ID4165/2007 PROGETTO R&S Enzimi per biocatalisi.

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1 DG Industria, Artigianato, Edilizia e Cooperazione SCHEDE TECNICHE INTERVENTI CONCLUSI ATI FLAMMA - FLAMMA Spa Chignolo d Isola (BG) - KTEDOGEN Srl Milano - INNOVATE BIOTECHNOLOGY Srl Vigevano (PV) - GNOSIS Spa Milano - POLITECNICO di MILANO - UNIVERSITÀ DEGLI STUDI di PAVIA ID4165/2007 PROGETTO R&S Enzimi per biocatalisi. AREA MD BIOTECNOLOGIE DURATA MESI 42 QUADRO ECONOMICO PREVISIONE INIZIALE ,00 COSTO FINALE ,12 INTERVENTO FINANZIARIO EROGATO ,86 DESCRIZIONE Il progetto Enzimi per Biocatalisi è stato promosso da 4 Aziende (Flamma SpA, Ktedogen Srl, Gnosis SpA e Innovate Biotechnologies Srl) e 2 Dipartimenti afferenti rispettivamente al Politecnico di Milano (Dipartimento di Chimica, Materiali e Ingegneria Chimica Giulio Natta ) e all Università di Pavia (Dipartimento di Chimica Farmaceutica, oggi Dipartimento di Scienze del Farmaco). Obiettivo generale del progetto è la preparazione ed ottimizzazione di catalizzatori enzimatici di origine non-animale da applicare alla sintesi e preparazione di intermedi di farmaci (ActivePharmaceuticalIngredients). La catalisi enzimatica è uno strumento che aumenta la sostenibilità di processi sintetici industriali riducendo l uso di solventi organici, reagenti Flamma novembreo 2011

2 aggressivi e il numero di passaggi sintetici per raggiungere l obiettivo sintetico. Tuttavia l uso di enzimi di origine animale nella preparazione di API è limitato dal rischio dell incorporazione di materiale biologico ad attività ignota. La produzione di enzimi con tecniche di biologia molecolare che coinvolgono organismi con proprietà note cancella il rischio esposto. Da questo punto di vista il progetto ha raggiunto gli obiettivi comuni alle due linee avendo prodotto le proteasi e nucleasi batteriche progettate. Le due linee di ricerca nel progetto è infatti differenziato negli obiettivi di produzione delle attività catalitiche: Linea 1: produzione di proteasi batterica ad attività di chimotripsina per la produzione di a-ammino acidi non naturali di configurazione L. Linea 2: produzione di fosforilasi per la produzione di nucleotidi. Il progetto è stato completato in pieno accordo con quanto pianificato nella versione rimodulata e ha condotto a risultati significativi che possono essere sintetizzati nei seguenti punti: Linea 1 a) un protocollo per la rivelazione e misura di attività enzimatica su substrati di interesse; b) produzione di biomassa da micro-chart con attività chimotripsina like per applicazione su larga scala; c) screening e ottenimento di Attinomiceti con attività chimotripsina like per applicazioni sintetiche; d) applicazione dei preparati microbici su impianto industriale. Linea 2 a) sviluppo di catalizzatori per la sintesi di nucleosidi modificati mediante transglicosilazioni catalizzate da nucleoside fosforilasi, in grado di trasferire uno zucchero ad una base di interesse a partire da un nucleoside donatore; b) sviluppo di catalizzatori a livello industriale ottenuti con enzimi di microrganismi appartenenti ai generi Aereomonas e Citrobacter, il cui uso non era riportato in letteratura o brevetti e B. Subtilis; c) messa a punto di bio-processi per la sintesi a livello pilota (preindustriale) di Vidarabina (Ara-A) e 5 -desossi nucleosidi. DETTAGLIO DEGLI OBIETTIVI DELLE REALTA COINVOLTE L obiettivo specifico della Linea 1 è l ottenimento di proteasi batteriche con specificità di substrato simile alla chimotripsina da mammiferi, con lo scopo di effettuare la risoluzione cinetica di esteri di derivati di amminoacidi non naturali ottenendo singoli enantiomeri nella forma enantiomerica L-: a) sintesi dei racemi di substrati modello e sostanze di interesse industriale (Flamma); b) studio delle reazioni dei substrati con catalisi enzimatica con chimotrispina o tripsina commerciale (Polimi); c) sintesi di substrati simili o derivati dei substrati oggetto dello studio in forme capaci di dare reazioni cromogeniche in presenza di catalizzatori enzimatici efficaci. (Polimi); d) messa a punto dei saggi enzimatici per la valutazione delle attività enzimatiche note e da nuovi microorganismi (Polimi);

3 e) selezione di microrganismi produttori di enzimi chimotripsina-like, creazione di una libreria genica e creazione e screening della libreria di espressione (Ktedogen); f) screening dei brodi di coltura di attinomiceti alla ricerca di attività chimotripsina-like (Ktedogen); g) purificazione e preparazione di microorganismi ed enzimi in forma adatta a cattalizzare le reazioni richieste su scala millimolare (subscontractor Uninsubria - Flamma); h) purificazione e preparazione di microorganismi ed enzimi in forma adatta a cattalizzare le reazioni richieste su scala molare (subcontractor Uninsubria - Flamma, Gnosis); i) applicazione su reattore pilota industriale (Flamma, Polimi). ESTRATTO DEI RISULTATI OTTENUTI Risultati Flamma/Polimi/KtedoGen FLAMMA si è occupata della sintesi di alcuni degli starting material utilizzati nello screening enzimatico. I prodotti sintetizzati sono prevalentemente derivati aminoacidici protetti all azoto sotto forma di acetil derivati o terbutossicarbonil derivati. Gli intermedi prodotti in Flamma sono stati poi forniti a PoliMi per essere trasformati nelle corrispondenti paranitroanilidi o nei corrispondenti para nitro fenil esteri. Al fine di ottimizzare i tempi, la sintesi di alcuni prodotti è stata affidata alla società Dalian Flamma Bioscience. Nella seconda parte di questa fase KtedoGen e Flamma, in collaborazione con il gruppo del Professor L. Pollegioni dell Università degli Studi dell Uninsubria, si sono dedicati all ottenimento di enzimi chimotripisinalike di origine non-animale e proteasi con specificità opposta alle proteasi naturali. La ricerca delle attività enzimatiche si sviluppa in due vie parallele la prima con l'obiettivo di identificare frammenti conservati correlati con attività di chimotripisina-like in microorganismi e di studiare delle attività presenti nei microrganismi da collezione; la seconda prevede il clonaggio del gene della chimotripsina in E. coli e poi l evoluzione dei batteri ottenuti fino ad ottenere sorgenti enzimatiche appropriate. KTEDOGEN, dopo adeguata analisi bioinformatica, ha identificato negli attinomiceti i microrganismi produttori di attività di tipo chimotripsina. E stato quindi sviluppato un metodo di PCR per l amplificazione dei geni di interesse a partire da pool di DNA di attinomiceti provenienti dalle campioni di suolo della collezione NAICONS (New Anti-Infective CONSortium). Questo ha consentito di ottenere sequenze contenenti geni codificanti proteine chimotripsina-like con le quali è stata costruita una libreria genomica. Successivamente è stata generata una libreria di espressione mediante la quale sono state prodotte le proteine ricombinanti diverse tra loro e a buoni livelli di espressione. Tuttavia lo screening di un numero rappresentativo di cloni non ha evidenziato alcun positivo in grado di idrolizzare il substrato modello suggerendo che o le proteine ricombinanti

4 non sono espresse in forma attiva oppure non riescono ad accedere al substrato modello. In un approccio alternativo portato avanti da KtedoGen sono stati opportunamente selezionati degli attinomiceti (in totale 100) di proprietà di NAICONS, società che possiede una collezione di oltre microrganismi produttori di metaboliti secondari. Questi microrganismi sono stati cresciuti in maniera appropriata e i brodi di coltura, opportunamente diluiti, sono stati utilizzati in un saggio per attività simili a chimotripsina. Oltre la metà delle brodo colture è risultata positiva. I ceppi che producevano le attività enzimatiche più potenti sono stati cresciuti in volumi appropriati e i corrispondenti filtrati delle brodo colture sono stati consegnati a Flamma per essere saggiati sui substrati di interesse. In parallelo al lavoro svolto da Ktedogen per quanto riguarda la ricerca di attività enzimatiche di origine non-animale, Flamma in collaborazione con l Università dell Insubria, dopo analisi della letteratura riguardante enzimi idrolitici e serin proteasi, ha progettato due diversi geni sintetici, l uno da bovino e l altro di origine microbica. In entrambi i casi, la chimotripsina è sintetizzata come PRE-PRO-proteina. La sequenza PRE- è un segnale di targeting/smistamento cellulare, pertanto non è necessaria per l espressione eterologa della proteina in host diversi dall organismo originario, fonte della chimotripsina. Per quanto riguarda, invece la sequenza PRO-, è indispensabile per la maturazione della proteina, l acquisizione del corretto fold e la conseguente attività. La chimotripsina in forma di PRO-proteina (inattiva) viene definita chimotripsinogeno. Per l espressione ricombinante di questi enzimi proteolitici, si è deciso di mantenere la sequenza PRO in modo da consentire il corretto processo di folding proteico e ridurre la tossicità esercitata dalla proteina sulle stesse cellule ospiti (che sarebbe inevitabile se le proteasi fossero espresse già in forma attiva-senza PROsequenza). Si è scelto di esprimere in modo ricombinante la forma A della chimotripsina bovina perché in letteratura vi sono informazioni più dettagliate sulla specificità di substrato: viene riportato infatti che questa forma sia attiva su un maggior numero di substrati rispetto alla chimotripsina B. Nel corso del progetto sono stati individuati come substrati modello delle specie con strutture generalizzabili in un gran numero di intermedi di interesse industriale. POLIMI ha sintetizzato e messo a punto saggi basati su: 1. Idrolisi di nitro-fenilanilidi. 2. Idrolisi di nitrofenilanilidi modificate per aumentarne la solubilità in acqua. 3. Idrolisi di esteri metilici accoppiata ad ossidazione del metanolo e sua quantificazione via alcool aossidasia>>perossido di idrogeno>>odianisidina. 4. idrolisi di esteri metilici accoppiata ad ossidazione del metanolo e sua quantificazione via alcool ossidasia>>formaldeide >> purpald. 5. preparazione ed idrolisi di substrati fluoro genici. 6. preparazione e idrolisi di substrati che generano green-fluorescence.

5 Il principio del saggio si basa sulla generazione di p-nitroaniline con colorazione gialla (400 nm). Data la scarsa solubilità in acqua dei prodotti indicati nello schema, sono stati preparati anche i succinil derivati per conferire maggiore solubilità (R = COCH2CH2COOH) (punto 2). I substrati sono stati preparati inizialmente come racemati e successivamente nella forma enantiomerica L- dai corrispondenti AA. Questi sono stati ottenuti per risoluzione cinetica dei racemati con chimotripsina commerciale di origine bovina. La sensibilità del metodo delle p-nitroanilidi si può spingere fino ad individuare conc M. Nella fase finale la cultura di cellule di E. coli Origami2(DE3) pet26micro_ctr già identificata come promettente sorgente di attività di chimotripsina adatta alla trasformazione dei substrati di elezioni, è stata fermentata su scala pilota da GNOSIS ha effettuato la fermentazione del microrganismo produttore della chimotripsina di interesse su scala preindustriale. Per questo la fermentazione è stata effettuata su bioreattori da 300 L, scalando le condizioni messe a punto nelle fasi precedenti. La biomassa prodotta è stata consegnata a Flamma. Con la pasta cellulare grezza contenente proteasi ottenuta da biofermentazioni in Gnosis, Flamma ha realizzato due applicazioni. La proteasi grezza è stata utilizzata per due preparazioni industriali su scala 15 e 30 kg rispettivamente di due intermedi di notevole interesse commerciale in quanto coinvolti nei processi di sintesi di nuovi prodotti farmaceutici. Gli intermedi oggetto delle prove di sintesi con proteasi grezza sono: 1) Acido (2S)-2-[(acetiltio)metil]-fenilpropionico. 2) (1R,2S) Etil 1-[(tert-butossicarbonil)amino]-2- vinilciclopropancarbossilato. Il primo prodotto è un intermedio della sintesi di un nuovo composto con potenziale utilizzo nella terapia del dolore e un meccanismo d azione completamente diverso dai precedenti antidolorifici con attività narcotica. Il secondo prodotto è un intermedio chiave nella sintesi di composti antivirali con attività anti HCV. Entrambi sono intermedi di grande interesse commerciale. La reazione di risoluzione cinetica su questa scala si è rivelata meno soddisfacente di quella su scala di laboratorio. E pertanto necessario approfondire lo scale-up delle due reazioni. Risultati Unipv, Gnosis, Innovate La collaborazione tra l Università di Pavia, Gnosis e Innovate, ha portato allo sviluppo di una collezione di enzimi immobilizzati dotati di varia selettività e quindi adatti per la sintesi di un elevato numero di composti a struttura nucleosidica, di interesse come composti ad attività farmacologia (antitumorale e antivirale) ma anche per applicazioni in campo alimentare. Infatti, selezionando a secondo del composto desiderato è possibile, sulla base dei risultati ottenuti in questo progetto, selezionare i biocatalizzatori idonei per effettuare la sintesi. La preparazione di questi biocatalizzatori così come alcuni bioprocessi sono stati sviluppati e testati fino a scala

6 preindustriale (pilota) dimostrando l applicabilità della tecnologia sviluppata. La collezione di biocatalizzatori potrà quindi essere oggetto di commercializzazione. I risultati sopra descritti sono stati ottenuti grazie alle diverse fasi di lavoro sviluppate dai partners del progetto. In particolare sono state svolte le seguenti attività: 1) screening di diverse attività enzimatiche e selezione degli enzimi dotati di selettività adeguata (UNIPV). 2) sviluppo dei processi fermentativi per l ottenimento degli enzimi selezionati (Gnosis). 3) Studio di processi di immobilizzazione degli enzimi selezionati (INNOVATE). 4) Studio ed ottimizzazione delle reazioni enzimatiche (UNIPV). 5) Sviluppo preindustriale dei processi di fermentazione (GNOSIS). 6) Sviluppo preindustriale dei processi di immobilizzazione e delle biotrasformazion1 per ottenere i nucleosidi di interesse (INNOVATE). CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE Il progetto Enzimi per Biocatalisi ha contribuito a mettere a punto una metodologia altamente innovativa per lo studio, screening e applicazioni di enzimi ottenuti da tecniche del DNA ricombinante che promettono di portare ad una applicazione su scala pilota. L approccio che è stato utilizzato nel progetto combina accesso a diversita' microbica unica, tecniche del DNA ricombinante e metodologie chimiche tradizionali applicate a problematiche tipiche della chimica fine. I prodotti della chimica fine possono sopportare i costi intrinseci della catalisi enzimatiche, tuttavia due fattori pesano sulla possibilità di portare il progetto su scala industriale nel periodo previsto. - La necessità di produrre per ingegneria genetica un catalizzatore con esattamente le proprietà richieste - I grandi volumi richiesti nella reazione catalizzata da enzimi che difficilmente possono essere compressi oltre un certo limite. Il raggiungimento degli obiettivi su scala inferiori alle aspettative è dovuto essenzialmente a difficoltà riscontrate nel corso delle fasi di ricerca industriale che hanno di fatto ritardato la partenza dello scale-up industriale, limitando il tempo a disposizione per un attività di sviluppo che resta tutt ora promettente. Il partenariato creatosi a risposta delle caratteristiche di eleggibilità del Bando Metadistretti 2007, con la costituzione di un Associazione Temporanea d Impresa ad hoc, offre un ottimo strumento di collaborazione fra Aziende ed Enti di ricerca individuando obiettivi comuni di ricerca industriale e sviluppo precompetitivo. L insieme dei partecipanti al progetto ha mostrato spirito di collaborazione e capacità tecnicoscientifiche di eccellente livello, adeguate all ottenimento del risultato raggiunto. Il contributo finanziario regionale ha consentito di lavorare secondo quanto previsto nei desideri dei partner, supportando una serie di investimenti in facilities e risorse umane che ha permesso un notevole accrescimento del know-how e delle competenze di ciascun componente l ATI, contribuendo in modo efficace alla realizzazione di una partnership pubblico-privata

7 destinata a durare e consolidarsi anche oltre il progetto, favorendo quindi il tanto ricercato trasferimento tecnologico di competenze dall accademia all industria, spesso incentivato nelle politiche di sviluppo regionale, nazionale e comunitario. Nello specifico, lo sviluppo delle attività ha infatti permesso l acquisizione di moderne strumentazioni da parte di alcuni partner che difficilmente avrebbero investito in beni materiali di livello senza l aiuto pubblico, nonché ad una serie di nuove assunzioni quantificabili complessivamente a 5 unità di personale per tutta la durata del progetto, pari a circa 15 anni/uomo complessivi. Non dimentichiamo infine la possibilità data a ciascun partner industriale di poter acquisire nuove competenze scientifiche dall esterno, azione di difficile realizzazione senza il supporto economico pubblico, specialmente per progetti di ricerca e sviluppo.