriostatico naturale del latte

5 Il Latte alimentare Tali sostanze rallentano, seppur per breve tempo, l attività dei batteri che contaminano il latte al momento della mungitura Poi inevitabilmente i m.o. prendono il sopravvento..

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7 I latti fermentati Prodotti ottenuti per coagulazione del latte senza sottrazione del siero, ad opera di colture d avvio caratteristiche per ciascun tipo di latte fermentato; tali colture, per legge, devono mantenersi vive e vitali fino al momento del consumo In funzione delle specifiche colture starter impiegate, i latti fermentati vengono classificati in tre tipologie: Latti fermentati acidi Latti fermentati probiotici Latti fermentati acido-alcolici

8 Classificazione dei latti fermentati

9 I latti fermentati Latti fermentati acidi termofili: comprendono quei latti fermentati che vengono ottenuti con l impiego di colture omofermentanti, appartenenti ai generi Streptococcus e Lactobacillus, che presentano una crescita ottimale a temperature relativamente elevate, tra 30 e 45 C, e producono acido lattico. Queste colture sono utilizzate sia singolarmente che in associazione con ceppi mesofili (yogurt, dhai indiano e skyr Irlandese) Latti fermentati acidi mesofili: sono ottenuti per fermentazioni condotte a temperatura ambiente (< 30 C) e sono caratterizzati da m.o. omo e eterofermentanti dei generi Lactococcus, Lactobacillus e Leuconostoc (latticello, creme acide, Ymer, latti fermentati filanti dei paesi scandinavi)

10 I latti fermentati Latti fermentati probiotici: sono ottenuti per fermentazione diretta con lattobacilli termofili o mesofili o aggiungendo allo yogurt specie microbiche probiotiche appartenenti ai generi Lactobacillus e Bifidobacterium Latti fermentati acido-alcolici: sono caratterizzati dall associazione tra batteri lattici e lieviti; contengono quindi come prodotti della fermentazione, non solo acido lattico, ma anche alcol etilico e CO 2 (Kefir, Koumys, Lben, Gioddu)

11 I latti fermentati La diversità e la pluralità dei latti fermentati sono connesse al tipo di latte utilizzato (vacca, pecora, capra, bufala, cavalla, cammella, asina, yak), alla tecnologia di produzione applicata e, soprattutto, dai tipi di m.o. che intervengono nel processo, nonché alle tradizioni delle popolazioni che li producono

12 Principali tipi di latti fermentati

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14 Principali funzioni svolte dai m.o. dei latti fermentati: Bioconservazione del prodotto produzione di acidi organici (lattato e acetato) e batteriocine che inibiscono lo sviluppo di m.o. alterativi e/o patogeni Miglioramento delle caratteristiche sensoriali del prodotto produzione di acidi organici e di composti volatili (acetaldeide, acetile), idrolisi parziale di proteine e grassi e produzione in alcuni prodotti di alcol etilico (kefir, koumiss e gioddu) Miglioramento delle proprietà reologiche consistenza, viscosità e struttura Aumento delle caratteristiche funzionali m.o. probiotici

15 Yogurt E il più noto tra i latti fermentati Origine Turca e Bulgara preparato tradizionalmente da latte di pecora, capra, bufala o vacca (attualmente si impiega quasi esclusivamente latte vaccino) Etimologia: dal turco joggurt significa latte denso

16 Yogurt Definito come: il latte fermentato da m.o. specifici acidificanti Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Tale latte viene ottenuto impiegando come materia prima latte fresco intero o parzialmente o totalmente scremato sottoposto ad un processo di bonifica termica. La nota qualificante dello yogurt è costituita dalla presenza, in quantità elevata, dei fermenti specifici vivi e vitali nel prodotto finito fino al momento del consumo Lo yogurt viene di norma ottenuto da latte vaccino ma può essere utilizzato anche latte di pecora, bufala o capra; in tale caso deve essere fatta obbligatoriamente menzione nella denominazione di vendita

17 Streptococcus thermophilus Temperatura ottimale di sviluppo C Omofermentante Ossigeno indipendente ph < 5,7 Cocco Gram + Catalasi Produce ac. lattico in quantità < 1% Sintetizza le vit. B6 e B12 Circa 1900 geni Esopolisaccaridi (EPS)

18 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Temperatura ottimale di sviluppo C Omofermentante Ossigeno indipendente Tollera ph < 5 Bacillo Gram + Produce ac. lattico in quantità > 1,5% Sintetizza ac. folico, niacina e vit. B6 Esopolisaccaridi (EPS)

19 Tecnologia di produzione Trattamento termico: C per 20 min, oppure 95 C per 5 min Effetti biochimici positivi (riduzione della carica microbica e denaturazione delle proteine del siero per facilitare l aggregazione caseinica)

20 Tecnologia di produzione Raffreddamento alla temperatura idonea ed inoculo con batteri lattici termofili (nell ordine dell 1-3% in modo da avere una carica iniziale di UFC/ml e in un rapporto di 1:1)

21 Tecnologia di produzione Fermentazione: 42 C per 3-6 ore direttamente nelle confezioni di vendita (yogurt a coagulo intero), oppure in fermentatore da cui poi lo yogurt viene prelevato per il confezionamento (yogurt a coagulo rotto)

22 Tecnologia di produzione Raffreddamento C (Questa operazione di raffreddamento è necessaria per rallentare le attività metaboliche dei batteri lattici e per iniziare la gelificazione del prodotto; e può essere condotta sia su yogurt a coagulo rotto sia su yogurt a coagulo compatto; si inizia quando il valore di ph è circa 4,6 e l acidità in SH/50 ml è di 20 22) Eventuali aggiunte di frutta succhi di frutta o estratti di frutta Confezionamento

23 Tecnologia di produzione Al termine del processo lo yogurt deve essere refrigerato a 4 C e conservato a tale temperatura fino al consumo; è un prodotto fresco, senza aggiunta di additivi (ad eccezione di quelli a base di frutta che possono contenere coloranti e conservanti) la cui durata è di circa 30 giorni Devono mantenersi vivi e vitali per tutto il periodo di conservazione e in numero minimo di 10 7 UFC/ml

24 Attività metaboliche dei batteri dello Yogurt Dopo l inoculo i batteri lattici convertono il latte in yogurt in un arco temporale di circa 3-4 ore La loro attività determinano numerose modifiche fisiche, chimiche, microbiologiche, nutrizionali e sensoriali del substrato di partenza Il catabolismo del lattosio, principale zucchero presente nel latte, porta alla formazione di acido lattico e di galattosio

25 Attività metaboliche dei batteri dello Yogurt Il lattosio viene portato all interno della cellula tramite specifiche permeasi Il lattosio è scisso in glucosio e galattosio per intervento dell enzima β- galattosidasi Il glucosio viene convertito ad acido piruvico secondo la via glicolitica mentre il galattosio viene rilasciato nel mezzo in quanto la maggior parte dei ceppi di S. thermophilus e di L. delbrueckii subsp. bulgaricus non sono in grado di utilizzarlo

26 Il lattosio viene portato all interno della cellula tramite specifiche permeasi Il lattosio è scisso in glucosio e galattosio per intervento dell enzima β- galattosidasi Il glucosio viene convertito ad acido piruvico secondo la via glicolitica mentre il galattosio viene rilasciato nel mezzo in quanto la maggior parte dei ceppi di S. thermophilus e di L. delbrueckii subsp. bulgaricus non sono in grado di utilizzarlo

27 S. thermophilus produce l isomero L(+) dell acido lattico L. delbrueckii subsp. bulgaricus produce principalmente l isomero D(-) dell acido lattico La quantità L(+) forma più digeribile dell acido lattico può variare dal 50 al 70% in funzione del rapporto tra cocchi e bacilli

28 S. thermophilus L. delbrueckii subsp. bulgaricus Sinergia

29 Sinergia o proto-cooperazione: S. thermophilus UREA ac. formico, CO 2 aa, peptidi a catena corta PROTEINE L. delbrueckii subsp. bulgaricus

30 S. thermophilus Composti elaborati da S. thermophilus quali acido formico (precursore di nucleotidi, la cui formazione è dovuta anche al trattamento termico che subisce il latte prima della fermentazione) e CO 2 e NH 3, prodotti dalla decarbossilazione dell urea ad opera dell ureasi (enzima presente solo in S. thermophilus tra i batteri lattici) L. delbrueckii subsp. bulgaricus Presenta una proteasi di parete, PrtB, che consente la degradazione della caseina in composti più semplici per soddisfare le esigenze azotate Pochi ceppi di S. thermophilus sono in grado di sintetizzare una proteasi extracellulare che agisce in maniera simile a PrtB

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32 Proprietà nutrizionali Lo yogurt è particolarmente indicato nei casi di intolleranza al lattosio che si riscontra in alcune persone (apporto di β-galattosidasi) L acido lattico ha un attività antinfettiva Lo yogurt contiene vitamine (A, B1,B2, B6, B12, C, D) e sali minerali (Ca, K, P, Na) Antibiosi da batteriocine Attività immunostimolante

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34 Kefir Latte fermentato acido-alcolico originario dei Balcani, dell Europa Orientale e del Caucaso, contenente, oltre all acido lattico (1%), anidride carbonica e alcool (0,5-1%) Etimologia: kefir deriva da kef, ket che in turco significa piacevole, benessere Si ottiene utilizzando come innesto i caratteristici granuli, detti anche miglio del profeta

35 I granuli, di forma globosa e irregolare, di colore bianco o giallastro, sono costituiti da una matrice gommosa elastica di natura proteica e polisaccaridica (kefirano) In essa restano inglobati i m.o. che instaurano una forma di simbiosi molto stabile Le analisi dei granuli di Kefir hanno evidenziato che la sua microflora è composta da LAB, batteri acetici e lieviti che coesistono in una relazione simbiotica all interno del granulo

36 a) Batteri lattici: bacilli mesofili: Lactobacillus casei Lactobacillus brevis streptococchi mesofili: Lactococcus lactis subsp. lactis Leuconostoc mesenteroides subsp. lactis e subsp. cremoris b) Enterococchi: Enterococcus durans c) Lieviti: (10 8 /g si localizzano al centro del granulo di kefir) Saccharomyces delbrueckii Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces kefir Saccharomyces fragilis Torula lactis Torula ellipsoidea Torula kefir Kluyveromyces marxianus Candida pseudotropicalis var. lactosa d) Acetobatteri: (presenza granuli e bevanda /g e /ml) Acetobacter aceti e) Muffe Geotricum candidum (ossida l acido lattico ad anidride carbonica e acqua, produce enzimi proteolitici e lipolitici)

37 Saccharomyces delbrueckii e Saccharomyces cerevisiae, sono lieviti lattosio-negativi e stabiliscono un rapporto associativo mutualistico con i batteri lattici i quali, mettendo a disposizione galattosio, consentono ai lieviti di produrre alcool etilico I lieviti a loro volta sintetizzano riboflavina e altre vitamine che sono importanti per lo sviluppo dei batteri lattici

38 I principali prodotti della fermentazione nel Kefir sono l acido lattico, l etanolo (che può raggiungere i 2 g in 100 ml di prodotto) e CO 2 (che ne determina la caratteristica effervescenza) mentre i minori prodotti di fermentazione includono diacetile, acetaldeide, aa liberi e in alcuni casi acetato L associazione di questi m.o. promuove diverse interazioni metaboliche come la produzione di polisaccaridi da parte dei batteri lattici, la produzione di vitamina B 12 e l ossidazione dell acido lattico da parte dei batteri acetici

39 La complessa interzione tra lieviti e batteri nel Kefir e la loro interdipendenza non è stata ancora elucidata E stato evidenziato che quando i batteri sono separati dai lieviti non crescono efficientemente rispetto a quando sono in presenza dei lieviti Lieviti e Acetobacter spp. producono vitamine che stimolano la crescita dei LAB Debaryomyces hansenii e Yarrowia lipolytica assimilano l acido lattico formato dai LAB aumentando il ph e andando a stimolare l ulteriore crescita dei LAB

40 Durante la fermentazione del latte la sequenza che caratterizza lo sviluppo microbico è la seguente: L acido lattico che si accumula è quasi esclusivamente sotto la forma isomerica L(+) e ciò a differenza dello yogurt che è L(+) D(-) ove si accumulano in parti circa uguali. È da sottolineare che l isomero D(-), assunto in certe quantità, può provocare disturbi al consumatore Una significativa differenza del kefir rispetto allo yogurt è che non contiene galattosio

41 Lactococcus lactis subsp. lactis e subsp. cremoris - sistema lattosio fosfotransferasi Lactobacillus paracasei e Lactobacillus acidophilus - permeasi - sistema lattosio fosfotransferasi

42 Lactobacillus paracasei Lactobacillus acidophilus

43 Lactococcus lactis subsp. lactis e subsp. cremoris sistema lattosio fosfotransferasi

44 Il trasporto del lattosio a livello di membrana cellulare può prevedere o meno la fosforilazione dello zucchero Dopo l idrolisi del disaccaride la fermentazione prosegue come nel caso dei monosaccaridi

45 Tecnologia di produzione La preparazione dei granuli di kefir si realizza nei paesi di origine aggiungendo al latte fresco contenuto in masselli di legno pezzi di stomaco di agnello o montone Il latte viene continuamente agitato fino alla formazione del coagulo dopo ulteriore agitazione il coagulo viene rimosso e sostituito con altro latte L operazione viene eseguita più volte fino a quando nella parete del recipiente si forma una crosta che viene asportata ed essiccata al sole: i frammenti ottenuti costituiscono i granuli di kefir

46 Tecnologia di produzione La fabbricazione del kefir è abbastanza particolare e complessa e il risultato varia in funzione della stabilità dei granuli, della quantità dell innesto, del latte (tipo, qualità, trattamenti), della temperatura e durata della fermentazione, del tipo di tecnologia (familiare, industriale)

47 Tecnologia di produzione Il latte viene omogeneizzato, trattato termicamente (95 C per 5 min) in modo da determinare la denaturazione della proteine del siero, che favorisce l aumento della viscosità del prodotto, e inoculato con circa 20 g/l di granuli Il latte viene incubato alla temperatura di C per ore fino ad ottenere la massima stabilità del coagulo (ph 4,5 circa) I granuli vengono recuperati per filtrazione o setacciatura, lavati asciugati e/o liofilizzati e conservati a 4 C

48 Tecnologia di produzione

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51 Gioddu Latte fermentato acido-alcolico prodotto in Sardegna con latte di pecora o di capra Presenta una colorazione biancastra e una consistenza densa e cremosa Può essere considerato l unico latte fermentato di origine italiana Non può essere commercializzato per l impossibilità di CONSERVARLO PER LUNGO TEMPO

52 Gioddu Zone di produzione del Gioddu artigianale In Gallura è conosciuto con il nome di Miciuratu, nel Sassarese Mizzuraddu, nella Baronia Latte Ischitu e nella Barbagia come Junchetta

53 Studi microbiologici Grixoni, 1905 : Simbiosi tra Saccharomyces sardus e Bacillus sardus responsabili della fermentazione Samarani, 1907 : Presenza lattobacilli, streptococchi e lieviti ma in numero piuttosto scarso Bianco, 1912 : Diplococcus sardus miciurati e Bacterium sardum miciurati responsabili della fermentazione; lieviti presenti solo in gioddu molto giovane Verona e Attolini, 1932 : Lactobacillus bulgaricus come agente fermentatore. Lieviti presenti anche in gioddu eccessivamente acido (genere Saccharomyces e Candida) Arrizza et al., 1983 : Microflora eterogenea (Lactobacillus delbrueckii bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Streptococcus faecium, Lactococcus lactis); i lieviti non sono stati ricercati Deiana et al., 1991 : Microflora eterogenea (Str. thermophilus, Str. fecalis, Str. faecium, Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris, Lb. delbrueckii bulgaricus, Lb. casei casei, Lb. casei rhamnosus, Lb. fermentum, L. mesenteroides mesenteroides, L. mesenteroides dextranicum, L. lactis, Pediococcus sp., Micrococcus sp.); lieviti (S. cerevisiae, K. marxianus subsp. bulgaricus, H. anomala, D. hansenii, C. valida, C. famata)

54 Lieviti: Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces marxianus subsp. bulgaricus Batteri lattici: Streptococcus termophilus Lactococcus lactis subsp. Lactis e subsp cremonis Lactobacillus paracasei Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus plantarum Lactobacillus fermentum Lactobacillus delbruechii subsp. lactis Enterococchi: Enterococcus faecalis Enterococcus faecium

55 Tecnologia di produzione La preparazione tradizionale prevedeva le seguenti fasi: un litro di latte messo in un recipiente di metallo o di sughero e riscaldato a C. Per riscaldarlo, molto spesso si adoperavano ciottoli arroventati al fuoco. Successivamente veniva aggiunto al latte del lattice di fico (2-3 gocce) o frammentarzu (coltura-madre conservata come piccolo impasto panario) (0,1% circa) o frammentarzu + lattice di fico o briciole di pane (0,15% circa) o caglio di agnello o capretto (1% circa). A questo punto il recipiente veniva coperto con panni di lana e lasciato a temperatura ambiente per circa 8 ore fino ad ottenere un coagulo bianco omogeneo. In seguito venivano eseguiti normalmente tre passaggi su altro latte con una percentuale di inoculo di circa 1% ogni volta, prima di considerare il fermentato idoneo per costituire la coltura madre o madrighe

56 Tecnologia di produzione La coltura madre così ottenuta veniva impiegata per la preparazione del Gioddu destinata al consumo, applicando la seguente tecnologia: 1% circa di questa coltura veniva inoculata su latte di pecora o capra riscaldato a C. Al fine di assicurare un valore di temperatura sempre costante durante l incubazione, anticamente venivano usati recipienti di sughero. Oggi questa pratica è stata quasi del tutto abbandonata e il latte inoculato, contenuto in recipienti metallici avvolti in panni di lana, è posto a incubare a temperatura ambiente per circa 8 ore; a coagulazione avvenuta i recipienti venivano posti in ambiente fresco e dopo 24 ore il Gioddu era pronto per il consumo che avveniva normalmente entro 3-4 giorni dalla produzione

57 Altre ricerche hanno riguardato la selezione e la caratterizzazione tecnologica dei ceppi isolati nei Gioddu tradizionali idonei al consumo (Deiana et al., 1991). Le sperimentazioni condotte da Deiana hanno evidenziato inoltre la necessità di impiegare, accanto ai batteri lattici tipici, estratti enzimatici di lieviti al posto di Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, come microrganismo starter, per ottenere un Gioddu di tipo industriale, con caratteristiche organolettiche tipiche e una lunga shelf-life

58 Colture starter Le colture starter usate per i latti fermentati possono essere suddivise in due categorie: - Colture naturali, di origine artigianale - Colture selezionate o industriali

59 Attualmente per produrre alcuni tipi di latti fermentati acidoalcolici, sono ancora utilizzate le colture naturali, composte da una popolazione microbica complessa ed eterogenea formata da genere, specie e ceppi diversi Queste colture rispecchiano le caratteristiche ambientali delle zone dove vengono prodotte, sono tipiche e difficilmente ripetibili in altro luogo Tuttavia per raggiungere traguardi produttivi sicuri costanti e prevedibili attualmente è diffuso l impiego di colture starter selezionate costituite da colture pure di poche specie di ceppi (prevalentemente batteri lattici) preparate in laboratorio

60 Questi sono generalmente isolati a partire dalle colture naturali, selezionati sulla base di proprietà tecnologicamente importanti e usati come colture singole, in coppia o in miscela consentendo la produzione a livello industriale di latti fermentati con le caratteristiche desiderate In commercio sono disponibili colture lattiche selezionate in diversa forma fisica: liquida, congelata o liofilizzata. Particolarmente diffuse sono le colture congelate o liofilizzate che possono essere aggiunte direttamente nel latte Problemi nello sviluppo delle colture selezionate: - Presenza nel substrato di inibitori naturali (lisozima, ecc); - Infezione da batteriofagi

61 I requisiti per la selezione dei ceppi da usare come starter per lo yogurt e altri latti fermentati possono essere suddivisi in tre gruppi: - Requisiti di biosicurezza; - Requisiti di efficacia tecnologica; - Requisiti di convenienza Requisiti di biosicurezza le specie batteriche presenti nello yogurt e nei latti fermentati sono incluse nell elenco QPS (Presunzione Qualificata di Sicurezza) gestito dall EFSA (European Food Safety Autority) e quindi sono state valutate sicure per il consumatore (Importante la verifica dei ceppi con resistenza ad antibiotici e produttori di ammine biogene)

62 Caratteri tecnologici analizzati: - Grado di termofilia; - Capacità e velocità di acidificazione, che deve essere veloce ed intensa; - Produzione di composti organoletticamente attivi; - Produzione di EPS, importanti per la struttura e viscosità; - Produzione di metaboliti batteriocine-simili; - Sopravvivenza nello yogurt (vitalità); - Resistenza all autolisi (stabilità cellulare); - Resistenza ai batteriofagi Stabilità dei caratteri principali e compatibilità/sinergismo quando si usano ceppi in associazione

63 La selezione deve riguardare anche il grado di sopravvivenza agli stress che il processo industriale comporta (convenienza) - Elevata produzione di biomassa cellulare in funzione di un substrato nutritivo semplice; - Facilità di concentrazione delle cellule; - Buona sopravvivenza durante i processi tecnologici di produzione e durante la conservazione; - Rapida ripresa dell attività metabolica quando inoculato direttamente in latte

64 Proprietà nutrizionali dei latti fermentati Aumentata digeribilità delle proteine per l attività proteolitica dei m.o. Coagulazione fine della caseina Maggiore biodisponibilità e assorbimento di calcio e altri minerali Accelerazione nella produzione di succhi gastrici Produzione di aa essenziali e vitamine. In particolare il kefir e il Gioddu sono particolarmente ricchi in vitamine A, E, B 1,B 2 e B 6 Diminuzione delle reazioni allergiche verso le proteine native Adattabilità per persone intolleranti al lattosio per apporto di β- galattosidasi Azione antibiotica e neutralizzante delle enterotossine batteriche Attività probiotica e prevenzione delle malattie

65 La qualità e la sicurezza microbiologica dei latti fermentati viene valutata sia alla produzione che al consumo Il basso valore di ph raggiunto al termine della fermentazione (3,5-4,5) rende comunque questo tipo di alimenti poco soggetto allo sviluppo di m.o. patogeni quali Bacillaceae, Salmonella spp. e coliformi Un eventuale rischio è legato alla possibile contaminazione da Staphylococcus aureus, la cui presenza va quindi ricercata. Vanno ricercati anche lieviti (Candida, Klyveromyces, Rhodotorula, Saccharomyces) e muffe (Aspergillus, Cladosporium, Geothricum, Mucor e Penicillium), in grado di crescere a valori acidi di ph e in presenza di lattosio e saccarosio, soprattutto nei prodotti dove viene addizionata la frutta

66 I requisiti microbiologici relativi alla normativa Europea (Regolamento 2073/2005) e ai criteri FIL-IDF (Doc.28/10/1992) sono i seguenti: coliformi totali inferiori a 10 UFC/g muffe inferiori a 10 2 UFC/g Salmonella assente in 25 g Listeria monocytogenes inferiore a 10 2 UFC/ml Staphylococcus aureus assente in 1 g I batteri lattici vitali devono essere compresi tra UFC/g alla produzione mentre ogni specie presente deve essere maggiore di 10 7 UFC/g alla vendita Requisiti chimico-fisici: ph 3,5-4,5 Acidità 0,6-0,7% acido lattico in peso Grasso superiore al 3% per yogurt intero, non superiore a 1% per quello magro Gli ingredienti alimentari aggiunti non devono superare il limite del 30% nel prodotto La conservazione deve essere effettuata a 4 C fino al consumo

67 PROBIOTICI Durante tutta la vita l uomo è in stretto contatto e interagisce con i m.o. che lo circondano In particolare, il tratto gastrointestinale ospita un numero elevatissimo di batteri (10 14 cellule con 500 specie diverse) tale da superare di 10 volte il numero delle cellule che compongono il corpo umano

68 Enzimi della saliva Acido cloridrico e enzimi Sali di bile dell intestino tenue

69 Il microbiota intestinale (termine che ha ormai sostituito la vecchia denominazione microflora ) è un ecosistema formato da una pluralità di nicchie ecologiche, che ospitano una popolazione batterica formata da numerosissime specie e da un innumerevole quantità di ceppi È a stretto contatto con la mucosa intestinale, o interfaccia epiteliale, che costituisce, dopo quella respiratoria, la più grande superficie libera del nostro organismo, essendo pari a circa m 2 Il microbiota e la mucosa, insieme al muco, formano la cosiddetta barriera mucosa, importante sistema di difesa nei confronti dei fattori potenzialmente immunogenici o patogeni presenti nel lume

70 Il microbiota di ogni individuo ha una sua specifica impronta digitale batterica, cioè un profilo di specie suo proprio, diverso da quello di altri individui; esiste tuttavia un core di almeno 57 specie batteriche che può essere considerato comune a tutti Il microbiota dell intestino umano è oggi oggetto di ricerche condotte con tecniche molto avanzate, che comprendono anche lo studio del genoma batterico (microbioma). Due grandi progetti, basati sul sequenziamento sistematico del DNA del microbiota, sono al momento in corso: lo Human Microbiome Project (HMP), negli USA, e il Metagenomics of Human Intestine (metahit), in corso in Europa

71 Di quest ultimo è stato pubblicato un primo report, che conferma la presenza, nel microbiota stesso, di una grande varietà di specie batteriche: oltre nei 124 individui campionati, e circa 160 per ogni individuo studiato Un risultato sorprendente dell analisi meta-genomica è quello che vede tuttavia il 15% delle sequenze determinate codificare per funzioni non note o indefinite, lasciando cosi chiaramente intendere che la reale comprensione del ruolo svolto dalla biomassa batterica intestinale richiederà ancora molti anni di ricerca e analisi

72 Analisi dei lattobacilli isolati da campioni fecali animali

73 Analisi dei lattobacilli isolati da campioni fecali umani

74 Analisi del genoma dei batteri intestinali (MICROBIOMA) Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus casei sono specie dominanti nelle feci di bambini lattanti, Lactobacillus reuteri e Lactobacillus gasseri sono dominanti nelle feci di adulti; Lactobacillus ruminis è un componente regolare. Bifidobacterium adolescentis e Bifidobacterium catenulatum appaiono molto comuni negli adulti, mentre Bifidobacterium breve e Bifidobacterium infantis sono dominanti nelle feci dei bambini

75 Ruolo del microbiota intestinale Questi microrganismi giocano un ruolo di rilievo, anche attraverso le loro attività metaboliche, nell utilizzazione dei nutrienti assunti con gli alimenti; essi influenzano inoltre in modo significativo anche lo sviluppo ed il funzionamento del sistema immune, e di altre funzioni dell organismo umano

76 Le principali funzioni del microbiota, ad oggi note, dotate di un effetto favorevole per l ospite sono le seguenti: partecipazione alla formazione della barriera intestinale resistenza alla colonizzazione produzione di acidi grassi a catena corta (SCFA) produzione di vitamine: specie del gruppo B e K interazioni con il sistema immunitario di mucosa degradazione di xenobiotici (grazie a geni in grado di sintetizzare enzimi ad attività catabolica verso questi composti)

77 Elie Metchnikoff ( ) vincitore del premio Nobel nel 1908 per aver scoperto la fagocitosi, durante i suoi studi osservò che la vita dei pastori bulgari che bevevano latte acido era più longeva Così decise di analizzare al microscopio campioni di latte acido proveniente dalla Bulgaria e osservò la presenza in essi di un bacillo che denominò Lactobacillus bulgaricus Ipotizzò così che alcuni batteri intestinali producessero tossine responsabili di un invecchiamento precoce le quali potevano essere neutralizzate da sostanze prodotte da tale Lattobacillo

78 Metchnikoff diede così origine al concetto di PROBIOTICO, ossia un supplemento microbico vitale che influenza beneficamente la salute attraverso il miglioramento dell equilibrio microbico intestinale Ceppo ATCC 521 one of Matchnikoff s original strains inizialmente classificato come L. bulgaricus e poi come L. helveticus

79 Il termine Probiotico nasce circa negli anni 60 a indicare delle sostanze capaci di favorire lo sviluppo di batteri Il termine ha assunto nel corso di oltre mezzo secolo di storia, significati diversi, spostando l accento dalle sostanze ai m.o. E aggiungendo poi in concetto di adeguata quantità Si è arrivati ad una stabilizzazione della definizione in cui i punti chiave sono: la quantità dei batteri da somministrare la loro vitalità la capacità di conferire un misurabile effetto benefico

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81 Nella definizione FAO/WHO di probiotico oggi utilizzata, non solo il ambito scientifico ma anche in quello normativo, non si fa cenno all origine umana del ceppo microbico Viene precisato che è l azione svolta a essere importante e non l origine ecologica In Italia il Ministero della salute ha definito i probiotici microrganismi che si dimostrano in grado, una volta ingeriti in adeguate quantità, di esercitare funzioni benefiche per l organismo

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85 PROBIOTICI

86 L effetto probiotico è una caratteristica a livello di CEPPO

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89 Selezione e caratterizzazione dei ceppi probiotici I ceppi probiotici si differenziano da altri ceppi batterici anche della stessa specie per alcune caratteristiche: Capacità di sopravvivere al passaggio nel tratto gastrointestinale Capacità di moltiplicarsi nell intestino (mediata dalla resistenza ai succhi gastrici e alla bile) Capacità di esercitare un effetto benefico misurabile e significativo alla salute

90 Capacità di resistere alle condizioni acide dello stomaco e ai Sali di bile intestinali (la tradizione è di utilizzare ceppi di origine intestinale assumendo una loro naturale resistenza alle condizioni di quell ambiente ma ceppi provenienti da altri ecosistemi hanno dimostrato di essere capaci di sopravvivere e riprodursi nell intestino umano) Capacità di aderire agli epiteli intestinali (si testa in vitro con sistemi semplici in Piastre Petri contenenti muco intestinale o con sistemi complessi quali le linee cellulari intestinali) Sicurezza d uso dei ceppi l EFSA (Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare) ha elaborato una lista di specie QPS Qualifica presuntiva di Sicurezza la cui lunga storia d uso le classifica, sia pure su base presuntiva, come sicure. Ceppi appartenenti a queste specie sono considerati sicuri per l uso alimentare senza ulteriori controlli analitici se non la verifica dell assenza di determinanti genetiche per l antibiotico resistenza

91 Gli aspetti pratici più rilevanti della relazione tra probiotici ed ospite, da definire anche per permettere un uso razionale dei probiotici stessi in un ottica di miglioramento delle funzioni fisiologiche dell ospite, sono i seguenti: 1. importanza della somministrazione di batteri vivi; caratterizzazione funzionale ed identificazione dei batteri; 2. quantità di batteri da somministrare (in relazione al ceppo batterico impiegato, alla associazione con altri ceppi di una stessa o differente specie, alla matrice alimentare prescelta ed alla forma industriale di presentazione) e tecniche di conteggio degli stessi; 3. benefici per l ospite e loro definizione; 4. sicurezza d uso (anche alla luce dei due documenti FAO/WHO del 2001 e del 2002 e del concetto di QPS per le valutazione di sicurezza batterica, recentemente introdotto da parte di EFSA)

92 Selezione e caratterizzazione dei ceppi probiotici Generi microbici a cui appartengono i ceppi più frequentemente utilizzati a scopi probiotici: Bacillus (spore) Bifidobacterium Lactobacillus Streptococcus Saccharomyces Possibilità di produrre il ceppo in una forma compatibile con le esigenze di distribuzione commerciale

93 La bile è un potente inibitore dei ceppi utilizzati per i preparati probiotici ed appartenenti al genere Bacillus Tali risultati hanno portato ad ipotizzare che i presunti effetti probiotici di questi preparati siano imputabili alle spore e non alle cellule vegetative

94 Alcuni studi hanno esaminato l eventuale effetto protettivo durante il tratto gastrico di diverse matrici alimentari Un ceppo di Lactobacillus rhamnosus di è dimostrato più efficace nella colonizzazione dell intestino umano quando somministrato come ingrediente di un latte fermentato, mentre il latte non mostrava un particolare effetto di protezione sullo stesso ceppo

95 Studi di adesione mediante linee cellulari e mediante muco isolato da feci umane

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97 Selezione e caratterizzazione dei ceppi probiotici La valutazione delle proprietà tecnologiche dovrà quindi tener conto del prodotto finale a cui il ceppo è destinato per la commercializzazione e si articolerà in diversi passaggi: verifica della stabilità genetica verifica della producibilità su scala industriale verifica della compatibilità con altri ingredienti/componenti/eccepienti del prodotto finale verifica della shelf-life dell ingrediente attivo verifica della shelf-life del prodotto finito

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100 Valutazione d efficacia Nell allegato N.1 del documento del Ministero della Salute Linee Guida per la Valutazione dei probiotici e Prebiotici viene indicato un preciso schema da seguire: 1) la caratterizzazione tassonomica con deposito presso una collezione internazionale; 2) 3) 4) fino agli studi clinici in doppio cieco contro placebo, passando per la caratterizzazione funzionale in vitro e/o nel modello animale

101 Tabella 3. Cosa cercare in un etichetta di un prodotto probiotico

102 Ceppi probiotici e brevetti Condizione preliminare necessaria: deposito presso Collezioni internazionale con il riconoscimento di Autorità Internazionali di Deposito (IDA) Numero di riconoscimento e brevetto ad ogni ceppo depositato (non in quanto tali ma come prodotti finali) La proprietà di un ceppo può essere assicurata anche in assenza di brevetto, grazie alle procedure di deposito sicuro un deposito di ceppi presso le IDA fatto per assicurarsi i diritti di uso commerciale di un ceppo batterico

103 Ceppi probiotici e brevetti Oggi la maggior parte dei ceppi commerciali di probiotici è coperta da brevetto, ai fini della tutela della proprietà industriale e della ricerca che è stata sviluppata per l isolamento, la caratterizzazione e le dimostrazioni di efficacia del ceppo stesso

104 microrganismi probiotici che rispettano le linee Guida della FAO/WHO e le aziende che li hanno immessi sul mercato Lactobacillus casei Shirota (Yakult, Giappone); L. casei DN (Danone, Francia) Lactobacillus rhamnosus GG (Valio, Finlandia); L. rhamnosus HN001 (Danisco, Danimarca); L. rhamnosus and Lactobacillus reuteri DSM (Chr. Hansen, Danimarca) L. reuteri ATCC (BioGaia, Svezia) Lactobacillus plantarum 299V (Probi, Svezia) Lactobacillus acidophilus La5 (Chr. Hansen, Denmark) L. acidophilus L1 (Campina Melkunie, Olanda) Lactobacillus johnsonii La1 (Nestle, Svizzera) Lactobacillus gasseri OLL 2716 (Meiji Milk Products, Giappone). Saccharomyces cerevisiae boulardii lyo (Biocodex, Francia) B. animalis/lactis DN (Danone, Francia) Bifidobacterium longum BL1 (Morinaga, Giappone) Bifobacterium infantis (Ardeypharm,Germania) Fonte: Selecting, testing and understanding probiotic microorganisms di G.Reid et al. FEMS Immunol Med Microbiol 46 (2006)