Replicazione del DNA

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1 Replicazione del DNA

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3 La chimica della sintesi del DNA DNA polimerasi III La forca replicativa La fase di inizio della replicazione Selezione delle origini replicative La terminazione della replicazione

4 1953: resoluzione della struttura molecolare del DNA (J. Watson & F. Crick) 1956: la sintesi del DNA e eseguita dalle DNA polimerasi (A. Kornberg) 1958: la replicazione del DNA e semiconservativa (M. Meselsohn & F. Stahl)

5 Tre modelli proposti per la replicazione del DNA Prodotti della 1 o generazione

6 evidenze sperimentali gradiente di densita Meselson & Stahl, 1958

7 evidenze sperimentali DNA pesante DNA ibrido Meselson & Stahl, 1958 x2 DNA ibrido x2 DNA leggero (di nuova sintesi)

8 La doppia elica funge da stampo per la propria replicazione

9 La chimica della sintesi del DNA

10 I substrati necessari per la sintesi del DNA I deossinucleosidi trifosfato (dntp): Deossiadenosina 5 -trifosfato (datp) Deossiguanosina 5 -trifosfato (dgtp) Deossicitidina 5 -trifosfato (dctp) Deossitimidina 5 -trifosfato dttp) Il complesso innesco:stampo (primer : template)

11 In 1956, Arthur Kornberg mostro che il ssdna serve da stampo per la sintesi di nuovi filamenti Scopri la DNA polimerasi I Arthur Kornberg, Premio Nobel, Fisiologia e Medicina 1959

12 Il meccanismo di sintesi del DNA 5 à 3 pirofosfatasi 2P à energia libera

13 La DNA polimerasi si lega al complesso innesco:stampo α-elica α-elica Il dominio palmo contiene gli elementi principali del sito catalitico foglietto-β

14 La DNA pol. utilizza un singolo sito attivo per catalizzare la sintesi del DNA sito di legame al dntp DNA polimerasi L incorporazione del dntp corretto e 10 4 volte piu rapida (selettivita cinetica)

15 dntp rntp La DNA polimerasi puo distinguere fra ribo- e deossinucleosidi trifosfati

16 Due ioni metallici (Mg 2+ ) si legano alla DNA polimerasi e fungono da catalizzatori della polimerizzazione

17 Il dominio dita facilita la catalisi α-elica α-elica foglietto-β

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19 Il dominio pollice non e direttamente coinvolto nella catalisi Il dominio pollice interagisce con il DNA neosintetizzato per (i) mantenere in corretta posizione l innesco nel sito catalitico, (ii) mantenere il complesso fra la DNA polimerasi ed il substrato (innesco / stampo) L associazione aumenta la capacita della DNA polimerasi di incorporare molti nucleotidi tutte le volte che si lega al complesso innesco / stampo

20 DNA polimerasi: enzima processivo Processivita = numero di dntp polimerizzati in un singolo evento di interazione con stampoinnesco Lega il complesso innesco:stampo (~1 sec) Lega il complesso innesco:stampo (~1 sec) Lo scivolamento dipende da interazioni tra il DNA e la DNA polimerasi (seq. indipendente) Non-processiva: 1 base/sec Processiva: >1000 basi/sec

21 Correzione di errori di sintesi DNA polimerase inserisce 1 dntp errato ogni 10 5 nucleotidi polimerizzati I sistemi di lettura degli errori 1) Esonucleasi* correttore di bozze (proofreading exonuclease): 1 errore ogni ) Meccanismi di riparazione (Mismatch repair): 1 errore ogni *esonucleasi, tagliano all estremita 3 OH *endonucleasi, tagliano all interno del filamento di DNA

22 Proofreading esonucleasi 3 à 5 correggono errori di sintesi Estremita 3 male appaiata riduce la velocita di catalisi e riduce l affinita della polimerasi per il complesso innesco : stampo Aumenta affinita del 3 per il sito esonucleasico dove il dntp errato viene rimosso la sintesi puo continuare L attivita esonucleasica puo solo correggere errori appena inseriti

23 Riassunto La sintesi del DNA procede 5 à 3 attraverso l estensione dell innesco per l aggiunta di nuovi dntp complementari al filamento stampo Nei batteri, la sintesi del DNA e catalizzata da DNA polimerasi III Il dominio a palmo della DNA pol. III contiene gli elementi principali del sito catalitico e un sistema di correzione delle bozze La DNA pol. III e in grado di distinguere il corretto dntp da aggiungere all innesco e di escludere i rntp

24 Replicazione del DNA La chimica della sintesi del DNA DNA polimerasi La forca replicativa La fase di inizio della replicazione Selezione delle origini replicativi La terminazione della replicazione

25 La forca replicativa (leading strand) (lagging strand)

26 RNA primer u u rntp Primasi (RNA polimerasi)

27 Rimozione dell innesco dal DNA neosintetizzato H=hybrid (ibrido RNA:DNA) rimuove l RNA primer rimuove il rntp finale I riempie il gap nick +ATP salda il nick

28 La DNA elicasi apre la doppia elica davanti alla forca replicativa Catalizza l idrolisi di ATP à despiralizza il DNA rompendo i legami idrogeno tra le coppie di basi leading strand lagging strand

29 Le DNA elicasi procariotiche ATP elicasi del batteriofago T7

30 DNA elicasi: enzimi processivi che aprono la doppia elica >1000 coppie di basi / sec)

31 (forcina)

32 Le SSB stabilizzano i singoli filamenti di DNA SSB=single stranded binding protein

33 La pinza scorrevole (sliding clamp) aumenta la processivita della DNA polimerasi RNA primer E. coli E. coli umano

34 Ciclo di caricamento e scaricamento della DNA pol e della pinza sul filamento ritardato

35 Le proteine che agiscono al livello della forca replicativa (replisoma)

36 DNA Pol III oloenzima Centri catalitici: - Pol III core, sintesi del DNA - caricatore della pinza; proteina τ complesso γ, proteina δ

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40 A valle della forca replicativa si formano dei superavvolgimenti positivi DNA rilassato = privo di superavvolgimenti DNA superavvolto

41 Il problema di avvolgimento che si verifica durante la replicazione del DNA leading strand lagging strand Ogni ~10 bp replicati = 1 giro dell elica parentale Replicazione di 500 bp / sec = 50 giri / sec

42 Caratteristiche delle topoisomerasi Tipo I Rilassa il DNA superavvolto positivamente o negativamente, taglia un singolo filamento della doppia elica, non richiede ATP Tipo II Rilassa il DNA superavvolto (pos. o neg.), si lega e taglia ambedue i filamenti della doppia elica, richiede ATP. Per entrambi i tipi: Tagliare e risaldare i filamenti a livello dei legami fosfodiesteri Creano un interruzione temporanea che permette lo svolgimento (o avvolgimento) della doppia elica. Ruolo chiave in molti processi cellulari; replicazione del DNA, trascrizione, ricombinazione.

43 Meccanismo di azione della Topoisomerasi I Idrolisi del legame fosfodiestere Formazione del legame fosfotirosina

44 Rotazione = riduzione delle tensioni torsionali Ripristinato il legame fosfodiestere Risultato: la replicazione puo avvenire con la rotazione di un breve tratto di elica - la parte proprio davanti alla forca rep.

45 Nei procarioti, il cromosoma circolare e topologicamente definito perche non puo ruotare

46 Le topoisomerasi sono bersagli di alcuni farmaci anti-cancro I farmaci diretti contro la topoisomerasi II sono usati in circa meta di tutti regimi chemioterapeutici Agiscono come inibitori dell attivita catalitica o come veleni (bloccano il ripristino della doppia elica) Sono diretti preferenzialmente verso le cellule maligne perche esse crescono rapidamente e contengono livelli alti di topoisomerasi rispetto alle cellule normali I farmaci colpiscono anche cellule normali che crescono rapidamente (es. globuli bianchi, cellule epiteliali del tratto gastrointestinale, follicoli piliferi)

47 Replicazione del DNA La chimica della sintesi del DNA DNA polimerasi La forca replicativa La fase di inizio della replicazione Selezione delle origini replicative La terminazione della replicazione

48 L inizio di replicazione nei procarioti (oric o replicatore) La replicazione inizia quando una proteina detta iniziatore (DnaA) si lega al oric in modo sequenza specifica coppie di basi / sec topoisomerasi II E. coli: 4,6 x 10 6 coppie di basi (40 min)

49 Struttura del replicatore (oric) di E. coli sito dove inizia l apertura del DNA (iniziatore) (ricca di AT, facile da aprire) sito dove inizia la replicazione

50 Modello dell inizio della replicazione DnaA: iniziatore che riconosce specifiche sequenze di oric, apre il DNA ~20 bp HU: proteina basica che lega il DNA DnaC: posizionatore dell elicasi DnaB DnaB: elicasi, despiralizza il DNA Funzioni chiave della proteina iniziatrice - legarsi al DNA in modo seq. specifico (oric) - separare i 2 filamenti parentali (~20 bp) - reclutare altre proteine adibite alla replicazione 20 bp

51 L inizio della replicazione e altamente regolato per inibire un inizio ripetuto metiltransferasi dam metiltransferasi dam SeqA ~10 min metiltransferasi dam: aggiunge un gruppo metilico alla A che fa parte della seq. GATC. Normalmente tutte le GATC presenti nel genoma sono metilate SeqA: -riconosce DNA emimetilato in prossimita di oric e previene l associazione della DnaA (iniziatore) su oric e l inizio inappropriato di un nuovo ciclo replicativo

52 L inizio della replicazione negli eucarioti

53 Gli eucarioti replicano e segregano i loro cromosomi in fasi diversi del ciclo cellulare G1: Trascrizione dei geni e sintesi delle proteine S: Replicazione del DNA nucleare G2: sintesi delle proteine dell apparato mitotico (istoni) M: Divisione nucleare (separazione dei cromosomi) e cellulare

54 I cromosomi eucariotici contengono molte origini di replicazione cromosoma con 5 replicatori l attivazione del replicatore parentale determina il blocco dell attivazione dei replicatori sulle molecole di neosintesi fino al ciclo cellulare successivo non tutte le potenziali origini vengono utilizzate

55 La selezione delle origini di replicazione Come fanno le cellule eucariotiche a controllare migliaia di origini di replicazione? - formazione di un complesso pre-replicativo (fase G 1 ) - attivazione dell origine di replicazione (fase S) La successione temporale di questi eventi assicura che ciascun cromosoma venga replicato soltanto una volta durante ciascun ciclo cellulare

56 Formazione del complesso pre-replicativo L iniziatore (ORC) riconosce il replicatore (seq. specifico) ORC = complesso di riconoscimento dell origine ORC recluta due posizionatori dell elicasi, Cdc6 e Cdt1, e l elicasi Mcm2-7 Procar. : Eucar. DnaA: ORC DnaC: Cdc6/Cdt1 DnaB: Mcm2-7 Un complesso Pre-RC si assembla su ciascun replicatore durante la fase G 1, ma rimane inattivo fino a quando la cellula entra in fase S Complesso Pre-RC inattivo

57 Attivazione della replicazione avviene nella fase S ed e regolato dalle chinasi dipendenti da ciclina (Cdk) attivazione di Cdk separazione dei filamenti dell origine reclutamento delle polimerasi inattivazione di Cdk

58 Replicazione del DNA La chimica della sintesi del DNA DNA polimerasi La forca replicativa La fase di inizio della replicazione Selezione delle origini replicative La terminazione della replicazione

59 La terminazione della replicazione cromosoma circolare procariotico cromosoma lineare eucariotico

60 Terminazione della replicazione del cromosoma circolare dei procarioti le proteine che lavorano alla forca replicativa replicano l intera molecola di DNA dopo la replicazione le molecole figlie rimangono concatenate la topoisomerasi II separa i due cromosomi neosintetizzati che vengono segregati in cellule diverse

61 Terminazione della replicazione dei cromosomi lineari eucariotici ssdna non replicato direzione di replicazione leading strand ultimo RNA primer lagging strand ssdna non replicato Il problema della replicazione dei terminali dei cromosomi lineari Una volta rimosso il primer, rimane una corta regione di ssdna non replicata. Se non fosse risolto, questo problema porterebbe ad una perdita di materiale genetico di generazione in generazione

62 I telomeri Costituiti da ripetizioni in tandem di seq. ricche di guanina, nell uomo: TTAGGG Sigillano le estremita dei cromosomi impedendo ai cromosomi di legarsi insieme. L eventuale perdita dei telomeri porta alla fusione dei cromosomi e conseguente morte cellulare struttura ad ansa

63 TTAGGG

64 Telomerasi parte proteica regione telomerico del filamento parentale RNA stampo endogeno La telomerasi allunga il terminale 3 del filamento parentale usando la sua attivita di trascrittasi inversa per sintetizzare DNA complementare all estremita 5 dell RNA stampo estensione del telomero

65 Il problema della replicazione dei terminali dei cromosomi lineari La parte allungata al 3 puo funzionare per la sintesi di un frammento di Okazaki

66 Modello della regolazione dell attivita della telomerasi TRF1: TTAGGG repeat factor 1 POT1: protezione dei telomeri 1 Quando il telomero e lungo abbastanza, i livelli di POT1 sull estremita 3 sono alti, il che impedisce l accesso della telomerasi ai telomeri à attivita telomerasica viene bloccata Quando il telomero e ancora troppo corto, i livelli di POT1 sull estremita 3 sono bassi e la telomerasi si lega all estremita 3 e estende il telomero

67 La sporgenza 3 si ripiega in una struttura ad ansa mediante l invasione del ssdna all interno del doppio filamento. Poiche la telomerasi ha bisogno di un estremita 3, la sua attivita e bloccata dalla struttura ad ansa

68 Senza la telomerasi i cromosomi si accorciano ad ogni ciclo di replicazione, con conseguente e progressiva perdita di materiale genetico

69 Telomerasi, invecchiamento e cancro Tipo cellulare Lunghezza dei telomeri Attivita telomerasica Eucarioti unicellulari Mantenuta + Cellule germinali umane (spermatazoi, oociti) Cellule somatiche umane Cellule cancerose umane Mantenuta + Accorciamento progressivo ( nucleotidi / divisione) Mantenuta + - La maggior parte delle cellule somatiche umane non esprimono abbastanza telomerasi per mantenere una lunghezza costante dei telomeri duranti i cicli di replicazione dei cromosomi

70 L accorciamento dei telomeri: un orologio per l invecchiamento? Le cellule somatiche hanno una capacita limitata di divisione dovuta ad un accorciamento progressivo dei telomeri Un ulteriore accorciamento scatena uno stato irreversibile di senescenza in cui la cellula continua a vivere senza dividersi La correlazione fra senescenza cellulare e attivita telomerasica ha portato all ipotesi dell orologio molecolare La senescenza cellulare puo essere un meccanismo per proteggere gli organismi multicellulari dal cancro

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72 Assemblaggio dei nucleosomi dopo la replicazione La replicazione richiede il parziale disassemblaggio dei nucleosomi Dopo la replicazione il DNA e rapidamente riorganizzato in cromatina mediante una serie di eventi preordinati Negli eucarioti, la rapida compattazione del DNA e necessaria per il passaggio dalle fase S alle fasi G 2 -M (mitosi). Le informazioni immagazzinate nelle modificazioni istoniche sono trasferite alle molecole figlie

73 Modificazione delle code N-terminali degl istoni I numeri indicano la posizione di residui amminoacidici specifici (lisina, serina, arginina)

74 Modificazioni globali della cromatina Eucromatina: - 90% del genoma - decondensata in interfase - stato permissivo per trascrizione genica Eterocromatina: -10% del genoma - rimane condensata anche in interfase - conc. al centromero e ai telomeri - ospita pochi geni, trascrizionalmente inattiva

75 Modificazioni locali della cromatina

76 La composizione dei nucleosomi del filamento neosintetizzato? meta di nuova sintesi e meta vecchi istoni riciclati? come sono distribuiti? tutti di nuova sintesi? Che succede alle informazioni immagazzinate Nel codice istonico?

77 Ridistribuzione degli istoni dopo la replicazione del DNA I vecchi tetrameri H3-H4 vengono trasferiti casualmente ad entrambi i cromosomi figli. I tetrameri H3-H4 neosintetizzati formano la base di nucleosomi che non hanno ricevuto tetrameri vecchi I vecchi dimeri H2A- H2B vengono rilasciati nel pool solubile di istoni e si mescolano con quelli di neosintesi DISASSEMBLAGGIO (Fattori di rimodellamento della cromatina)

78 L assemblaggio dei nucleosomi richiede dei trasportatori di istoni PCNA recluta il trasportatore di istoni CAF-1 (H3.H4) NAP-1 trasporta i dimeri H2A.H2B

79 Le modificazioni istoniche parentali sono propagate ai cromosomi replicati Le modificazioni reclutano enzimi che determinano le stesse modificazioni dei nuovi istoni adiacenti

80 Sommario Durante la replicazione dei cromosomi i nucleosomi sono temporaneamente disassemblati. I tetrameri H3-H4 vengono casualmente distribuiti sui filamenti neosintetizzati. I dimeri H2A-H2B vengono rilasciati nel pool solubile di istoni e si mescolano con quelli di nuova sintesi. Statisticamente, ciascun filamento neosintetizzato riceve meta dei vecchi e meta dei nuovi istoni. Dopo la replicazione entrambi i cromosomi ereditano istoni modificati che possono funzionare da guida per la modificazione dei nuovi istoni adiacenti