METODICHE DI IMMUNOCHIMICA

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1 METODICHE DI IMMUNOCHIMICA

2 IMMUNOCHIMICA permette la determinazione quantitativa di proteine in tessuti e omogenati

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4 INTERAZIONI ANTIGENE-ANTICORPO L immunochimica si basa sulle interazioni antigene-anticorpo Idealmente, l anticorpo dovrebbe riconoscere l antigene che è stato usato per la sua produzione È tuttavia possibile che peptidi sintetici riescano a riprodurre le caratteristiche di un antigene, e questo può essere vantaggioso a fini sperimentali anticorpi molto specifici

5 ANTIGENE proveniente da animale A (es: topo) inoculazione animale B (es: coniglio) ANTICORPO attivo contro l antigene proveniente da animale A risposta immunitaria complesso antigene-anticorpo

6 ANTIGENE epitopo gli epitopi sono i siti dell antigene a cui si lega l anticorpo un antigene può contenere più di un epitopo

7 ANTICORPO POLICLONALE lega più di un epitopo ANTICORPO MONOCLONALE lega solo un epitopo alta standardizzazione, caratterizzazione, selettività e riproducibilità dei risultati applicazioni terapeutiche

8 TECNICA IBRIDOMA MULTIPLO l animale vivo produce anticorpi policlonali le cellule di ibridoma producono anticorpi monoclonali

9 splenociti cellule di mieloma formazione ibridi formazione ibridi colonie ibridomi (7gg) colonie ibridomi (10gg)

10 METODI IMMUNOCHIMICI ELISA (Enzyme-Linked Immunoassorbent Assay) Western blot Radioimmunotest Immunoistochimica

11 METODO ELISA determina la presenza di antigeni o anticorpi può essere qualitativo, semi-quantitativo o quantitativo a seconda di come viene svolto prevede delle curve di competizione a diversi valori di enzima (legato all anticorpo) per evidenziare l affinità antigene-anticorpo

12 METODO ELISA presenza antigene presenza anticorpi contro antigene

13 METODO ELISA un applicazione analoga dell ELISA è il dosaggio ormonale

14 IMMUNOBLOTTIG (WESTERN BLOTTING) metodica quantitativa che permette di identificare proteine mediante elettroforesi e reattività con anticorpi spesso è usato per confermare ELISA basato sulla migrazione elettroforetica delle proteine

15 PRINCIPI DI ELETTROFORESI Macromolecole cariche positivamente o negativamente (acidi nucleici e proteine) sono separate per mezzo di un campo elettrico. La velocità alla quale una molecola migra è: direttamente proporzionale al voltaggio applicato e alla carica elettrica della molecola inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola e alla viscosità della soluzione Matrici: AGAROSIO, POLIACRILAMMIDE

16 IMMUNOBLOTTIG (WESTERN BLOTTING) 1. Separazione delle proteine (caricate negativamente) sulla base del peso molecolare con gel elettroforesi 2. Trasferimento delle proteine separate dal gel ad una membrana di supporto elettroforetico (es:nitrocellulosa) 3. Immuno-rilevazione delle proteine di interesse con anticorpo

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18 ESEMPI DI WESTERN BLOT E APPLICAZIONI analisi proteine della famiglia bcl-2 analisi proteine in fluorescenza

19 ESEMPI DI WESTERN BLOT E APPLICAZIONI analisi recettori purinergici P2 proteine del cytomegalovirus il Western Blot non è utile solo come metodica per la ricerca di base, ma può essere impiegato come test per confermare la sieropositività a HIV e epatiti

20 RADIOIMMUNOTEST O DOSAGGIO RADIOIMMUNOLOGICO

21 RADIOIMMUNOTEST test quantitativo per dosaggi immunogenici che utilizza composti marcati test molto sensibile, preciso e riproducibile presenta costi significativi è applicabile ad analisi cliniche di vario tipo (ormoni, stupefacenti)

22 RADIOIMMUNOTEST ANTICORPO ANTIGENE MARCATO (*) ANTIGENE NON MARCATO competizione QUANTITA DI ANTIGENE NEL CAMPIONE

23 RADIOIMMUNOTEST 125 I CCK cpm max O + Ab CARBONE 1000 min BK no Ab CARBONE Ab CARBONE 900 CURVA 5 +Ab CARBONE 800 STANDARD 10 +Ab CARBONE 600 CCK 20 +Ab CARBONE Ab CARBONE 200 il carbone adsorbe il complesso antigene-anticorpo ad alto peso molecolare

24 CURVA DI CALIBRAZIONE sostanza non marcata = ridotta radioattività rilevata l utilizzo della curva di calibrazione permette di calcolare la concentrazione di un campione ignoto, confrontando i valori di radioattività rilevati

25 RADIOIMMUNOTEST

26 IMMUNOISTOCHIMICA metodo qualitativo con applicazioni quantitative valuta peptidi (es:enzimi) recettori canali ionici LOCALIZZAZIONE COESISTENZA TRACCIANTI trasportatori

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28 IMMUNOISTOCHIMICA -fissazione tessuto (in vivo) -post-fissazione tessuto (ex vivo) -taglio (criostato o vibratomo) -incubazione con anticorpo primario -incubazione con anticorpo secondario -visualizzazione della reazione -eventuale quantificazione dei risultati

29 STRUMENTI PER PERFUSIONE

30 STRUMENTI PER IMMUNOISTOCHIMICA CON FETTINE FLUTTUANTI

31 IMMUNOISTOCHIMICA tecniche dirette un solo anticorpo due livelli il marker si lega all anticorpo primario

32 IMMUNOISTOCHIMICA tecniche indirette più anticorpi più di due livelli il marker si lega all anticorpo secondario o terziario, se presente

33 IMMUNOISTOCHIMICA INDIRETTA CON LA TECNICA PAP l anticorpo primario lega la CAT (proteina bersaglio), gli anticorpi secondario e terziario servono per amplificare il segnale

34 IMMUNOISTOCHIMICA INDIRETTA CON LA TECNICA ABC sfrutta il reticolo di legami formato dalle proteine avidina e biotina con l anticorpo secondario che permette una notevole amplificazione del segnale -l avidina ha 4 siti di legame per la biotina e i suoi coniugati -numerose molecole di biotina possono reagire con una molecola di perossidasi e a loro volta interagire con l avidina -regolando il rapporto avidina/biotina si può formare un reticolo esteso con la perossidasi -è possibile regolare la sensibilità modificando il numero di molecole di perossidasi

35 ESEMPI DI COLORAZIONI IMMUNOISTOCHIMICHE neuroni dopaminergici positivi alla tirosina idrossilasi astroglia astroglia attivata in corso di neuroinfiammazione

36 ISTOCHIMICA traccianti anterogradi traccianti retrogradi può essere combinata all immunoistochimica

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