IL MICROSCOPIO OTTICO

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1 IL MICROSCOPIO OTTICO Il microscopio ottico assolve due importanti funzioni: 1. ingrandisce oggetti invisibili ad occhio nudo 2. permette di vedere separati due oggetti che ad occhio nudo appaiono uniti. Un uomo dotato di vista normale, per poter leggere una scritta deve porre gli occhi ad una distanza di almeno cm dal foglio. A tale distanza l'occhio è in grado di separare due punti distanti almeno 0,075-0,1 mm. Due punti più vicini vengono quindi visti come un unico punto. Questa distanza viene detta potere o limite risolutivo dell'occhio. Siccome le cellule degli organismi procarioti hanno dimensioni dell'ordine di 2 milionesimi di metro (2 micrometri) e le cellule eucariotiche hanno un diametro medio di micrometri, per studiarle è necessario uno strumento ottico che ci permetta di valutarne la morfologia: con un buon microscopio ottico che utilizzi la luce

2 bianca siamo in grado di discernere nitidamente oggetti con un diametro superiore a 0,2 micrometri. Quindi il potere di risoluzione del microscopio ottico è di 0,2 micrometri e non siamo in grado di osservare oggetti di grandezza minore. Con un adatto sistema di lenti si è in grado di ottenere ingrandimenti superiori a mille volte la dimensione reale dell'oggetto osservato. Risoluzione del microscopio ottico Il potere di risoluzione può essere espresso come: dove λ (lambda) è la lunghezza d'onda della luce incidente, n è l'indice di rifrazione del mezzo interposto tra obiettivo e vetrino ed α (alfa = angolo di apertura della lente) è il semiangolo del cono luminoso entrante. Il prodotto al denominatore viene detto apertura numerica (NA), è un numero adimensionale ed è un modo per esprimere l'angolo di apertura della lente dell'obiettivo senza utilizzare il grado sessagesimale. Schema raffigurante l'apertura numerica di un obiettivo Dalla formula si può osservare che modificando la lunghezza d'onda della luce utilizzata dal

3 microscopio ottico, si può aumentare o diminuire il limite della risoluzione; tuttavia questo sistema non è molto efficace dato che l'intervallo delle lunghezze d'onda del campo visibile è abbastanza ristretto. Un altro modo per modificare il limite di risoluzione consiste nell'utilizzare una goccia di olio da immersione come l'olio di cedro (n=1,515) da interporre tra preparato e obiettivo. Questo fluido, infatti, ha un indice di rifrazione più elevato di quello dell'aria. In questo modo aumentiamo il valore del denominatore, così che "d" diventa più piccolo; il microscopio ora riesce a risolvere due punti più vicini e l'immagine è quindi più nitida. Particolare degli obiettivi Gli obiettivi portano delle iscrizioni incise sulla loro superficie esterna. Sull'obiettivo a sinistra nell'ultima foto leggiamo: 40/0.65 N.A.160/ è il numero di ingrandimenti permesso dall'obiettivo, cioè 40 volte; 0,65 è l'apertura numerica (N.A.) di cui abbiamo parlato prima; 160 è la distanza, espressa in millimetri, che deve intercorrere tra questo obiettivo e l'oculare è lo spessore massimo, espresso in millimetri, che deve avere il vetrino copri oggetto. Per poter osservare un tessuto questo deve essere fissato, incluso in paraffina e sezionato. La fissazione permette di fermare tutti i processi catabolici perché i fissativi (formalina, Bouin...) cross-legano le proteine enzimatiche e impediscono la loro funzione. La inclusione in paraffina permette di fare sezioni del tessuto così sottili (con il microtomo) da garantire l'efficacia del potere di risoluzione del microscopio ottico. Per includere in paraffina è necessario incubare il pezzo da studiare in una serie di alcool crescente che sostituiscono gradatamente l'acqua dei tessuti e poi in solventi della paraffina (come lo xilolo) e, infine, nella paraffina liquida che sostituisce gli alcool. A questo punto, solidificando la paraffina, avremo il nostro pezzo biologico perfuso di paraffina solidificata che potrà essere sezionato con il microtomo. Alle sezioni, per essere colorate ed esaminate, dovrà essere sostituita, con un processo contrario a quello prima descritto, la paraffina con l'acqua. Si utilizza pertanto lo xilolo, che scioglie la paraffina, e si percorre una serie decrescente di alcol reintroducendo gradatamente l acqua.

4 EMATOSSILINA-EOSINA (EE) ALCUNE COLORAZIONI ISTOLOGICHE L ematossilina (colorante basico) colora le strutture acide di viola scuro o blu. I nuclei cellulari ed il reticolo endoplasmatico rugoso hanno ad esempio una grande affinità per questo colorante per via del loro rispettivo contenuto di DNA ed RNA. E necessario puntualizzare che il DNA attivo non è evidenziabile con l ematossilina, al contrario dell inattivo. Il DNA inattivo (colorabile) può presentarsi distribuito in piccole masse compatte, oppure in un disegno reticoliforme. Il DNA attivo è denominato eucromatina, l inattivo eterocromatina. A volte le cellule nervose hanno un nucleo completamente bianco (DNA molto attivo); viceversa i globuli rossi che stanno per perdere il nucleo, lo presentano fortemente colorato (quasi nero). La presenza di RNA può indurre una colorazione lavanda del citoplasma utilizzando il sistema EE. L eosina (colorante acido) colora le strutture basiche in rosa. Poiché la maggior parte delle proteine citoplasmatiche sono basiche, il citoplasma della cellula normalmente risulta essere di colore rosa. GIEMSA E una tecnica normalmente utilizzata per la colorazione di strisci di sangue o di midollo osseo. I nuclei delle cellule si colorano in blu-violetto, mentre il citoplasma appare blu pallido. I globuli rossi si presentano invece di colore rosa pallido. P.A.S. Questo metodo di colorazione istochimica mette in evidenza i polisaccaridi dei tessuti (es. glicogeno del fegato o del tessuto muscolare), la mucina prodotta dalle cellule caliciformi dell apparato gastro-intestinale e di quello respiratorio ed altre strutture, colorandoli di rosso intenso (tradizionalmente definito magenta ). Risultano P.A.S.-positive anche le membrane basali e l orletto striato dei tubuli renali e dell intestino, così come la cartilagine e, in una certa misura, il collagene. Le sezioni di tessuto vengono sottoposte all azione dell Acido Periodico (IO 4 H) che ossida alcuni radicali alcolici delle sostanze idrocarbonate formando radicali aldeidici. Le sezioni vengono successivamente trattate con il reattivo di Schiff che si lega ai radicali aldeidici formatisi colorandoli di rosso magenta.

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6 MITOSI Microtomo