Nanotecnologia: artefatti con proprietà emergenti
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- Rocco Villa
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1 Gli SiRNA e loro uso terapeutico contro il cancro.
2 Nanotecnologia: artefatti con proprietà emergenti
3 Prima generazione Liposomi e particelle di albumina
4 Seconda generazione Particelle: attive da sé attivate da raggi ablazione termica
5 Terza generazione Farmaci multistadio
6 gli sirna Small interfering RNA, conosciuti anche come short interfering RNA o silencing RNA, sono piccolissimi RNA formati da nucleotidi di cui due alle estremità non appaiati. Ad ogni estremità 5 si trova il gruppo fosfato, alle 3 il gruppo ossidrile. Affinchè si possano formare è necessaria la presenza di : filamento di ds RNA o sh RNA DICER Proteine Argonaute complesso del RISC
7 formazione sirna Filamenti di RNA progenitori del sirna che interagiranno col DICER.. Complesso enzimatico della famiglia delle RNA polimerasi III. E un endonucleasi specifico che, attaccandosi alla catena polinucleotidica, genera il sirna Complesso del silenziamento Indotto. Esso riduce il sirna in un singolo filamento. Proteina Argonauta
8 processo di silenziamento
9 STORIA degli sirna 1998 scoperta sirna 2000 ricerca ROCHE 2003 pubblicazione sul WALL STREETJOURNAL 2006 NOBEL FIRE e MELLO 2007 primo farmaco brevettato ROCHE 2008 pubblicazione su NATURE per l uso nella NANOTECNOLOGIA
10 SCOPERTA degli sirna 1998 Prima applicazione delle teorie su piante di PETUNIA Successivo esperimento su animali: Mancata espressione di determinati geni in Caenorhabditis elegans dopo essere stato trattato con i sirna (problemi al tessuto nervoso,cutaneo..etc)
11 Ricerca 2000 start 2003 wall street journal 2007 brevettato farmaco ALNYLAM
12 Nobel 2006 MELLO FIRE Per la scoperta del fenomeno del silenziamento genico mediante l interferenza degli RNAi
13 MAURO FERRARI VETTORI AL SILICIO
14
15 Terapia non efficace: Difficile permeabilità Tossicità Soluzione: una mezza noce di cocco veicolo multistadio Completamente biodegradabile Vogliono personalizzarlo a livello subcellulare!
16 MATERIALI E METODI
17 MATERIALI E METODI E METODI Western blot. in questo studio tramite western blot si è usato un anticorpo primario anti EphA2 evidenziato con perossidasi coniugata ad IgG (Amersham) e arricchito con un kit di che utilizza la chemiluminescensa potenziata (Pierce). per confermare Fabbricazione un di uguale particelle caricamento, siliciche e leporose membrane sono state testate per la β-actina Chimica di superficie di S1MP Immunoistochimica. Ki67 Preparazione e frammenti di disirna EphA2 liposomale sono stati ottenuti con formalina fissata e sezioni di tumore (8-µm di grandezza) incorporate con paraffina. Per la valutazione della proliferazione cellulare; quali indice di proliferazione si è contato il numero di cellule Ki67-positive rispetto al totale delle cellule in 5 campi di cultura scelti casualmente in aree necrotiche con ingrandimento di 100 volte. I dati sono stati espressi come percentuale di cellule Ki67-positive. Per misurare la densità del micronatante, quale DOPC indice sirna di proliferazione si è contato il numero di vasi CD31-positivi in 5 campi di cultura scelti casualmente in aree necrotiche ad ingrandimento di 100 volte.
18 MATERIALI E METODI MATERIALI E METODI Sicurezza dello studio in vivo (chimica Cellule sanguigna di carcinoma e citochine). ovarico Campioni di plasma sono stati raccolti dal seno retro-orbitale ed ulteriormente analizzati con metodi bioumorali ematici [lattato deidrogenasi (LDH), azotemia (BUN), e creatinina] e produzione di citochina proinfiammatoria. come controllo negativo sono stati usati equivalenti campioni contenenti acido silicico quale prodotto di degradazione delle particelle siliciche e soluzione salina. I livelli di citochina nel supernatante sono stati testati usando un kit con metodica ELISA secondo le istruzioni della ditta Bio-Rad. Campionamento del vettore multistadio Linee cellulari e coltura Modello in vivo di carcinoma ovarico e trattamento del tessuto
19 MATERIALI E METODI E METODI Analisi atomica dello spettro di emissione per la concentrazione in silicico del plasma accoppiato induttivamente. Gli organi Western sonoblot stati fatti in pezzi, paccati sul fondo di una provetta, e poi analizzati per la concentrazione in silicio usando la spettroscopia di emissione atomica Immunoistochimica del plasma accoppiato induttivamente. E stato rinvenuto silicio ad una λ rispettivamente di , , , e Spettro nm edi come emissione controllo della interno concentrazione è stato usato dell ittrio (1 ppm) per la normalizzazione. plasmatica di silicio Tutti i risultati sono stati espressi come percentuale di dose iniettata. S1MP-EphA2 sirna DOPC EphA2 ß-Actina
20 MATERIALI E METODI Microscopia elettronica a trasmissione del tessuto (TEM) Dimensione campione ed analisi statistica Sicurezza dello studio in vivo
21 RISULTATI E CONCLUSIONI
22 RISULTATI E CONCLUSIONI Ottimizzazione legame Vettore -sirna EphA2 over espresso nel 70% dei casi Espressione ridotta dell 80% Tempi di degradazione Durata effetto silencer
23 RISULTATI E CONCLUSIONI Campioni di tessuto renale ed epatico trattati con S1MP-Alexa555-siRNA-DOPC dopo 10 giorni dalla somministrazione Campioni di tessuto renale ed epatico trattati con Alexa555-siRNA-DOPC dopo 10 giorni dalla somministrazione
24 RISULTATI E CONCLUSIONI Analisi immunoistochimiche dell espressione di EphA2 nel tumore HeyA8
25 RISULTATI E CONCLUSIONI Confronto con le tecniche precedenti: Maggiore riduzione della massa tumorale Riduzione delle quantità di farmaco iniettate alle cavie Diminuzione della vascolarizzazione delle cellule tumorali
26 RISULTATI E CONCLUSIONI Effetti della terapia del sirna sull angiogenesi e sulla proliferazione cellulare
27 RISULTATI E CONCLUSIONI Biodistribuzione: Esperimenti
28 RISULTATI E CONCLUSIONI FEGATO RENE S1MP IN TESSUTI DEL FEGATO E DEI RENI
29 RISULTATI E CONCLUSIONI FEGATO RENE S1MP IN TESSUTI DEL FEGATO E DEI RENI
30 Storiografia parte del materiale riguardante l esperimento è stata fornita dallo stesso Mauro Ferrari
31 Prof. Cinzia Di Pietro Roberta Manna Massimiliano Morano Maria Chiara Milana Andreana Maglitto Stefano Marletta Tommaso Piticchio
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