D ora in poi ci occuperemo, per semplicità, soltanto della RNA polimerasi II.

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1 RNA Polimerasi di eucarioti (vedi Alberts III ed. pag.483) Il processo di sintesi di RNA su di uno stampo di DNA presenta, negli eucarioti, una complessità assai elevata. A tutt oggi mancano ancora alcune conoscenze. Il processo si sviluppa analogamente a quanto avviene nei procarioti. I principi di base sono gli stessi, ma negli eucarioti esistono numerosi componenti accessori in più. La differenza fondamentale tra processo di trascrizione in procarioti ed eucarioti è la seguente: la RNA polimerasi di procarioti può individuare da sola il sito di inizio di trascrizione in corrispondenza degli opportuni siti promotori. Negli eucarioti, invece, le RNA polimerasi necessitano di altre proteine accessorie per l individuazione dei siti d inizio trascrizione. Per la trascrizione è noto che esistono segnali opportuni (siti promotori) sul DNA, prima del sito d inizio della trascrizione. Esiste infatti una TATA box, che si trova, in genere, 25 nucleotidi prima. Esiste poi tutta una varietà di altri siti promotori, collocati anche basi prima, tra cui i siti enhancer (a volte definiti elements) in corrispondenza dei quali si legano i fattori di trascrizione. E noto il sito AP1, oppure il sito CRE (Cyclic AMP Response Element), e tanti altri dei quali parleremo in seguito. E noto che, negli eucarioti, esistono RNA polimerasi di tipo I, II e III. Ogni RNA polimerasi di eucarioti richiede delle particolari proteine ausiliarie, definite fattori primari della trascrizione, alcuni dei quali sono in comune tra le varie RNA polimerasi. Vediamo le principali proprietà delle 3 RNA polimerasi: RNA polimerasi I: non è sensibile all α-amanitina (un octapeptide ciclico contenente alcuni amminoacidi insoliti). Tale tossina è prodotta dal fungo velenoso mortale Amanita phalloides. Tale enzima catalizza la sintesi della maggior parte dell RNA ribosomiale. RNA polimerasi II: sintetizza l RNA messaggero, ovvero il trascritto primario. E noto, infatti, che l RNA subisce un processo di maturazione, tra cui l importante asportazione degli introni (splicing). Subisce una forte inibizione da parte dell α-amanitina. RNA polimerasi III: sintetizza gli RNA di trasferimento (trna) e l rrna 5S. E modestamente inibita dall α-amanitina. D ora in poi ci occuperemo, per semplicità, soltanto della RNA polimerasi II. L attività trascrizionale è fondamentale in qualsiasi cellula. La concentrazione cellulare di una proteina è generalmente controllata dalla velocità con la quale viene fabbricato l mrna che la codifica. E quindi un processo critico, risultando alla fine sottoposto ad un numero elevato di controlli. Lo stesso processo trascrizionale richiede un numero considerevole di fattori primari di trascrizione, che si complessano alla RNA polimerasi vera e propria. Tali fattori sono contraddistinti dalla sigla TFII (Transcription Factor della RNA polimerasi II), e da una lettera. Vediamo, a grandi linee, il processo d attivazione della trascrizione (assemblaggio del complesso di pre-iniziazione): Atto primo: il complesso di fattori TFIID si lega alla TATA box. Tale TFIID è un complesso di altri fattori primari della trascrizione, tra cui l importante TBP (TATA box Binding Protein). Tale TBP è stata studiata in dettaglio, e presenta al C-terminale un dominio di legame al DNA caratteristico. Esso infatti è formato dalla duplicazione di due sub-domini, formati ciascuno da due α-eliche e 5 foglietti β-antiparalleli. Tale dominio del TBP forma una struttura a sella, che si inserisce sul solco maggiore del DNA, in corrispondenza della TATA box. 19

2 Al nucleo iniziale di TFIID si addiziona il TFIIB, seguito dalla RNA polimerasi II (ovvero la proteina che effettivamente catalizza la sintesi di mrna sullo stampo di DNA), legata a sua volta al TFIIF. Si aggiunge ancora il TFIIE ed, infine, il TFIIH, che possiede l attività fosforilante sulla RNA polimerasi stessa. Questo è un processo imponente, in quanto sull RNA pol-ii esistono al C-terminale ben 52 ripetizioni della sequenza: -Tirosina-Serina-Prolina-Treonina-Serina-Prolina-Serina- Tali serine (sottolineate) sono seguite da prolina e quindi, come vedremo più avanti, sono teoricamente fosforilabili anche dalle importanti proteine cinasi che controllano lo sviluppo della cellula (MAPK) ed il ciclo cellulare (Cdc 2), oltre che dal TFIIH. Questo processo di fosforilazione della RNApol-II è della massima importanza. Infatti, una volta che è fosforilata al C-terminale, la RNApol-II si stacca da tutti i fattori primari di trascrizione e procede nel processo di trascrizione, scorrendo lungo il doppio filamento di DNA, sintetizzando l RNA messaggero trascritto primario. Acetilazione degli istoni [da TIBS 22 (256) p.128 -aprile 1997] E noto che il DNA è avvolto intorno ad ottameri di istoni. Ogni ottamero è formato da due molecole di ciascun istone H2A, H2B, H3, H4. Il Dna, più gli istoni, più le proteine cromosomiche non istoniche, formano la cromatina. Ogni ottamero istonico circondato dal DNA costituisce il nucleosoma. E noto che il filare di nucleosomi, uniti dal filamento di DNA, forma una struttura simile ad una collana di perle. Gli istoni sono proteine basiche formate da un numero contenuto di AA ( AA). Per le proprietà strutturali ed evoluzionistiche vedi pagg All N-terminale l istone H-4 presenta 4 lisine che sono acetilabili da proteine enzimatiche denominate istone-acetil-trasferasi. Esistono anche enzimi con attività deacetilante (tra essi sembra importante l HD1 deacetilasi). L acetilazione elimina le proprietà basiche dei residui di lisina, tanto che le code N- terminali dell istone sono esposte al solvente ed abbandonano il legame con lo scheletro acido fosfodiestere del DNA. Quindi l acetilazione labilizza il legame tra proteine istoniche e DNA. Ovvero possiamo schematizzare queste due strutture estreme: Il complesso di pre-iniziazione, per formarsi, richiede che siano allentate le interazioni tra DNA ed istoni. Infatti il TFIID contiene, oltre al TBP, anche una TAF II 250, che ha attività istone acetiltransferasi. Alcuni fattori di trascrizione, inoltre, possono legarsi ad enzimi istoni acetiltrasferasi. E il caso della proteina p300-cbp (CREB Bindig Protein), che si lega alla proteina CREB (Cyclic AMP Response Element Binding vedi pag.155). 20

3 Acetilazioni Circa l 80% delle proteine è acetilato all N-terminale. Diverse proteine cellulari possono essere acetilate. Spesso è acetilato l NH 2 -terminale: in tal caso si parla di N-terminale bloccato e ciò conferisce, generalmente, particolare stabilità intracellulare alla proteina stessa (vedi pag.38). Il donatore di unità acetile è l Acetil-Co A: Un esempio interessante di proteine acetilabili è costituito dagli istoni. Istoni- Sono proteine che compongono la cromatina e che rappresentano più della metà della sua massa. Gli istoni sono suddivisi in cinque classi principali (H1, H2A, H2B, H3, H4). Presentano un elevata percentuale di residui carichi positivamente (Lys e Arg K e R). Tali cariche positive neutralizzano cariche negative proprie del DNA, dovute ai fosfati. Dalla tabella si deduce che: il Peso Molecolare è generalmente basso (23-11 KD) e la somma Arg+Lys varia dal 22 al 30%. (Nelle altre proteine tale somma è circa 12%). Gli istoni sono molto conservati nell arco dell evoluzione. Possiamo, per esempio, confrontare la struttura primaria dell istone H4 di timo di vitello con l H4 di pisello. Sono tutti e due formati da 102 residui e sono osservabili soltanto due sostituzioni: Indicati con in figura Val (60) Ile Lys (77) Arg Tabella. Istoni presenti nel timo di vitello Istone Numero di residui Peso molecolare (KD) % Arg % Lys UEP (in milioni di anni, vedi pag. 30) H H2A H2B H H Figura. Struttura primaria dell istone H4 da timo di vitello Ac Ser Gly Arg Gly Lys Ac Gly Gly Lys Ac Gly Leu 10 Gly Lys Ac Gly Gly Ala Lys Ac Arg His Arg Lys Met 20 Val Leu Arg Asp Asn Ile Gln Gly Ile Tyr 30 Lys Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ala Arg Arg 40 Gly Gly Val Lys Arg Ile Ser Gly Leu Ile 50 Tyr Glu Glu Thr Arg Gly Val Leu Lys Val 60 Phe Leu Glu Asn Val Ile Arg Asp Ala Val 70 Thr Tyr Thr Glu His Ala Lys Arg Lys Thr 80 Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu 90 Lys Arg Gln Gly Arg Thr Leu Tyr Gly Phe 100 Gly Gly 102 : AA sostituiti nell H4 di pisello : AA basici con carica positiva (Lys o Arg) = 25 su 102 Modifiche post-sintetiche : Ser-1 è acetilata (può anche essere fosforilata in O); Lys 5, 8, 12, 16 possono essere acetilate in N; Lys-20 può essere o meno dimetilata in N. 21

4 UEP: è l unità di periodo evoluzionistico. Corrisponde al tempo ritenuto necessario per il cambiamento di un AA su 100 di una specifica proteina, dopo che una specie ne ha generato un altra. Dalla tabella di pag.21 si può dedurre che gli istoni H2A, H2B, H3 e particolarmente H4, mostrano un notevole grado di stabilità dal punto di vista evoluzionistico. Poiché H4 di bue e di pisello differiscono per soli due amminoacidi, queste due proteine si sono differenziate 660 x 2 milioni di anni fa (1.3 miliardi di anni). L istone H4 è una delle proteine note maggiormente conservate (anche la calmodulina e le chaperonine). Una stabilità evoluzionistica così rigida implica che i 4 istoni abbiano una funzione critica per la quale le loro strutture sono così ben formulate da non tollerare alcun cambiamento. Modifiche post-sintetiche dell istone H4: si osserva l acetilazione della Ser 1 (NH 2 bloccato ). La Ser 1 può anche essere fosforilata nell -OH alcolico. Quattro residui di Lys (5, 8, 12, 16) possono essere acetitati nel gruppo amminico ε scomparsa della carica positiva. La Lys 20 può essere metilata, ma, in questo caso, la carica positiva non scompare. Ricordiamo che per l autoassemblaggio del nucleosoma interviene la nucleoplasmina (è una chaperonina, vedi pag.12). Ubiquitina e istoni L istone H2A è per circa il 10% legato mediante legame isopeptidico all ubiquitina. 22

5 Miristoilazioni e palmitoilazioni di proteine per ancoraggio in membrana L inserimento covalente di un acido grasso in una proteina determina l inserimento in membrana di una proteina altrimenti idrosolubile. (Miristico = C14; Palmitico = C16) Esempi: La proteina src (da sarcoma di Raus) è una tirosin cinasi. (vedi hsp-90 pag.12) La p21 ras è una proteina G (vedi più avanti) Diversamente dagli esempi A e B, in C la proteina viene meglio ancorata in membrana (tale proteina è gia integrale, cioè attraversa la membrana). (vedi rodopsina) 23

6 Esempio di proteina miristoilata: Rodopsina 24

7 Smistamento delle proteine Lo studente può trovare una trattazione esauriente dei seguenti argomenti su Alberts e coll. Biologia molecolare della cellula III edizione Paragrafo 534 pag.636 Le proteine si possono muovere tra i compartimenti in modi diversi Paragrafo 535 pag.637 Peptidi segnale e zone segnale dirigono le proteine ai corretti indirizzi cellulari con importante tabella 12.3 pag.639 e figura 12.8 Figura pag.649 (che ribadisce argomento trattato a pag.13 dei presenti appunti: hsp-90 e recettori per ormoni steroidei). Paragrafo 546 pag.651 con figura Paragrafo 548 pag.652 Importazione di proteine mitocondriali con figure e Paragrafo 562 pag.666 Paragrafo 563 pagg

8 Proteine glicosilate La glicosilazione di proteine è una delle più importanti modifiche post-sintetiche. A volte la parte glucidica di una proteina è estremamente complessa. Poiché la glicosilazione avviene senza l istruzione di uno stampo (la traduzione avviene su precise istruzioni dell mrna), questa può variare da molecola a molecola e, pertanto, è difficile avere in laboratorio una preparazione di una proteina omogenea nella sua parte glucidica. Si riscontra la cosiddetta microeterogeneità delle glicoproteine. Questa circostanza, ovviamente, pone seri problemi per i vari approcci analitici sperimentali. Per lo studio di tali glucidi si fa largo impiego di proteine, in genere, di origine vegetale: le lectine. È famosa la concanavalina A del fagiolo, che lega specificamente residui di α-d-glucosio ed α-dmannosio. È anche molto utilizzata la agglutinina del germe di grano, che lega specificamente l acido N-Acetil-Muramico (NAM) e l acido sialico (o acido N-Acetil neuraminico). È ben nota la Ribonucleasi studiata da Anfinsen che non contiene glucidi (RNasi-A). esiste poi una Ribonucleasi B che contiene circa 6 residui di mannosio (anche 5) + 2 residui di N-Acetilglucosammina (NAG). Curiosamente tale RNasi-B ha proprietà biochimiche del tutto simili alla RNasi-A. Si ipotizza che tali carboidrati possano agire da segnali di riconoscimento in vari processi biologici. 26

9 Tra le proteine ad alta glicosilazione possiamo ricordare le proteine anticongelamento. Esse sono prodotte da specie animali che vivono a basse temperature, per esempio i pesci artici. Esse sono composte quasi completamente dal tripeptide Ala-Ala-Thr ripetuto oltre 50 volte, ed ogni residuo Thr è glicosilato nel seguente modo: È un esempio di glucide legato con legame-o Β-galattosil-(1 3)-α-N-acetilgalattosammina Glicosilazioni nel citosol È una glicosilazione meno efficiente (le proteine sono glicosilate preferenzialmente nel reticolo endoplasmatico). I residui che si legano alla proteina sono, in genere, soltanto uno, e spesso tale zucchero è l N-acetilglucosammina. Invariabilmente si ha un legame-o-glucosidico con residui di Ser e Thr, del tipo: Oltre all esempio, molto specializzato, delle proteine anticongelamento, sono glicosilate con legame O-glucosidico alcune: proteine regolatrici di geni proteine dei pori nucleari 27

10 Ben più frequenti sono le: Glicosilazioni nel reticolo endoplasmatico (RE) Un esempio in tal senso è dato dalla glicosilazione del collageno. Molte proteine processate nel RE sono glicosilate, e in tal caso la glicosilazione è all N, essendo impegnato un residuo di Asparagina (Asn-N) che forma un legame glucosidico con l NH2 ammidico della catena laterale. La struttura dell oligosaccaride è generalmente complessa. Uno zucchero molto rappresentato è il Mannosio. Si tenga presente che sul RE vengono sintetizzate le proteine destinate ad essere secrete con i consueti meccanismi di vescicolazione. Occorre puntualizzare due aspetti strutturali: 1. L asparagina che è coinvolta nella glicosilazione è inserita in una precisa sequenza consenso, del tipo Asn X Ser o Thr, cioè è contraddistinta da Ser o Thr nella seconda posizione dopo Asn. Con questa premessa è facilmente identificabile un sito di glicosilazione in una struttura primaria di una proteina. 2. Invariabilmente l oligosaccaride inizia con due residui di N-acetilglucosammina (NAG), prosegue con un residuo di mannosio che lega altri due residui di mannosio. Sono presenti poi altri residui. Un esempio più semplice è dato dalla rodopsina bovina (vedi pag.24) che vicino all N-terminale ha due siti di glicosilazione all N. Vediamo la struttura di tale oligosaccaride: Si osservi che le glicosilazioni, nella rodopsina, sono all interno dei dischi, che possono essere paragonati ad altre vescicole. Poiché la parte glucidica viene aggiunta covalentemente alle proteine mentre queste sono sintetizzate nel lume del RE, si ha come conseguenza che le proteine transmembrana portano la parte glucidica (glicocalice) invariabilmente all esterno. 28

11 Dolicolo fosfato Il processo che porta alla glicosilazione all N comporta l intervento del dolicolo fosfato, che è un composto con una lunga catena isoprenoide (20 unità) con un fosfato ad un estremità. L oligosaccaride viene costruito sul dolicolo fosfato. Un particolare enzima transferasico (una glicolsil transferasi) sposta l oligosaccaride dal dolicolo all NH 2 ammidico dell Asn che deve riceverlo (vedi pag.30). L oligosaccaride trasferito dal dolicolo alla catena proteica non coincide generalmente con l oligosaccaride effettivamente ritrovato nelle proteine mature (vedi pag.33). Vediamo la struttura di un oligosaccaride portato dal dolicolo: su 14 residui 9 sono di mannosio Questo oligosaccaride è riportato anche a pag

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13 Inibitori delle glicosilazioni La tunicamicina è un importante inibitore della glicosilazione. Tale composto è prodotto da Streptomyces. La molecola tunicamicina comprende una parte che è simile al dolicolo fosfato e un altra parte che comprende l UDP-N-Acetilglucosammina. Tale composto blocca la glicosilazione perché inibisce la tappa 2 (vedi pag.30), cioè l incorporazione dei primi due residui di N-Acetilglucosammina nell oligosaccaride legato all N. Tale reazione 2 catalizza la reazione di 2 componenti. Nella tunicamicina sono inclusi contemporaneamente i due componenti. Quindi mima lo stato di transizione. Abbiamo già visto (pag.14) che la tunicamicina fa aumentare la sintesi delle Bip. 31

14 Gruppi Sanguigni nell uomo Il sistema AB0 comporta l esistenza di tre gruppi di sostanze, gli antigeni A, B ed H, che sono componenti glucidici degli sfingolipidi della superficie degli eritrociti. Vediamo A e B: Individui tipo A con antigeni A e anticorpi anti B Individui tipo B con antigeni B e anticorpi anti A Individui tipo AB (ricevente universale) con antigeni A e B e no anticorpi anti A o B Individui tipo 0 (donatore universale) senza antigeni A o B ma con anticorpi sia anti A che anti B Questi componenti glucidici sono anche diffusi, sotto forma legata all -O, tra le glicoproteine plasmatiche e in glicoproteine di secrezione in fluidi tipo: saliva, latte, liquido seminale, succo gastrico e urine. Tipo Antigene Gli individui di tipo 0 presentano l antigene H, che manca sia di Gal-N-Ac che di Gal. E però precursore sia di A che di B. A presenta l N-Acetil Galattosammina, mentre B ha solo Galattosio. H (nel gruppo 0) A B 1,4 Gal β Glc NAc--- 1,2 (NAG) L-Fuc α 1,3 1,4 Gal Nac α Gal β Glc Nac--- 1,2 (NAG) L-Fuc α 1,3 1,4 Gal α Gal β Glc Nac--- 1,2 (NAG) L-Fuc α Il responsabile di questa diversità è un enzima di 303 AA, una glicosil transferasi, che aggiunge N- acetilgalattosammina all antigene H. Nei soggetti 0 tale enzima è assente, mentre nei soggetti B esiste un enzima modificato che addiziona ad H solo il galattosio. 32

15 Alcuni esempi di Oligosaccaridi legati all N IgM umana Rodopsina Bovina Ovoalbumina pollo Virus Sind bis Transferrina uomo e coniglio Membrane plasmatiche di fegato di ratto IgG bovine M=Mannosio G=Galattosio NAG=N-Acetil Glucosammina NAM=N-Acetil Murammico Come si può constatare, esistono sempre gli oligosaccaridi del nocciolo (5 residui su 14), che esistono anche nell oligosaccaride di 14 residui portato dal dolicolo. In effetti avviene una complessa rielaborazione con l eliminazione di vari residui e aggiunta di altri, ma i 5 residui del nocciolo però rimangono. 33