MuSK-Ab ELISA RE C. Istruzioni per l Uso
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- Rita Mancini
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1 Istruzioni per l Uso MuSK-Ab ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione qualitativa e quantitativa dei autoanticorpi contro il recettore muscolo-specifico tirosina chinasi (MuSK) nel siero umano. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. USO PREVISTO Dosaggio imunoenzimatico per la determinazione qualitativa e quantitativa dei autoanticorpi contro il recettore muscolo-specifico tirosina chinasi (MuSK) nel siero umano. 2. SOMMARIO E SPIEGAZIONI Causa della Miastenia gravis (MG) è la mancanza della trasmissione neuromuscolare mediata dagli autoanticorpi. Circa l % dei pazienti con MG generalizzata presenta autoanticorpi contro i recettori muscolari nicotinicidell acetilcolina. Questi anticorpi causano la perdita del numero e della funzione dei recettori dell acetilcolina e l interruzione della trasmissione neuromuscolare con conseguente miastenia. Nel % dei pazienti con miastenia generalizzata e fino al 50 % dei pazienti con miastenia gravis oculare si rileva negatività del dosaggio degli anticorpi antiecettore acetilcolinico. In questi casi la patologia è comunemente definita miastenia gravis sieronegativa. La miastenia gravis sieronegativa è stata riconosciuta come una patologia anticorpo-mediata. Gli anticorpi anti recettore muscolo-specifico tirosina chinasi (MuSK) sono stati rilevati nel siero di pazienti con miastenia gravis sieronegativa generalizzata (circa nel 40 % dei pazienti MG sieronegativi). Il MuSK è parte di un complesso di recettori agrina; media l aggregazione dei recettori dell acetilcolina durante la formazione delle sinapsi e compare anche nella giunzione neuromuscolare matura (NMJ). I pazienti MuSK MG sono prevalentemente di sesso femminile, presentano un coinvolgimento craniale e bulbare e tendono ad avere una percentuale più alta di crisi rispetto agl individui con altre forme di MG. L insorgenza della patologia tende ad essere più precoce, con la maggior parte dei pazienti in età tra la terza e la quarta decade. La misurazione degli anticorpi MuSK sarà di sostanziale aiuto alla diagnosi e alla gestione clinica della Miastenia gravis [1, 5, 9, 10, 12, 15]. 3. PRINCIPIO DEL TEST Saggio immunoassorbente legato a enzima su fase solida (ELISA). I pozzetti sono rivestiti con l antigene. Gli anticorpi del paziente, contenuti nel campione, si legano ai pozzetti rivestiti con l antigene e vengono rilevati tramite un sistema di amplificazione del segnale. La reazione del substrato viene catalizzata tramite l anticorpo di rilevamento coniugato alla fosfatasi alcalina. L intensità del colore sviluppato è proporzionale alla quantità di anticorpi del paziente rilevati. I risultati quantitativi o qualitativi si determinano usando rispettivamente una curva standard o il controllo di cut-off. 4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Solo per uso diagnostico in-vitro. Solo per uso professionale. 2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi di aver compreso tutte le indicazioni. 3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il Vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore. 4. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i reagenti scaduti. 5. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in lattice e occhiali protettivi se necessario. 6. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore. 7. I reagenti preparati e usati e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato. 8. Il personale delle pulizie dev essere informato dal personale specializzato sui possibili rischi e sulle procedure da adottare. 9. Evitare il contatto con la soluzione stop. Può causare irritazioni e ustioni della pelle. 10. Tutti i reagenti del kit contenenti siero umano o plasma sono risultati negativi rispetto a HIV I/II, HBsAg e HCV. Si raccomanda tuttavia di trattarli come potenzialmente pericolosi poiché non si può escludere in maniera assoluta la presenza di questi o di altri agenti infettivi. Versione / 6
3 5. CONSERVAZIONE E STABILITÀ Il kit è spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 2-8 C. Non esporre a luce solare diretta e ad alte temperature. Le informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente. La piastra microtitrata aperta è stabile fino a scadenza del kit se conservata nel suo involucro ben chiuso riposta a 2 8 C. 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Siero Osservare le classiche precauzioni durante il prelievo venoso. Conservare l integrità del campione di sangue dal momento del prelievo al momento dell esecuzione del test. Non usare campioni emolizzati, itterici o lipemici. I campioni torbidi devono essere centrifugati per rimuovere il materiale particolato al loro interno. Conservazione: 2-8 C -20 C (Aliquote) Non esporre alla luce solare diretta e al calore. Evitare la Stabilità: 7 giorni 6 mesi ripetizione di cicli di congelamento/scongelamento. 7. MATERIALE FORNITO Quantità Simbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 1 x 0.25 ml ENZCONJ CONC 1 x 13 ml ANTISERUM 1 x 5 x 1.2 ml CAL A-E 1 x 1.2 ml CONTROL + 1 x 1.2 ml CONTROL - 1 x 120 ml ASSAYBUF 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 13 ml PNPP SUBS Micropiastra Strisce separabili. Rivestito con proteina purificata ricombinante di MuSK. Coniugato Enzimatico, Concentrato (101x) Contiene: anticorpo-coniugato a fosfatase alcalina, stabilizzatori. antiumano anticorpo Antisiero Contiene: antiumano anticorpo, stabilizzatori. Standard A-E 0; 0.4; 2.5; 5; 12 U/mL Pronto/a all uso. Contiene: anticorpi anti-musk, stabilizzatori. Controllo Positivo Di colore rosso. Pronto/a all uso. Contiene: anticorpi contro MuSK, stabilizzatori. Controllo Negativo Di colore verde. Pronto/a all uso. Contiene: anticorpi contro MuSK, stabilizzatori. Tampone Saggio Di colore rosso. Pronto/a all uso. Contiene: tampone fosfato, proteinas e stabilizzatori. Tampone Lavaggio, Concentrato (10x) Contiene: tampone fosfato, Tween. Soluzione Substrato PNPP Pronto/a all uso. Contiene: p-nitrofenil fosfato (PNPP). 1 x 15 ml PNPP STOP Soluzione Stop PNPP Pronto/a all uso. Contiene: 1 M NaOH, 0.25 M EDTA. 4 x FOIL Pellicola Adesiva 8. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. Micropipette (Multipette Eppendorf o similari, < 3 % CV). Volumi: 5; 10; 20; 50; 100; 1000 µl 2. Provette di vetro monouso (12 x 75 mm) 3. Provette di polipropilene (PP) (ad es. Sarstedt) 4. Vortex mixer 5. Incubatore, 37 C 6. Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti 7. Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico 8. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 405 nm (lunghezza d onda di riferimento nm) 9. Acqua bidistillata o deionizzata 10. Carta assorbente, puntali per pipette e timer Versione / 6
4 9. NOTE PER LA PROCEDURA 1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati. Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate. 2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai campioni e ai componenti del kit (18-25 C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e campione prima dell uso. Non creare schiuma durante il mescolamento. 3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti. 4. Usare uno schema di pipettamento per realizzare un appropriata distribuzione sulla piastra. 5. Il tempo di incubazione influisce sui risultati. Tutti i pozzetti dovrebbero essere dispensati nello stesso ordine e sequenza temporale. Si raccomanda una pipetta multicanale a 8 canali per pipettare le soluzioni in tutti i pozzetti. 6. Il lavaggio della micropiastra è importante. Pozzetti lavati in modo inappropriato possono portare a risultati erronei. Si raccomanda una pipetta multicanale o un lavatore automatico per piastre. Non far asciugare i pozzetti tra le varie incubazioni. Non graffiare i pozzetti rivestiti durante risciacqui e aspirazioni. Risciacquare e versare i reagenti con cura. Durante i risciacqui assicurarsi che i pozzetti siano ben riempiti con la soluzione di lavaggio e che non ci siano residui nei pozzetti. 7. L umidità influisce sui pozzetti/tubi rivestiti. Non aprire l involucro finché non ha raggiunto la temperatura ambiente. Riporre immediatamente i tubi/pozzetti non utilizzati nell involucro con il disseccante. 10. ISTRUZIONI PRE-TEST Il contenuto del kit per 96 determinazioni può essere diviso per 3 esecuzioni separate. I volumi indicati di seguito si riferiscono a un esecuzione con 4 strisce (32 determinazioni) Preparazione di componenti liofilizzati o concentrati Diluire / dissolvere Componente Diluente Rapporto Note Conservazione Stabilità 20 ml WASHBUF CONC 180 ml acqua bidist. 1:10 Mischiare bene. 2-8 C 4 settimane 40 µl ENZCONJ CONC 4 ml ASSAYBUF 1: Diluizione dei Campioni Mescolare senza formare schiuma. 2-8 C 48 h Campione di pazienti da mescolare con Rapporto Note Siero sempre ASSAYBUF 1:101 p.e. 10 µl µl Diluizione deve essere effetuata in provette di vetro o di polipropilene (PP). Versione / 6
5 11. PROCEDURA DEL TEST 1. Pipettare 100 µl di ogni Standard, Controllo e campioni di paziente diluito nei rispettivi pozzetti della Micropiastra. Coprire la piastra con foglio adesivo. 2. Incubare la micropiastra 60 min a TA (18-25 C) su un oscillatore orbitale (500 rpm). Rimuovere la pellicola adesiva. Eliminare la soluzione d incubazione. Lavare la piastra 3 volte con µl di Tampone Lavaggio diluito. Rimuovere l eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una salvietta di carta. 4. Pipettare 100 µl di Antisiero in ogni pozzetto. Coprire la piastra con foglio adesivo. 5. Incubare la micropiastra 60 min a TA (18-25 C) su un oscillatore orbitale (500 rpm). Rimuovere la pellicola adesiva. Eliminare la soluzione d incubazione. Lavare la piastra 3 volte con µl di Tampone Lavaggio diluito. Rimuovere l eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una salvietta di carta. 7. Pipettare 100 µl di Coniugato Enzimatico diluito in ogni pozzetto. Coprire la piastra con foglio adesivo. 8. Incubare la micropiastra 60 min a TA (18-25 C) su un oscillatore orbitale (500 rpm). Rimuovere la pellicola adesiva. Eliminare la soluzione d incubazione. Lavare la piastra 3 volte con µl di Tampone Lavaggio diluito. Rimuovere l eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una salvietta di carta. Per aggiungere le Soluzioni Substrato e Stop usare, possibilmente, una micropipetta 8-canali. 10. Pipettare con intervalli di tempo costanti per le Soluzioni Stop e Substrato. Usare uno spostamento positivo ed evitare la formazione di bolle d aria. 11. Pipettare in ogni pozzetto 100 µl di Soluzione Substrato PNPP. Mescolare delicatamente il contenuto agitando leggermente la piastra. 12. Incubare la micropiastra 30 min a TA (18-25 C). 13. Fermare la reazione substrato aggiungendo 100 µl di Soluzione Stop PNPP in ogni pozzetto. Mescolare delicatamente il contenuto agitando leggermente la piastra. 14. Misurare la densità ottica con un fotometro a 405 nm (Lunghezza d onda di riferimento: nm) entro 60 min dopo aver pipettato la Soluzione Stop. 12. CONTROLLO DI QUALITA I risultati del test sono validi solo se il test è stato eseguito seguendo le istruzioni per l uso. L utente deve inoltre attenersi rigorosamente ai principi della BPL (Buona Pratica di Laboratorio) o a norme equivalenti. Gli utenti e il laboratorio devono avere un sistema di formulazione della diagnosi conforme alle Buone Pratiche di Laboratorio. Tutti i controlli devono risultare compresi entro gli intervalli accettabili indicati sulle etichette e il Certificato QC. Se i criteri non sono soddisfatti il test non è valido e dovrebbe essere ripetuto. Ogni laboratorio dovrebbe usare campioni noti come ulteriori controlli. Si consiglia la partecipazione a programmi di controllo qualità periodici. In caso di deviazioni devono essere forniti i seguenti dati: Scadenza dei reagenti (preparati), condizioni di conservazione, pipette, strumenti, condizioni d incubazione e metodi di lavaggio. 13. CALCOLO DEI RISULTATI L evaluazione del test può essere eseguita qualitativamente o quantitativamente Evaluazione Qualitativa Il valore di Cut-off è fornito dalla densità ottica (DO) dello Standard B (Standard Cut-off). L Indice Cut-off (COI) è calcolato sulla base della densità ottica media dei campioni e del valore Cut-off. Campioni con DO superiore sono positivi, campioni con DO inferiori sono negativi. Esempio Tipico: Cut-off = DO (Standard B, Standard Cut-off) = 0.23 DO Campione = 0.70 Indice Cut-off (COI): 0.70 / 0.23 = Il campione va considerato positivo. Versione / 6
6 13.2. Evaluazione Quantitativa Le DO ottenute per gli standards (asse y, lineare) sono messe in grafico rispetto alla loro concentrazione (asse x, logaritmico) sia su carta per grafico semilogaritmico che con metodo automatico. Buoni risultati si ottengono con grafici cubic spline, 4 Parametri Logistica o Logit-Log. Per il calcolo della curva standard utilizzare ogni segnale degli standard (omettere ovviamente i valori dei duplicati molto al di fuori dei risultati attesi e impiegare il valore singolo più plausibile). La concentrazione dei campioni può essere ricavata dalla curva standard. La diluizione iniziale consigliata in queste istruzioni è stata tenuta in considerazione per l evaluazione descritta sopra. I risultati dei campioni con prediluizioni superiori devono essere moltiplicati per il fattore di diluizione. I campioni con concentrazioni superiori al più alto degli standards devono essere diluiti con Tampone Saggio e ritestati. Tipica Curva di Calibrazione (Esempio. Non usare per il calcolo!) Standard U/mL DO media A B C D E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Metodo Intervallo Interpretazione Quantitativo (Curva Standard): Qualitativo (Indice Cut-off, COI): > 0.4 U/mL positivo < 0.4 U/mL negativo > 1.0 positivo < 1.0 negativo I soli risultati non dovrebbero essere l unica motivazione alla base di una scelta terapeutica. Devono essere correlati ad altre osservazioni cliniche e test diagnostici. 15. LIMITI DELLA PROCEDURA La raccolta e conservazione dei campioni ha influenza significativa sui risultati del test. Vedere la sezione PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI per maggiori dettagli. Azide e Pro Clin a concentrazioni > 1.0 % e thimerosal a concentrazioni > 0.1 % interferiscono con questo test e possono portare a risultati non veritieri. I seguenti componenti del sangue non hanno effetto Emoglobina 5.0 mg/ml significativo (+/-20%) sui risultati del test fino ai livelli di Bilirubina 5.0 mg/ml concentrazione riportati in tabella: Trigliceridi 91.0 mg/ml 16. PERFORMANCE Specificità Analitica (Reattività Crociate) Non è stata riscontrata reattivitàcrociate con: Precisione Intervallo (U/mL) Intervallo CV (%) Intra-Saggio (n = 20) Inter-Saggio (n = 11) Inter-Lotto (n = 10) Linearità Metodo di Paragone verso RIA Anticorpi di Recettore Colinergico, Ac specifico di LEMS, PR3-Ac (canca), MPO-Ac (panca), dsdna-ac, FR, AMA, ANA, CCP-Ac Intervallo (U/mL) Diluizioni Seriali fino a Intervallo (%) : Sensibilità relat % n = 96 Specificità relat % n = 157 Versione / 6
7 17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1. Hoch W et al. Auto-antibodies to the receptor tyrosine kinase MuSK in patients with myasthenia gravis without acetylcholine receptor antibodies. Nature Medicine 7 (3): (2001) 2. Vincent A et al. Neuromuscular junction autoimmune disease: muscle specific kinase antibodies and treatments for myasthenia gravis. Curr Opin Neurol. 18(5): (2005) 3. Lavrnic D et al. The features of myasthenia gravis with autoantibodies to MuSK. J Neurol Neurosurg Psychiatry 76: (2005) 4. Lindstrom J. Is seronegative MG explained by autoantibodies to MuSK? Neurology vol. 62 no. 11: (2004) 5. Strochlic L et al. The synaptic muscle-specific kinase (MuSK) complex: New partners, new functions. Bioessays 27 (11): (2005) 6. Zhou L et al. Clinical comparison of muscle-specific tyrosine kinase (MuSK) antibody-positive and - negative myasthenic patients. Muscle Nerve 30 (1): (2004) 7. Evoli A et al. Clinical correlates with anti-musk antibodies in generalized seronegative myasthenia gravis. Brain 126 (Pt 10): (2003) 8. Deymeer F et al. Clinical comparison of anti-musk- vs anti-achr-positive and seronegative myasthenia gravis. Neurology 68 (8): (2007) 9. Bennett D L H et al. Anti-MuSK antibodies in a case of ocular myasthenia gravis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 77 (4): (2006) 10. Shigemoto K. Myasthenia gravis induced by autoantibodies against MuSK. Acta myologica 26 (3): (2007) 11. Padua L et al. Seronegative myasthenia gravis: comparison of neurophysiological picture in MuSK+ and MuSK patients. European Journal of Neurology 13 (3): (2006) 12. Muppidi S et al. Muscle-Specific Receptor Tyrosine Kinase Antibody-Positive and Seronegative Myasthenia Gravis. Front Neurol Neurosci. 26: (2009) 13. Jeffrey T et al. Anti-MuSK antibody Myasthenia Gravis: Clinical findings and response to treatment in two large cohorts. Muscle Nerve 44 (1): (2011) 14. Vincent A. Autoantibodies in neuromuscular transmission disorders. Ann Indian Acad Neurol. 11(3): (2008) 15. Sanadze AG et al. Clinical features of myasthenia related with autoantibodies to muscle specific tyrosine kinase (MuSK). Zh Nevrol Psikhiatr Im S S Korsakova. 110 (12): 72-6 (2010) Versione / 6
8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /
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