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1 GLICOSILAZIONE La glicosilazione è la modificazione PTM più diffusa. Circa il 50% delle proteine umane sono glicosilate Caratteristica di molte proteine della superficie cellulare e delle d proteine di secrezione Molte patologie sono associate con una difettosa formazione delle le glicoproteine La glicosilazione è una modifica estremamente eterogenea La presenza e la natura degli oligosaccaridi influenza il folding,, la stabilità,, il trasporto, l immuogenicitl immuogenicità,, le interazioni proteina- proteina, la segnalazione. La funzione di molte catene glicidiche in molte proteine è ancora sconosciuta

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3 GLICOPROTEINE Frazione Glucidica: Catene generalmente ramificate costituite da residui. Monosaccaridi più comuni: Mannosio, galattosio, glucosio, fucosio, N-acetilglucosamina, N- acetilgalattosamina, acido N-acetilneuraminico Si dividono in: N-glicosilate (su Asparagina) O-glicosilate (su Serina o Treonina. Raramente su Tirosina, idrossiprolina, idrossilisina) PROTEOGLICANI (sede peri- ed extra-cellulare) Frazione glucidica: altopolimeri eterosaccaridici lineari (P.M. molto elevato)

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5 PROTEINE N-GLICOSILATE Solo negli EUCARIOTI Sequenza consenso: Asn-Xaa-Ser/Thr Si formano nell ER Possono contenere diversi tipi di zuccheri (>30) Su un comune PENTASACCARIDE DI BASE si possono inserire diverse catene oligosaccaridiche con formazione di strutture bi-, tri- e tetra-antennali

6 Tipo I (alto contenuto mannosio): con oligosaccaridi costituiti da mannosio Tipo II (a struttura complessa): con oligosaccaridi contenenti N-acetilglucosamina, galattosio, acido sialico, (fucosio). Tipo III (di tipo ibrido): con oligosaccaridi costituiti da mannosio e con oligosaccaridi complessi

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8 PROTEINE O-GLICOSILATE Il legame fra le due porzioni si stabilisce fra un aminoacido idrossilato (serina o treonina; raramente tirosina, idrossiprolina, idrossilisina) ed un unità glicidica (di solito N-acetilgalattosamina. In alcuni casi galattosio). Al residuo di GalNAc sono legate altre unità saccaridiche con formazione di diverse strutture oligosaccaridiche ramificate e non.

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10 ANALISI DI GLICOPROTEINE Problemi connessi con l analisi l delle glicoproteine: Le glicoproteine hanno un comportamento anomalo nella maggior parte dei processi separativi Scarsa abbondanza di proteine modificate Molte proteine hanno siti multipli di glicosilazione Le parti glucidiche sono eterogenee e la loro analisi strutturale è estremamente complessa La presenza delle componenti glucidiche diminuisce significativamente amente l efficienza dell analisi MALDI ARRICCHIMENTO SPECIFICO DI GLICOPROTEINE: Cromatografia di affinità (glicani ac. M-aminofenilboronico-like; lectine ) Ossidazione con periodato/biotinilazione Estrazione in fase solida (SPEG) Frazionamento subcellulare

11 ISOLAMENTO DI GLICOPROTEINE MEDIANTE CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ PER SPECIFICI OLIGOSACARIDI

12 IDENTIFICAZIONE DELLE GLICOPROTEINE In fase preliminare le glicoproteine possono essere visualizzate su gel 2D-E o mediante Western Blot usando sistemi di colorazione (o sonde fluorescenti) o di rivelazione specifici. Uno dei sistemi di analisi più usato in WB prevede la derivatizzazione degli zuccheri con biotina modificata e il successivo riconoscimento con streptavidina coniugata con perossidasi o fosfatasi alcalina.

13 ESEMPIO DI STRATEGIA PER ESPERIMENTI DI GLICOPROTEOMICA Isolare le glicoproteine da lisati cellulari mediante cromatografia di affinità (es. lectine o biotina/avidina avidina) Frammentare le proteine selezionate, mediante proteolisi specifica (es. tripsina, SPV8 proteasi, Lys-C.) Analisi MS Rimozione delle catene glucidiche Frazionare Analizzare mediante MS sia la frazione glucidica che quella proteica

14 RIMOZIONE DELLE CATENE GLUCIDICHE: Rimozione chimica - β-eliminazione in ambiente alcalino (preferita per O-glicosilazioni) - Ossidazione con periodato - Trattamento con trifluorometansulfonato (distruzione completa) - Idrazinolisi (può danneggiare le proteine) Rimozione enzimatica - N-glicosidasi F (PNG-F), per N-glicosilazioni - Altre glicosidasi PER UN ANALISI COMPLETA DELLE GLICOPROTEINE, LE CATENE GLUCIDICHE DEVONO ESSERE SEQUENZIATE MASS SPECTROMETRY

15 L analisi della frazione glucidica viene effettuata mediante: Idrolisi acida: si identificano i vari monosaccaridi presenti Sequenziamento (usando esoglicosidasi e MS o MS/MS)

16 N-GLICOSILAZIONE: DIGESTIONE SPECIFICA DEGLI OLIGOSACCARIDI La PNGase F rompe il legame fra la frazione glucosidica e quella proteica (GlcNAc/Asn) Glucosidasi specifiche rompono selettivamente legami presenti nella componente oligosaccaridica

17 O-GLICOSILAZIONE: DIGESTIONE SPECIFICA DEGLI OLIGOSACCARIDI La O-glicosidasi rompe il legame fra la frazione glucosidica e quella proteica (GalNAc/Ser-Thr) Glucosidasi specifiche rompono selettivamente legami presenti nella componente oligosaccaridica

18 ANALISI MS PER INDIVIDUARE LA PRESENZA E (EVENTUALMENTE) IL TIPO DI OLIGOSACCARIDE

19 Il sequenziamento degli oligosaccaridi può essere fatto mediante MALDI-Tof su ioni selezionati o ESI-MS/MS.

20 ESPERIMENTI MS/MS PER IL SEQUENZIAMENTO DI OLIGOSACCARIDI Fattori che influenzano la frammentazione dei carboidrati: Tipo di ione Carica Energia depositato sullo ione Gli spettri di frammentazione in MALDI-MS possono essere prodotti attraverso: in-source decay fragmentation (ISD); post-source decay (PSD); collisional activation in a collision cell (CID). IONI A,B,C: La carica rimane sull estremità non riducente IONI X; Y; Z: La carica rimane sull estremità riducente

21 RIASSUMENDO:

22 ALTRE MODIFICAZIONI POSTTRADUZIONALI TECNICHE USATE per il loro studio: 2D SDS-PAGE 2 nd D MS MS n STRATEGIE di analisi: Rivelazione specifica Eliminazione della PTM (eventualmente seguita da labeling specifico) Analisi MS

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