Sistemi di regolazione. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 05/16

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1 Sistemi di regolazione

2 Importanza del controllo I componenti cellulari devono essere presenti nelle giuste concentrazioni. La composizione chimica dell ambiente che circonda la cellula è in contante cambiamento quindi la cellula deve essere in grado di rispondere efficacemente ai questi cambiamenti ambientali La regolazione è importante affinché la cellula conservi energia e materie prime e mantenga l equilibrio metabolico.

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4 La variazione di fase in Salmonella: un esempio di controllo a livello di DNA Il promotore H2 si trova in un segmento delimitato da sequenze ripetute e invertite. La ricombinazione tra queste sequenze determina un inversione del frammento di DNA. Adiacente ad H2 si trova un gene che codifica per un repressore del gene H1. Quando il segmento H2 viene invertito, non viene sintetizzato il repressore e quindi H1 può essere espresso.

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6 La regolazione dell attività enzimatica Inibizione dell attività enzimatica Modificazione degli enzimi

7 Inibizione da Feedback La velocità di molte vie metaboliche viene modulata attraverso il controllo dell attività degli enzimi regolatori. Ciascuna via ha almeno un enzima pacemaker (segnapasso) che catalizza la reazione più lenta, ovvero quella che limita la velocità della via stessa. Di solito questo enzima catalizza la prima reazione di una via metabolica. Quando il prodotto finale diventa troppo concentrato, l attività dell enzima viene inibita. Questo tipo di inibizione viene definita in vari modi: inibizione da feedback, inibizione da prodotto finale o retroinibizione. Il primo enzima di questa sequenza, quello che viene inibito dal prodotto finale, viene definito enzima allosterico.

8 Inibizione da Feedback

9 Effettore Allosterico

10 γ-glutamil chinasi Inibizione da N-acetil glutamato sintetasi feedback in una via biosintetica ramificata

11 Inibizione da feedback delle vie metaboliche che portano alla sintesi di amminoacidi aromatici 3-deossi-Darabinoeptulusonato 7-fosfato

12 Modificazione covalente degli enzimi Gli enzimi regolatori possono essere attivati e disattivati da modificazioni covalenti reversibili catalizzate da altri enzimi. Di solito, questo si verifica attraverso l aggiunta o la rimozione di un particolare gruppo chimico dando luogo a due forme enzimatiche, una attiva e una inattiva.

13 Regolazione della glutamina sintetasi mediante modificazioni covalenti

14 Regolazione dell espressione genica L espressione genica può essere controllata tramite la regolazione di: INIZIO DELLA TRASCRIZIONE STABILITA DEGLI mrna MATURAZIONE DEGLI mrna INIZIO DELLA TRADUZIONE STABILITA DELLE PROTEINE

15 Repressione degli enzimi Figura 8.10

16 Induzione degli enzimi Figura 8.11

17 Repressione Figure 8.12

18 Induzione regolata da un repressore Figura 8.13

19 Controllo positivo dell induzione Figura 8.14

20 Interazione degli attivatori con la RNA Polimerasi Figura 8.16

21 Organizzazione di un tipico promotore di lievito Sequenze che Sequenze che reprimono la attivano la trascrizione trascrizione URS UAS TATA I bp bp bp ORF

22 L espressione regolata dei geni di utilizzazione del galattosio nel lievito S. cerevisiae I componenti del sistema GAL80 GAL4 GAL7 GAL10 UAS Gal GAL1 trasferasi epimerasi chinasi

23 CH 2 OH HO H H OH H O H H OH OH D-Galattosio ATP ADP Galattochinasi (GAL1) D-Galattosio 1-fosfato UDP-glucosio Glucosio 1-fosfato Mg 2+ UDP-D-Galattosio Galattosio trasferasi (GAL7) UDP-D-Glucosio PP i UTP UDP Glucosio pirofosforilasi D-Glucosio 1-fosfato Fosfoglucomutasi D-Glucosio 6-fosfato Galattosio epimerasi (GAL10) UDP-D-Glucosio

24 La proteina Gal4 si lega alla UAS Gal In assenza di galattosio la proteina Gal80 si lega a Gal4 e ne impedisce la funzione di attivatore della trascrizione GAL7 GAL10 UAS Gal GAL1 Il galattosio si lega a Gal80 galattosio GAL7 GAL10 UAS Gal GAL1

25 Il cambiamento conformazionale induce l attivazione attivazione della trascrizione attivazione della trascrizione GAL7 GAL10 UAS Gal GAL1 trasferasi epimerasi chinasi

26 Le proteine espresse costitutivamente GAL80 e GAL4 regolano l espressione di diversi geni richiesti per la conversione del galattosio in glucosio-6-fosfato. Il prodotto del gene GAL4 lega la Upstream Activating Sequence (UAS-GAL). L attivazione di GAL4 è repressa da GAL80. In presenza di galattosio, è formato un prodotto metabolico che fa in modo che GAL80p si separa da GAL4p è quindi avviene l attivazione del gruppo dei geni GAL.

27 Natura modulare degli attivatori DNA binding domain: riconoscimento e legame a specifiche sequenze di DNA Multimerization domain: consente la formazione di omo o etero multimeri Activation domain: necessario per attivare l espressione del gene bersaglio I target sono ancora oggetto di studio fattori generali della trascrizione enzimi che modificano gli istoni complessi di rimodellamento della cromatina

28 Struttura modulare di GAL4 N legame attivazione al DNA dimerizzazione attivazione C sito di legame per Gal80

29 Esperimenti di domain swap mostrano che i domini sono intercambiabili Si può fondere il dominio di legame al DNA (DBD) di un fattore di trascrizione con il dominio attivatore di un altro fattore (AD) DBD di LexA (E. coli) AD di GAL4 (S. cerevisiae) Un gene bersaglio viene posto sotto il controllo del sito di legame al DNA del primo fattore Es. Se nel promotore del gene HIS3 è presente il sito di legame per LexA, la proteina fusa DBDLexA/ADGAL4 sarà in grado di attivare la trascrizione

30 Esperimenti di domain swap mostrano che i domini sono intercambiabili Il ceppo è auxotrofico per l istidina in quanto il gene HIS3 non è espresso La proteina di fusione si lega al sito operatore tramite le sequenze DBD di LexA e attiva la trascrizione grazie al sito AD di Gal4. Il gene HIS3 è espresso ed il ceppo può crescere in assenza di istidina terreno sintetico privo di istidina terreno sintetico privo di istidina HIS3 HIS3 sito di legame per LexA sito di legame per LexA DBDLexA ADGal4 Proteina di fusione tra i due domini

31 Principio del doppio ibrido Il ceppo è auxotrofico per l istidina in quanto il gene HIS3 non è espresso La trascrizione del gene HIS3 avviene solo se la proteina X interagisce con la proteina Y terreno sintetico privo di istidina terreno sintetico privo di istidina HIS3 HIS3 sito di legame per LexA sito di legame per LexA ADGal4 DBDLexA Proteina di fusione tra i DBDLexA e la proteina X Proteina di fusione tra i la proteina Y e ADGal4

32 Quorum sensing Regolazione dell espressione genica in risposta alla densità cellulare I lattoni acilati dell omoserina (AHL) sono molecole che possono essere prodotte e secrete da tutte le cellule in una data popolazione. Popolazioni ad alta densità cellulare avranno anche una maggiore concentrazione di AHL Le molecole di AHL attivano degli attivatori trascrizionali specifici che determinano l induzione della trascrizione di geni specifici.

33 In che modo la cellula sente i cambiamenti esterni?

34 Sistema a due componenti Stimolo Azzeramento sistema Cattura dello stimolo Sensore Trasduzione del segnale Regolatore operoni Proteine specifiche Proteina di membrana Proteina che lega il DNA

35 Sistema a due componenti

36 Sensore N-terminale: regione variabile per la percezione dello stimolo C-terminale regione conservata: diversi stimoli vengono trasmessi nello stesso modo. Qui si trova il dominio istidina fosfotransferasi membrana Regolatore OUT IN N-terminale: sede della fosforilazione di un residuo di acido aspartico C-terminale, sito di legame con il DNA: regione variabile che determina l appartenenza del regolatore ad una sottofamiglia

37 Regolazione delle porine di E. coli Le due porine più importanti della membrana esterna sono le proteine OmpF e OmpC. I pori generati da OmpC sono più piccoli e si formano quando il batterio cresce in condizioni di alta pressione osmotica (es. all interno dell uomo possono essere presenti i sali biliari, che sono tossici, perciò è preferibile avere pori piccoli I pori generati da OmpF sono più larghi e sono favoriti quando il batterio cresce in un ambiente diluito. I geni ompf e ompc sono parzialmente regolati da OmpR che reprime ompf ed attiva ompc. osmolarità OmpF>OmpC osmolarità OmpF<OmpC

38 Segnale osmolarità Regolatore contenente un residuo di acido aspartico EnvZ EnvZ P Asp OmpR Sensore contenente un dominio istidinchinasi che si autofosforila in condizioni di alta osmolarità P Asp P OmpR + P Asp OmpR ompc - ompf

39 OmpR media la regolazione della trascrizione dei geni OmpF e OmpC in maniera reciproca OmpR-P

40 Come viene regolato il legame di OmpR-P a questi siti dei promotori? OmpR fosforilato è una proteina che lega il DNA. OmpR-P ha un duplice ruolo in quanto può agire sia da attivatore che da repressore. Questa proprietà è molto diffusa tra i fattori di trascrizione. Quando la concentrazione di OmpR-P è bassa (bassa osmolarità), esso si lega a 2 siti ad alta affinità nel promotore di OmpF (F1 ed F2) e ne attiva la trascrizione. Quando la concentrazione di OmpR-P aumenta (alta osmolarità), esso può legare 3 siti a bassa affinità presenti nel promotore di OmpC (C1, C2 e C3) e attivare la trascrizione di questo gene. Contemporaneamente OmpR-P lega anche altri 2 siti nel promotore di OmpF (F3 e F4), creando una struttura che non consente la trascrizione.

41 OSMOREGOLAZIONE RISPOSTA ALLE CONCENTRAZIONI DI OSSIGENO CHEMIOTASSI REGOLAZIONE DELLA SPORULAZIONE Annu. Rev. Biochem :

42 Regolazione genica ad opera dell RNA antisenso: regolazione delle porine di E. coli Le due porine più importanti della membrana esterna sono le proteine OmpF e OmpC. I pori generati da OmpC sono più piccoli e si formano quando il batterio cresce in condizioni di alta pressione osmotica. I pori generati da OmpF sono più larghi e sono favoriti quando il batterio cresce in un ambiente diluito. I geni ompf e ompc sono parzialmente regolati da OmpR che reprime ompf ed attiva ompc. Inoltre, il gene micf produce un RNA antisenso che blocca l azione di ompf. L RNA micf è infatti complementare al sito d inizio della traduzione di ompf e ne reprime quindi la traduzione. Il gene micf viene attivato in condizioni di alta pressione osmotica (condizione che favorisce la presenza della proteina OmpC).

43 Regolazione delle porine OmpR geni mrna proteine OmpC + ompc 5 3 OmpF - ompf 5 3 X + micf 5 3 Alta pressione osmotica

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45 Canalizzazione metabolica La compartimentazione, ovvero la distribuzione differenziale di enzimi e metaboliti in strutture cellulari o in organelli differenti, è particolarmente importante nei microrganismi eucariotici. La compartimentazione consente che 1. Vie metaboliche simili funzionino e siano regolate in modo separato ma simultaneo 2. Si aumenti la concentrazione di un particolare substrato 3. Gli enzimi siano al posto giusto nel momento giusto (es. fattori di regolazione che vengono trasportati nel nucleo solo quando servono).

46 Modificazione covalente di un fattore seguita da compartimentazione nucleo stress MSN2 INATTIVO alte temperature basso ph alta osmolarità H 2 O 2 etanolo fase stazionaria MSN2 è un attivatore della trascrizione di geni importanti nella risposta allo stress cellulare. E sempre presente nella citoplasma della cellula (inattivo) e solo in presenza di stress viene traslocato nel nucleo, dove può attivare la trascrizione (forma attiva). La fosforilazione in più residui della proteina la converte in una forma trasportabile nel nucleo e quindi attiva. Questo processo è regolato dalla concentrazione di camp nella cellula nucleo MSN2 P P MSN2 ATTIVO