Biocristallografia: le proteine in 3D. Marco Nardini Dip. Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università degli studi di Milano

Transcript

1 Biocristallografia: le proteine in 3D Marco Nardini Dip. Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università degli studi di Milano

2 Protein 3D structure settembre 2011 Milano

3 Biocristallografia metodologia sperimentale in grado di determinare la disposizione degli atomi di una macromolecola biologica presenti in un cristallo analizzando come i raggi X sono diffratti dal cristallo più precisamente, la biocristallografia a raggi X misura solo la densità elettronica all interno del cristallo, da cui le posizioni atomiche della macromolecola possono essere dedotte Scopo: determinazione della struttura 3D di macromolecole biologiche a risoluzione atomica (posizione x,y,z per ciascun atomo della macromolecola) Oggetto: sistema reale (non sistema modello) DNA, RNA, proteine e loro complessi (virus, ribosoma, ) proteine di piccole dimensioni contengono circa 1000 atomi, mentre proteine di grandi dimensioni possono essere costituite da atomi Ribosoma: atomi di proteina, atomi di RNA (>50000 atomi)

4 Struttura del Ribosoma settembre 2011 Milano

5 Applicazioni della Biocristallografia settembre 2011 Milano le strutture 3D delle macromolecole biologiche permettono di capire come avvengono i processi biologici e le interazioni a livello atomico (cioè come una particolare macromolecola esegue la sua funzione) determinazione di strutture non ancora note analisi di mobilità e variazioni conformazionali interazioni proteina-ligando e proteina-proteina (conformazione di legame biologicamente rilevante) studi di meccanismi enzimatici (complessi con cofattori, inibitori, prodotti, analoghi dello stato di transizione,...) drug-designrazionale applicazioni biotecnologiche

6 Passato, presente e futuro La prima struttura proteica determinata con metodi cristallografici è stata la mioglobina di capodoglio (1958) Wilkins Perutz Crick Watson Kendrew Premio Nobel per la Chimica 1962 a M. Perutz (emoglobina) e J. Kendrew (mioglobina) per i loro studi sulla struttura di proteine globulari

7 Passato, presente e futuro Natura elicoidale della struttura del DNA struttura ad elica (X) ripetitività di 3.4 Å (fra le basi) diffrattogramma ai raggi-x di fibre di DNA (immagine n 51, 1953)

8 Passato, presente e futuro ad oggi la biocristallografia a raggi X è la più prolifica disciplina nell area della biologia strutturale su strutture depositate nel PDB, (87.3%) sono strutture determinate mediante biocristallografia a raggi X Protein Data Bank:

9 Passato, presente e futuro 2010 genomica strutturale 2000 utilizzo della luce di sincrotrone 1990

10 Passato, presente e futuro Biologia strutturale determinazione di strutture 3D di specifiche proteine o gruppi di proteine Genomica strutturale determinazione di strutture 3D su scala genomica (genoma umano, di patogeni, ecc). al contrario della biologia strutturale classica, spesso la determinazione della struttura avviene prima della caratterizzazione funzionale della proteina determinazione della funzione sulla base della struttura determinazione di strutture 3D in modo high throughput clonaggio, espressione, purificazione, cristallizzazione, determinazione struttura 3D su larga scala (automazione, radiazione sincrotrone, ecc)

11 Biocristallografia a raggi X Perché i raggi X? l uso di radiazione elettromagnetica per visualizzare oggetti richiede che la radiazione abbia una lunghezza d onda paragonabile ai più piccoli dettagli che si vogliono risolvere R i+1 R n R i R i+2 raggi X ~10-10 m (1 Å) ~ distanza tra atomi di carbonio legati covalentemente

12 Biocristallografia a raggi X Perché i cristalli? un cristallo è formato da un enorme numero di molecole ( ) nella stessa orientazione, cosicché le onde diffratte si sommano in fase e rendono il segnale di diffrazione totale di intensità misurabile rispetto al rumore di fondo

13 Esperimento cristallografico 1) cristallizzazione 2) diffrazione

14 Esperimento cristallografico 3) calcolo densità elettronica 4) costruzione modello e suo raffinamento 5) validazione e deposizione delle coordinate atomiche del modello al Protein Data Bank

15 Cristalli proteici unità asimmetrica unità di cella volume 0.1 mm 3 periodicitàdel reticolo cristallino > 100 Å contenuto solvente 30% -80% v/v interazioni non covalenti; bassa stabilità meccanica (E stab. <10 kcal/mol) inferiore al G FOLDING

16 Cristallizzazione nucleazione: la soluzione è portata in condizione di supersaturazione (zona termodinamicalmente instabile) crescita: il grado di saturazione diminuisce (sovrasaturazione) cessazione della crescita: raggiungimento della curva di solubilità (equilibrio cristalli-soluzione) Variabili chimico-fisiche che influenzano la solubilità forza ionica ph temperatura costante dielettrica del solvente concentrazione macromolecola / concentrazione reagenti

17 Metodi di Cristallizzazione il metodo più utilizzato per la cristallizzazione di proteine è il metodo della diffusione di vapore (altri metodi: microdialisi e microbatch) proteina precipitante protein concentration supersaturation hanging drop (goccia sospesa) nucleation zone precipitation zone undersaturation crystal growth solubility curve sitting drop (goccia seduta) precipitant concentration

18 Cristallizzazione procedura empirica in cui una proteina viene lentamente fatta precipitare formando un precipitato cristallino (non amorfo) diminuzione della solubilità della proteina, cioè portare la soluzione proteica in condizioni di supersaturazione (nucleazione spontanea) screening

19 settembre 2011 Milano Automazione degli esperimenti di cristallizzazione

20 Consigli utili settembre 2011 Milano

21 Consigli utili settembre 2011 Milano

22 Crio-biocristallografia il cristallo viene rimosso dalla goccia di cristallizzazione usando un loop in fibra di nylon ed immerso velocemente in una soluzione crio-protettiva prima di essere raffreddato in azoto liquido (per limitare l effetto destabilizzante derivante dai radicali liberi prodotti dalla radiazione ionizzante) azoto liquido cristallo cryo-loop

23 Raccolta dati di diffrazione sincrotrone

24 Raccolta dati di diffrazione h = 2, k = 1, l = 0 h = 1, k = 3, l = 0 X-rays 2 I hkl 2d hkl sin = n (Bragg s equation) crystal detector durante una raccolta dati il cristallo di proteina viene ruotato in modo da portare in condizione di riflessione tutti i piani reticolari cristallini

25 Raccolta dati di diffrazione raggi X 2 I hkl cristallo detector h k l I eccetera...

26 Il problema della fase I hkl = k 3 F hkl 2 V cryst /V 2 cell il fattore di struttura F hkl èun vettore che rappresenta in modulo (F hkl ) e fase ( hkl ) l onda riflessa dalle famiglie di piani reticolari in condizioni di riflessione F hkl può essere espresso come somma degli N contributi dei singoli atomi j-esimi presenti nella cella cristallina proprietà strutturale (posizione) N atomi F hkl = f j exp [2 i (hx j + ky j + lz j )] = F hkl exp (i hkl ) j = 1 proprietà dell atomo il fattore di scattering atomico f j dipende dal numero di elettroni presenti nell atomo j non misurabile sperimentalmente Densità elettronica (x,y,z) = 1 V hkl F hkl exp (i hkl ) exp [-2 i(hx+ky+lz)]

27 Soluzione del problema della fase F hkl = f j exp [2 i (hx j + ky j + lz j )] = F hkl exp (i hkl ) (x,y,z) = N atomi j = 1 1 V hkl F hkl exp (i hkl ) exp [-2 i(hx+ky+lz)] a) metodo delle Sostituzioni Molecolari (Molecular Replacement) Prerequisito: proteina a struttura nota (depositata nel PDB) omologa in struttura/sequenza alla proteina cristallizzata a struttura da determinare modello si posiziona opportunamente il modello nel cristallo della proteina a struttura ignota dalle sue coordinate atomiche si calcolano i fattori di struttura F hkl calc N F hkl = f j exp [2 i(hx j + ky j + lz j )] = F hkl exp (i hkl ) j=1 oss oss I hkl = k 3 F hkl 2 V cryst /V 2 cell calc (x,y,z) = settembre 2011 Milano calc 1 oss calc ( F hkl exp (i hkl ) exp [-2 i(hx+ky+lz)] V hkl

28 Soluzione del problema della fase F hkl = f j exp [2 i (hx j + ky j + lz j )] = F hkl exp (i hkl ) (x,y,z) = N atomi j = 1 1 V hkl F hkl exp (i hkl ) exp [-2 i(hx+ky+lz)] b) metodo delle Sostituzioni Isomorfe (Atomi Pesanti) legame specifico alla proteina di atomi pesanti (Z molto superiore a quello di C, O, N, S). Tipicamente si usano Hg, Pt, U atomi pesanti cristallo nativo settembre 2011 Milano H cristallo derivato (I hkl ) P (I hkl ) PH

29 Soluzione del problema della fase i F PH = F P + F H F PH H F H F P, F PH (misurati sperimentalmente: I F 2 ) PH P F P F H, H (calcolati dalla posizione degli atomi pesanti) r ènecessarioavereisomorfismofrai cristalli nativi e quelli trattati con atomi pesanti identificazione posizione atomi pesanti nella cella cristallina calcolo fasi approssimate hkl calcolo di una densità elettronica iniziale (x,y,z) = 1 V hkl m = figura di merito 0 m 1 m [ F P hkl exp i P (best) hkl ] e -2 i(hx+ky+lz)

30 Costruzione del modello atomico settembre 2011 Milano catena principale (scheletro C ) catene laterali molecole solvente, ligandi, ecc. (x,y,z) = 1 V oss calc ( F hkl exp (i hkl ) exp [-2 i(hx+ky+lz)] hkl

31 Raffinamento cristallografico settembre 2011 Milano processo iterativo di aggiustamento delle coordinate degli atomi del modello molecolare in modo tale che ci sia il miglior accordo possibile tra i fattori di struttura calcolati a partire dal modello e quelli osservati sperimentalmente minimizzazione funzione C = Q +ku Q = w hkl ( F hkl,o F hkl,c ) 2 hkl i parametri stereochimici possono variare intorno ad un valore standard angoli di legame U = 1/2 k b,j (b j,c b j,o ) 2 + 1/2 k,j ( j,c j,o ) 2 + j lunghezza legami j k [1 + cos (n j )] + (Br -12 ) ij + (Ar -6 ) ij ] j angoli di torsione van der Waals ij

32 V(d) 1/d 12 V(d) B A = - d 12 d 6 1/d 6 d

33 Il procedimento biocristallografico settembre 2011 Milano Cristalli Diffrazione Fasi approssimate: Molecular Replacement Atomi Pesanti (x,y,z) Raffinamento Modello molecolare Validazione e PDB

34 Protein Data Bank file.pdb cella elementare e gruppo spaziale CRYST P ATOM 1 CB SER ATOM 2 OG SER ATOM 3 C SER ATOM 4 O SER ATOM 5 N SER ATOM 6 CA SER ATOM 7 N THR ATOM 8 CA THR ATOM 9 CB THR ATOM 10 OG1 THR ATOM 11 CG2 THR ATOM 12 C THR ATOM 13 O THR ATOM 2166 HOH WAT ATOM 2167 HOH WAT ATOM 2168 HOH WAT END catena laterale catena principale ligandi x y z occ B

35 Esempio: struttura della Protoglobina a 1.3 Å di risoluzione