GENETICA VIRALE. La variazione del genoma virale ha un impatto su: PATOGENESI CICLO REPLICATIVO VIRUS EMERGENTI SVILUPPO VACCINI RESISTENZA AI FARMACI

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1 GENETICA VIRALE La variazione del genoma virale ha un impatto su: PATOGENESI CICLO REPLICATIVO VIRUS EMERGENTI SVILUPPO VACCINI RESISTENZA AI FARMACI

2 I virus sono in continua evoluzione, mediante un processo in cui si alternano: 1) L emergenza di nuove caratteristiche genetiche e 2) la loro stabilizzazione nella popolazione La prima parte di questo processo avviene, in maniera casuale, durante la replicazione del genoma virale, Quindi: Quando il cambiamento genetico NON ALTERA LA CAPACITA RIPRODUTTIVA del virus esso si trasmetterà alla progenie Le alterazioni genetiche che ledono in modo drastico la capacità replicativa del virus sono eliminate dalla popolazione virale, Le alterazioni che causano lievi danni alla capacità replicativa tendono ad essere eliminate dalla popolazione perché il virus originario si replica con maggiore efficienza e velocità, a meno di una condizione esterna che conferisca vantaggio alla popolazione mutata

3 Le quasi specie virali La stabilizzazione nella popolazione virale del cambiamento genetico che non altera la capacità riproduttiva del virus potrà avvenire o per fluttuazione casuale oppure in risposta ad una pressione selettiva Alcune mutazioni infatti determinano cambiamenti delle strutture superficiali che consentono al virus di sfuggire all azione della risposta immunitaria dell ospite Queste popolazioni virali si espanderanno velocemente nell ospite finché il sistema immunitario di quest ultimo non neutralizzerà i nuovi virus, esercitando così una pressione selettiva verso l affermazione di nuove ulteriori varianti antigeniche virali Per alcuni virus (HIV e HCV) nasce così il concetto di quasi-specie, derivato dall osservazione che, in un individuo infettato da lungo tempo, si ha continua evoluzione del virus, per effetto delle mutazioni spontanee e per la pressione selettiva esercitata dall immunità dell ospite, nonché dalla terapia farmacologica

4 GENETICA VIRALE IL DNA cromosomico dell organismo ospite generalmente richiede tempi geologici per evolvere nel modo in cui evolvono i virus ad RNA in una singola generazione

5 GENETICA VIRALE VIRUS CRESCONO RAPIDAMENTE UNA SINGOLA PARTICELLA PRODUCE NUMEROSE PARTICELLE VIRALI IN UNA CELLULA ELEVATA PROBABILITA DI MUTAZIONE IN TEMPI BREVI I VIRUS A DNA HANNO ACCESSO A SISTEMI DI PROOF- READING, MENTRE I VIRUS A RNA NO LA NATURA DEL GENOMA VIRALE (RNA O DNA, SEGMENTATO O NON-SEGMENTATO) SVOLGE UN RUOLO IMPORTANTE NELLA GENETICA DEI VIRUS

6 I VIRUS POSSONO CAMBIARE GENETICAMENTE PER: MUTATIONI RIASSORTIMENTO/RICOMBINAZIONE

7 ORIGINE DELLE MUTAZIONI SPONTANEE: Basi tautomeriche Errori della polimerasi INDOTTE

8 FORME TAUTOMERICHE frequenti rare

9 Introdotte dalle polimerasi I virus che usano DNA-polimerasi DNA-dipendenti presentano una frequenza di mutazione relativamente bassa( per nucleotide per ciclo replicativo), simile a quella che si osserva negli organismi cellulari(dna-polimerasi con capacità di correzione di bozze) I virus che usano RNA-polimerasi (sia DNA-che RNAdipendenti) sono privi di attività di correzione di bozze, e pertanto sono più soggetti a errori di copiatura Le trascrittasi inverse (DNA-polimerasi-RNAdipendenti) dihbv e dei Retrovirus sono in natura tra gli enzimi a maggior tasso di errore spontaneo (non possiedono di norma attivita di correzione di bozze). La frequenza di mutazioni spontanee raggiunge 1x 10-4 nucleotidi per ciclo replicativo

10 In generale quindi: I virus a DNA sono più stabili geneticamente dei virus a RNA, perché nella cellula ci sono sistemi di riparazione dei danni al DNA Alcuni virus a RNA sono abbastanza stabili in natura. E probabile che questi virus abbiano la stessa elevata frequenza di mutazione degli altri virus a RNA ma essendosi adattati finemente bastano solo minimi cambiamenti per eliminare eventuali vantaggi competitivi rispetto al virus parentale (wildtype). SELEZIONE NEGATIVA!

11 ORIGINE DELLE MUTAZIONI INDOTTE DA AGENTI FISICI Raggi UV Raggi X INDOTTE DA AGENTI CHIMICI Agenti che agiscono direttamente sulle basi (es. Acido nitroso) Agenti che agiscono indirettamente (es. Analoghi delle basi)

12 TIPO DI MUTAZIONI PUNTIFORMI INSERZIONI DELEZIONI

13 Le mutazioni inducono Mutanti LETALI CONDIZIONALI il virus mutato si moltiplica solo in certe condizioni ma non in altre il virus wild-type (wt) cresce in entrambe le condizioni Mutanti sensibili alla temperatura (ts) non crescono a temperature elevate (es. Crescono bene a 31 C ma non a 39 C, mentre il virus parentale cresce bene ad entrambe l e temperature) Mutanti host-range non crescono in tutti i tipi cellulari in cui cresce il virus wild-type (utili per studiare il ruolo della cellula nell infezione virale)

14 Esempi di cambiamenti fenotipici in mutanti virali Mutanti di PLACCA La dimensione della placca può essere più grande o più piccola di quella del virus parentale. A volte questi mutanti hanno una alterata patogenicità Mutanti RESISTENTI AI FARMACI - Importante nello sviluppo dei farmaci antivirali Mutanti ENZIMA-DEFICIENTI Alcuni geni possono essere opzionali in certe circostanze (es. Timidina Chinasi di HSV non è necessaria per crescita in coltura cellulare ma è necessaria per l infezione dei neuroni)

15 Esempi di cambiamenti fenotipici in HOT MUTANTS mutanti virali Crescono meglio ad elevate temperature rispetto al wt Più virulenti perchè meno suscettibili alla febbre e possono rallentare la crescita del virus wt Mutanti ATTENUATI Sintomi attenuati (o assenza di sintomi) Sviluppo di vaccini Patogenesi

16 CAMBIAMENTI GENETICI MUTAZIONI RIASSORTIMENTO/RICOMBINAZIONE

17 RICOMBINAZIONE SCAMBIO DI INFORMAZIONE TRA DUE GENOMI

18 RICOMBINAZIONE Classica classic recombination Comune nei virus a DNA e retrovirus durante la fase nucleare Rottura dei legami covalenti, scambio materiale genetico, riformazione legami covalenti

19 RECOMBINAZIONE COPY CHOICE Virus a RNA non usano ricombinazione classica (mancanza di enzimi nella cellula ospite per ricombinare l RNA) Picornavirus ricombinano con bassa efficienza mediante copy choice (la polimerasi salta da uno stampo all altro durante la sintesi dell RNA).

20 RECOMBINAZIONE COPY CHOICE

21 CONSEGUENZE DELLA RICOMBINAZIONE La ricombinazione favorisce l acquisizione di nuove informazioni genetiche da parte di virus dello stesso tipo e occasionalmente da virus diversi o anche dal genoma cellulare (es. alcuni retrovirus).

22 RICOMBINAZIONE ALCUNI UTILIZZI Mappaggio mediante frequenza di ricombinazione Mappaggio tramite marker rescue Sviluppo di virus ricombinanti a scopo vaccinale o per ragioni terapeutiche

23 RICOMBINAZIONE -ALCUNI marker rescue UTILIZZI

24 RICOMBINAZIONE - ALCUNI UTILIZZI Mappaggio tramite frequenza di ricombinazione Mappaggio tramite marker rescue Sviluppo di virus ricombinanti a scopo vaccinale o per ragioni terapeutiche

25 RICOMBINAZIONE ALCUNI UTILIZZI

26 RIASSORTIMENTO GENICO si verifica esclusivamente nei virus a RNA segmentato (orthomyxovirus, reovirus, arenavirus, bunyavirus)

27 RIASSORTIMENTO GENICO forma di ricombinazione NON classica molto importante in natura per generare nuove varianti molto importante in laboratorio per assegnare funzioni ai vari segmenti solo virus segmentati (es. Se un segmento deriva dal virus influenzale A e uno dal B possiamo capire quali proprietà appartengono a d A e a B) usata in alcuni nuovi approcci vaccinali

28 APPLICAZIONI DELLA GENETICA Il vaccino antiinfluenzale Flumist (LAIV, approvato nel giugno 2003) è stato generato sfruttando i principi discussi. Riassortimento genico tra un ceppo attenuato ed un nuovo ceppo virulento del virus influenzale per produrre un vaccino antinfluenzale attenuato

29 APPLICAZIONI DELLA GENETICA Il ceppo attenuato è adattato al freddo (tratto respiratorio superiore) ma termo-sensibile (crescita scarsa a livello del tratto respiratorio inferiore). E meno patogeno del virus wt (a causa di diverse mutazioni) Gli anticorpi contro le proteine di superficie (HA e NA) sono importanti per la protezione. Tuttavia le proteine HA e NA mutano ogni anno. La tecnologia sfrutta il riassortimento per generare virus riassortanti che hanno 6 segmenti genici del virus attenuato adattato al freddo e i segmenti codificanti HA e NA di un virus verosimilmente responsabile della nuova epidemia influenzale. E un vaccino vivo attenuato fornito per via intranasale come spray che induce immunità mucosale e sistemica.

30 VIRUS A RNA A POLARITA NEGATIVA NON-SEGMENTATI Non presentato meccanismi copy choice Non vanno incontro a riassortimento Minore capacità di scambiare materiale genetico

31 COMPLEMENTAZIONE Interazione a livello funzionale, NON a livello genico I 2 mutanti ts non crescono alla temperatura non permissiva, ma se le mutazioni sono su geni diversi si complementano La progenie virale assemblata usa le proteine wt N e wt M I genomi nella progenie saranno ts M o ts N Mutanti di complementazione mappano generalemente a livello di geni diversi

32 VIRUS DIFETTIVI Mancano gene(i) necessari per un ciclo infettivo completo Virus helper fornisce funzioni mancanti package me! copy me! package me! copy me!

33 VIRUS DEFETTIVI Alcuni esempi di virus defettivi Alcuni retrovirus (usano virus helper correlato) Il virus dell epatite delta (usa un virus helper non correlato) I virus Adeno-associati

34 DEFECTIVE INTERFERING (DI) VIRUSES (PARTICLES) Sono particelle virali mancanti di parti più o meno consistenti del genoma Diminuiscono la replicazione del virus helper Competono per gli stessi precursori, enzimi. Possono modulare l infezione da parte del virus wt NON SONO UTILIZZATE IN CLINICA Insorgono naturalmente es. virus DI del morbillo nella panencefalite subacuta sclerosante (SSPE)

35 Virus Like Particles Sono particelle virali prive completamente del genoma virale Vengono utilizzate in approcci di vaccinazione (HPV)

36 PHENOTYPIC MIXING tra 2 virus diversi che infettano la stessa cellula no cambiamenti nel genoma possibile spettro d ospite alterato possibile resistanza ad anticorpi neutralizzanti

37 PHENOTYPIC MIXING per generare uno pseudotipo