LA STRUTTURA DELLA CROMATINA E DINAMICA, SI MODIFICA A SECONDA DELLO STATO TRASCRIZIONALE

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1 LA STRUTTURA DELLA CROMATINA E DINAMICA, SI MODIFICA A SECONDA DELLO STATO TRASCRIZIONALE La cromatina dei geni che devono espressi viene rilassata per consentire la formazione del complesso di trascrizione. La repressione dei geni conduce al compattamento della cromatina

2 LA CROMATINA DELLE CELLULE INTERFASICHE SI PRESENTA IN DUE FORME L EUCROMATINA presenta una colorazione diffusa e poco intensa. E ricca di geni. L ETEROCROMATINA ha una struttura condenzata che si colora intensamente. Giace preferenzialmente nella periferia del nucleo, associata all involucro nucleare. Si presenta in due forme: COSTITUTIVA (si ritrova nei telomeri e centromeri) ed è povera di geni. FACOLTATIVA:Contiene geni eucromatici inattivi. Esempio: geni espressi in tipo cellulare e silenti in un altro tipo; geni del cromosoma X silente.

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4 Le anse sporgono dai cromomeri.

5 Struttura del cromosoma a Spazzola. La trascrizione avviene all interno delle anse che sono circa La maggior parte della cromatina è però più compattata nei cromomeri.

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7 Chromosome puffs.! Dallo studio dei cromosomi politenici si è dimostrato che l espressione dei geni è associata alla decondenzazione della cromatina. Durante lo sviluppo della larva di Drosofila si può osservare una successione di eventi temporali di comparsa e scomparsa di puffs: alcune bande si gonfiano a formare i puffs, mentre alcuni puffs si ricondenzano e riformano le bande dei cromosomi. Ogni puff è sede di attiva trascrizione e lo stato attivo dura un breve periodo. La maggior parte dei puffs si formano da una singola banda, suggerendo che la cromatina in una banda si rilassa come una unità durante la trascrizione.

8 Folding e unfolding della fibra cromatinica di 30 nm con una organizzazione ad elica due inizi modifiche covalenti (metilazione) 30 nm fiber folding Travers COGD 09

9 I puff sono sede di trascrizione Figure 4-62 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

10 Caratteristiche della Cromatina dei Geni Trascritti 1. Sensibilità alla DNasi I

11 2. I siti ipersensibili alla DNase I (DHS) mappano nelle regioni di promotori ed enhancer dei geni attivi TF

12 3. LA TRASCRIZIONE CAMBIA L ORGANIZZAZIONE DEI NUCLEOSMI ESPRESSO SILENTE ESPRESSO SILENTE La cromatina dei promotori dei geni trascritti digerita con la nucleasi micrococcale (MNasi) non presenta un tipico profilo nucleosomale. Ciò può essere spiegato con una struttura o posizionamento nucleosomale alterato dei nucleosomi, e/o da una assenza di nucleosomi associate a sequenze regolatrici.

13 Il nucleosoma rappresenta una forte barriera all allungamento della trascizione della RNA Pol II.! L RNAPII inizia la trascrizione su stampo di chromatina, ma si blocca sul nucleosoma prossimale. FACT allevia il blocco e facilita il passaggio della RNAPII attraverso il nucleosoma

14 FACT rimuove il dimero H2A-H2B e riassembla il nucleosoma dopo il passaggio della polimerasi Esasoma FACT

15 Esistono vari modi di modificare la struttura della cromatina e regolare i processi biologici"

16 Lewin il Gene ed Compatta Zanichelli editore

17 SWR1 sostituisce l istone H2A con la variante istonica H2A-Z Sir complex La variante istonica H2A-Z impedisce la diffusione delle proteine Sir associate all eterocromatina telomerica. Nucleosomi H2A-Z si trovano nei promotori di geni che devono essere espressi

18 La cromatina del centromero contiene nucleosomi CEN- H3 (CENP-A) che sono incorporati nel cinetocoro! cinetocore! La funzione del centromero è prettamente strutturale in quanto vi si assembla una struttura proteica chiamata cinetocore. il quale interagisce con i microtubuli i del fuso mitotico e permette la segregazione dei cromatidi fratelli nelle due cellule figlie all anafase di meiosi e mitosi.!

19 Il centromero è costituito da DNA ripetitivo e contiene nucleosomi CenH3 intercalati con nucleosmi H3

20 La cromatina centromerica è fiancheggiata da etrocromatina pericentromerica.

21 Regione Centromerica del Cinetocore

22 GLOSSARY 1. alfa satellite: The name of the 171-base-pair human centromeric repeat. 2. Centromeres: DNA sequences that interact with the kinetochore. 3. CEN chromatin: A term used here to describe the mixture of histone H3 and CENH3 that underlies the kinetochore. The histone variant H3.3 might also bepresent in CEN chromatin. 4. Cohesin: The protein complex that mediates sister-chromatid cohesion. 5. Epigenetics: Heritable changes in phenotype that are not caused by changes in DNA sequence. 6. Kinetochore: The proteinaceous structure that connects the centromere to the spindle. 7. Kinetochore-foundation proteins: The small set of kinetochore proteins that are intimately associated with centromeric DNA. Foundation proteins are constitutive, that is, detectable at centromeres throughout the cell cycle. The major (evolutionarily conserved) foundation proteins are CENH3, CENP-C, Mis12 and CENP-H. Kinetochore-foundation proteins recruit outer kinetochore proteins. 8. Neocentromeres: Centromeres that arises spontaneously in a new position, often in an area that does not contain repeat arrays. 9. Outer kinetochore proteins: A large collection of proteins that mediate, facilitate or regulate the interaction of the kinetochore with the spindle. Outer 10. kinetochore proteins tend to be present only during cell division. 11. Pericentromeric heterochromatin: The deeply staining chromatin that flanks 12. CEN chromatin on either side. Unlike CEN chromatin, pericentromeric heterochromatin does not have defined boundaries. 13. Repeat arrays: Long series of short DNA sequences arranged in tandem. 14. Centromeric repeat arrays are usually base pairs and might extend uninterrupted for hundreds of kilobases.

23 La cromatina centromerica è diversa da quella pericentromerica

24 Nel lievito S. cerevisae il centromero è costituto da una corta sequenza di 125 bp e il cinetocoro incorpora un nucleosoma a cui si legano circa 12 proteine. Le proteine addizionali che si legano al centromero di lievito, attaccano questo nucleosoma a un solo microtubulo del fuso mitotico. Figure 4-48 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

25 Esistono vari modi di modificare la struttura della cromatina e regolare i processi biologici"

26 POSIZIONAMENTO DEI NUCLEOSOMI! Gli istoni possono essere associati a specifiche sequenze del DNA. Tale associazione prende il nome di posizionamento dei nucleosomi

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28 La curvabilità del DNA è il maggiore determinante nell orientamento rotazionale del DNA nucleosomale Orientamento Rotazionale: Quali sequenze sono localizzate nei solchi minore della regione concava e convessa. DNA batterico di 169 bp circolarizzato per saldatura delle estremità. Mediante digestione con DNasi I si determinano le sequenze nucleotiche localizzate solchi minori della regione convessa. Lo stesso DNA linearizzato e avvolto attorno all ottamero istonico a formare un nucleosoma. Le sequenze nucleotidiche dei solchi minori della regione convessa tagliate dalla DNasi I sono le stesse. LA DIREZIONE DI CURVATURA RIMANE INALTERATA PASSANDO DAL DNA NUDO CIRCOLARE AL NUCLEOSOMA.

29 POSIZIONAMENTO INTRINSICO: I nucleosomi si possono formare su posizioni specifiche per la struttura locale o le sequenze nucleotiche del DNA Nella superelica nucleosomale le sequenze ricche in A-T sono preferenzialmente localizzate nel solco minore della regione concava.

30 IL LEGAME DI PROTEINE A SEQUENZE SPECIFICHE POSSONO DETERMINARE IL POSIZIONAMENTO (ESTRINSECO) DEI NUCLEOSOMI a. La distanza dei siti di legame per due Proteine è minore di 147 bp. Il legame delle due proteine escludono il nucleosoma b. Una proteina legata al DNA interagisce con il nucleosoma e lo posiziona adiancente ad essa.

31 Esistono vari modi di modificare la struttura della cromatina e regolare i processi biologici"

32 La modificazione degli istoni regola la funzione della cromatina

33 LE CODE N TERMINALI DEGLI ISTONI SONO ESTENSIVAMENTE MODIFICATE Figure 4-39b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

34 La modificazione degli istoni e del DNA regola la funzione della cromatina HAT: Istone acetilasi HDAC: Istone deacetilasi HMT: Istone metilasi LSD1: Istone de-metilasi

35 1. Acetilazione: implicata nella regolazione dell espressione genica. Interessa le K. 2. Metilazione: associata a differenti funzioni cromatiniche e alla regolazione della trascrizione. Interessa le R e K. 3. Fosforilazione: coinvolta nella regolazione della trascrizione, nei processi di riparo del DNA e nella condensazione cromosomica durante la mitosi. Interessa le S e T. 4. Ubiquitinazione: critica per i processi di mitosi e di meiosi. E coinvolta anche nella regolazione della trascrizione. Interessa le K. 5. poli(adp)ribosilazione: associata a varie funzioni cromatiniche (condensazione e decondensazione), principalmente al rilevamento di danni al DNA, ma anche ad altre funzioni genomiche. Interessa le E. 6. Sumoilazione: associata alla repressione trascrizionale e alla stabiltà della eterocromatina del lievito S. pombe. Interesa le K

36 Nel 1964 Allfrey scoprì l esistenza di istoni acetilati o deacetilati e ipotizzò un loro ruolo nella regolazione genica.! Nel 1996 venne identificata e purificata la prima acetiltrasferasi istonica (HAT: Histone Acetyl-Transferase).! H3 H4 K9 K14 K18 K23 K27 K5 K8 K12 K16 H2A K5 K9 H2B K12 K15 K20 K24

37 Le HAT nucleari sono co-attivatori! Gli Attivatori Trascrizionali reclutano i complessi delle HAT nucleari e attivano la trascrizione! SAGA Gcn5 fa parte del complesso SAGA del lievito.! PCAF (P300/CBP associated factor) è omologo a Gcn5.!

38 Le Deacetilasi Istoniche (HDAC) sono associate alla repressione trascrizionale!

39 Alcuni recettori degli ormoni steroidei dopo la rimozione del ligando diventano dei repressori: reclutano un complesso co-repressore che contiene HDAC e silenziano il gene! Co-repressore RAR: Rec Acido Retinoico RXR: Rec 9-cis Acido Retinoico

40 METILAZIONE DEGLI ISTONI HMTase PRMT1 CARM1 SET domain proteins or Dot1 PRMT: Protein Arginine Methyl Transferase CARM: (yeast) Coactivator-associated Arginine Methylase 40"

41 METILAZIONE H3 R2 K4 K9 S10 K14 R17 K18 K23 R26 K27 S28 H4 S1 R3 K5 K8 K12 K16 K20 Sono state identificate metilasi specifiche per alcuni residui di lisina: Su(var)3-9 (Drosophila), Clr4 (S.pombe), SUV39H1 (Human) sono strutturalmente conservati, e specifici per H3K9. La metilazione delle altre K è catalizzata da di altre metilasi. Metilasi specifiche intervengono anche per la mono, di, e tri-metilazione di H3K9 (e di altre K?) H3K4met ; H3/H4 Rmet H3K9met GENI ON GENI OFF

42 DIFFERENTI LIVELLI DI K9 MEHYLATION AD OPERA DI SPECIFICHE METILASI ISTONICHE 42"

43 La metilazione degli istoni nelle regioni eucromatiche ad opera di specifiche metilasi contrastano i meccanismi di silenziamento genico k4h3 metilasi k9h3 metilasi complesso HDAC k79h3 metilasi Reinberg 2003; 11; "

44 La modificazione di un residuo influenza quella di un altro residuo! sullo stesso istone o su un altro dello stesso nucleosoma.! L interazione può essere SINERGICA: P-H3S10 favorisce Ac-H3K9 e/o K14 durante la stimolazione ormonale in cellule di mammifero; oppure ANTAGONISTICA: P-H3S10 inibisce met-h3k9 Su H4 si hanno situazioni analoghe.

45 Conbinazioni di modificazioni istoniche alterano la struttura della cromatina, determinando uno stato on-off della trascrizione. Diversi tipi di struttura della cromatina dipendono dalla concentrazine locale e dalla combinazione di nucleosomi modificati differenzialmente! Condensazione mitotica! 16 Diverse combinazioni riscontrate sui promotori dei geni trascritti! Silenziamento genico e Eterocromatina! CODICE ISTONICO?????!

46 GLI ISTONI SONO DEI REGOLATORI DELL ESPRESSIONE GENICA CONCLUSIONI: " Un nucleosoma posizionato sulla TATA box reprime la trascrizione. Gli attivatori trascrizionali consentono la modifica della struttura della cromatina per l assemblaggio del PIC

47 Un nucleosoma posizionato sulla TATA box può impedire il legame della TBP (TFIID) e quindi l assemblaggio del PIC.

48 I complessi di rimodellamento modificano il posizionamento dei nucleosomi e consentono la formazione del PIC! I Complessi di rimodellamento spostano i nucleosomi dai promotori per consentire il legame dei TF

49 I Complessi di Rimodellamento della cromatina sono classificati in base alla loro subununità ATasiche

50 I Complessi di Rimodellamento agiscono con nucleosomi! meccanismi differenti Il rimodellamento della cromatina cambia l organizzazione dei

51 MODELLO PER RIMODELLAMENTO ATP-DIPENDENTE ATP idrolisi

52 I Complessi di rimodellamento si legano alla cromatina tramite i Fattori di Trascrizione (Attivatori o Repressori)

53 Sul Promotore di Pho5 la carenza di fosfato induce l attivatore Pho4 a rimuovere i nucleosomi dal promotore e dall UASp2

54 NELLA CELLULA LA CROMATINA RICHIEDE ULTERIORI ALLENTAMENTI DEI CONTATTI DNA ISTONI CHE VIENE DETERMINATO DAI COMPLESSI DI RIMODELLAMENTO ISWI e SWI/SNF: Riposizionamento del nucleosoma (scivolamento) SWI/SNF: Trasferimento (espulsione dl nucleosoma) SWI/SNF: Rimodellamento del nucleosoma SWR1: Cambio della composizione del nucleosma (scambio dell eterodimero H2A-H2B)