Significato dell analisi del I globulo polare

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1 Inherited disorders Master in Medicina della Riproduzione Abano Terme, 27 marzo 2009 Couples at genetic risk Significato dell analisi del I globulo polare Affected Pregnancy Children Other family members Options Genetic screening Reproductive roulette Prenatal diagnosis / termination No more children Adoption Gamete donation PGD D. Zuccarello Diagnosis of genetic disorders before implantation of embryos PREIMPLANTATION GENETIC DIAGNOSIS PGD to improve IVF outcome An alternative could be to diagnose the genetic disorder before the pregnancy is established (on oocytes or embryos). Only the unaffected embryos would then be transferred to the uterus. Opportunity for couples to prevent the physical and psychological trauma, and ethical-moral problems associated with possible termination. This technique is referred to as Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) Aneuploidy Testing Advanced Maternal Age Repeated Implantation Failure Recurrent Early Abortions Severe Male Infertility Translocations PGD to reduce recurrent genetic risk Single Gene Disorders Autosomal Recessive Autosomal Dominant X-Linked Late onset disorders Inherited Predisposition to Cancer HLA Genotyping

2 Biopsy for PGD PGD applications 1^ Polar Body Pre-conception 1^ & 2^ Polar Body Cleavage Stage Embryos (day-3) PGD for: Aneuploidy screening (PGS) Chromosomal Translocation (Robertsonian, Reciprocal) Chromosomal inversions, deletions, duplications Single gene disorders HLA matching Late on set disorders Inherited predisposition to cancer Blastocyst Preparing to single cell PCR Italian Law 40/2004 on medically assisted procreation Blastomere After removal, each blastomere or polar body is transferred into sterile 0.2 ml PCR tubes containing of lysis buffer, and covered with mineral oil before subjection to cell lysis Polar bodies 1-2 drops of mineral oil is added the use of IVF techniques is restricted to sterile couples; fertilization of a maximum of 3 oocytes; the transfer of all three possible embryos is mandatory, even if affected! Freezing of embryos is forbidden PGD on embryos is unfeasible!

3 Opzioni per le coppie Italiane dopo approvazione della Legge 40 La PGD in Italia dopo la Legge 40: la Diagnosi Genetica Pre-concepimento La Legge 40/2004 vieta qualsiasi forma di diagnosi genetica sull embrione; quindi in Italia non e più possibile eseguire la cosiddetta diagnosi genetica preimpianto (PGD). Fino ad oggi, le coppie italiane portatrici di patologie genetiche avevano due opzioni riproduttive: Il concepimento naturale, sottoponendosi successivamente a diagnosi prenatale, mediante villocentesi o amniocentesi; Ricorrere al cosiddetto turismo procreativo. Oggi, finalmente, si affaccia una nuova opportunità per le coppie italiane a rischio genetico: la cosiddetta diagnosi genetica preconcepimento (PCGD) Studio degli ovociti prima della loro fertilizzazione in vitro, mediante analisi genetica. Selezione degli ovociti in cui non sia presente la mutazione del partner femminile. La diagnosi genetica eseguita sull ovocita, prima del concepimento, e non sull embrione. Si producono solo embrioni sani, escludendo a priori la possibilità di produrre embrioni con anomalie genetiche. si risolve definitivamente il problema della selezione genetica degli embrioni e dell'eliminazione degli embrioni malati. Existing protocols on 1PB testing Critiche alla PCGD 1PB testing (Verlinsky et al., 1990); Sequential analysis of 1PB and 2PB (Verlinsky et al., 1997), to increase the accuracy and efficiency of diagnosis because of recombination events. At present, PGD on PBs is mainly applied to those couples having moral objections to any micromanipulation and potential discarding of abnormal embryos (Kuliev et al., 2001; Kuliev, 2006). It also represents the only option for prevention of genetic diseases for countries where diagnosis on embryos is prohibited (genetic testing is carried out before fusion of the two pronuclei - Tomi et al., 2005, 2006) Originalità: già condotta nel 1990 dal gruppo di Chicago Affidabilità: tecnica parziale, affatto esaustiva, e con una margine di errore molto elevato L analisi andrebbe fatta sul 1PB e il 2PB Se si analizza solo il 1PB c'è un elevato margine d'errore Casistica ridotta: la tecnica è stata applicata ad un numero limitato di casi

4 PGD: è originale? La procedura applicata nel 1990 dal gruppo di Chicago prevedeva l analisi del 1PB dopo la fecondazione. Vecchia tecnologia. tempi di analisi lunghi (16-24 h), non compatibili con i tempi massimi di ICSI (6-8 h post prelievo). Successivamente l analisi del solo 1PB è stata abbandonata, ed integrata con l analisi sequenziale del 1PB e 2PB. Il nome della procedura e stato modificato in diagnosi genetica pre-zigotica o pre-embrionica (dopo la fertilizzazione dell ovocita, ma prima della formazione dello zigote), ed attualmente utilizzata in Germania, Austria e Svizzera. I protocolli di diagnosi genetica pre-zigotica non sono compatibili con la Legge 40. L originalità risiede nella rapidità del test (estrema complessità) che può essere portato a termine entro 4h, quindi in tempo utile per la ICSI PCGD: è affidabile? La PCGD ha un alto margine di errore? L analisi andrebbe fatta su 1PB e 2PB? Se si analizza solo il 1PB si rischia un errore di diagnosi?

5 PGD from PB1 La diagnosi genetica dell ovocita mediante analisi I tempi analitici molto stretti (al massimo 6 ore). Per questo motivo, l applicazione della tecnica segue uno schema articolato che richiede una stretta coordinazione tra due diverse equipe: Il team del laboratorio di PMA; Il team del laboratorio di genetica. L attività di questi due gruppi di professionisti consente di ottenere i risultati entro 6 ore dal prelievo degli ovociti. Analisi genetica dell ovocita mediante diagnosi Analisi genetica dell ovocita mediante diagnosi 1) Selezionare marcatori STRs e primers 2) Testare marcatori STRs e primers su DNA genomico e su singoli leucociti 3) Biopsia, lisi del 1PB ed allestimento di nested multiplex PCR fluorescente 4) Analisi di linkage 1) Selezionare marcatori STRs e primers 2) Testare marcatori STRs e primers su DNA genomico e su singoli leucociti 3) Biopsia, lisi del 1PB ed allestimento di nested multiplex PCR fluorescente 4) Analisi di linkage

6 Analisi genetica dell ovocita mediante diagnosi Multiplex Metodica di PCR FAST 50 minuti: multiplex PCR 50 minuti: nested PCR Nested Riduzione dei tempi di analisi di circa 60 minuti! Analisi genetica dell ovocita mediante diagnosi ANALISI DI LINKAGE 1) Selezionare marcatori STRs e primers 2) Testare marcatori STRs e primers su DNA genomico e su singoli leucociti 3) Biopsia, lisi del 1PB ed allestimento di nested multiplex PCR fluorescente 4) Analisi di linkage Permette di evidenziare eventuali crossingover e di identificare gli alleli dropout

7 Esempio di allele dropout: PGD PER DISTONIA PRIMIA La PCGD è affidabile! Embryo 1 Elettroforesi capillare dei prodotti di PCR fluorescenti. La ricombinazione non incide sull affidabilità dell analisi, in quanto gli ovociti ricombinanti non verrao considerati per la successiva fertilizzazione Embryo 1: affetto La ricombinazione comporta solo una riduzione del numero di ovociti disponibili per la ICSI Gene DYT1 Embryo 2 Embryo 2: affetto (allele dropout) L analisi del 2PB degli ovociti con ricombinazione aumenterebbe solo il numero degli ovociti per ICSI, non rende l analisi genetica più affidabile Embryo 3 La diagnosi effettuata sul solo 1PB è affidabile (ADO circa 0.5%) Embryo 3: sano Diagnosi Genetica Pre-concepimento: APPLICABILITA La diagnosi pre-concepimento puo essere applicata a coppie portatrici di : Malattie monogeniche a trasmissione: autosomica recessiva (Fibrosi Cistica, Beta Talassemia, SMA, etc.) legata al cromosoma X (Sindrome X-Fragile, Distrofia Muscolare) autosomica dominante di origine femminile (Distrofia Miotonica) Con questa procedura non possono essere individuate eventuali malattie genetiche a trasmissione autosomica dominante di origine maschile. Traslocazioni cromosomiche bilanciate: Reciproche Robertsoniane Diagnosi Genetica Pre-concepimento: VANTAGGI L analisi e effettuata su materiale extra-embrionario, che non ha alcun ruolo biologico. La biopsia del 1PB non incide sullo sviluppo dell embrione, mantenendo inalterate le relative percentuali di impianto. La diagnosi genetica viene quindi eseguita sull ovocita, l embrione non viene manipolato. Ciò previene l eliminazione degli embrioni malati e consente di superare i problemi etici che hao determinato il divieto della diagnosi preimpianto. Utile per quelle coppie, portatrici di una malattia genetica, che non vogliono affrontare la scelta dolorosa di un interruzione volontaria della gravidanza o con problemi etici ad essa coessi. Evita gli effetti del turismo procreativo.

8 Diagnosi Genetica Pre-concepimento: LIMITI L analisi consente di ottenere solo informazioni relative ad anomalie di origine femminile, ed e quindi inapplicabile in caso di malattie genetiche autosomiche dominanti di origine maschile. Una bassa risposta alla stimolazione ovarica incide sul numero di ovociti disponibili per l analisi genetica. Una buona riserva ovarica, quindi, e un requisito importante per il successo della procedura. Clinical outcome of PGD cycles Range of the age Outcome < > PGD+PGS 38> All ages hcg+ rate x ET 73,9% 50,0% 50,0% 50,0% 40,0% 44,4% 57,7% Clinical Pregnancy rate x ET 69,6% 50,0% 50,0% 50,0% 40,0% 44,4% 55,8% All ages Outcome SGD Translocation SGD+Translocation hcg+ rate x ET 53,8% 69,2% 57,7% Clinical Pregnancy rate x ET 51,3% 69,2% 55,8% Età! Applicazione clinica della PGD Applicazione clinica della PGD Patologia DM Becker CMT2A CONX26 DM Duchee FC HT - FC FC S. Meckel-Gruber Distrofia FSO + FC Emofilia A Aniridia (PAX6) SMD DM Duchee Von Hippel Lindau Eredità X-linked AD X-linked AD X-linked AD X-linked AD Mutazione lei delezione esoni S249C (esone 8) V153I MLPA negativo. Aplotipo a rischio codone 39 D-F508 HT: H63D; FC: 5T D-F508 W225X (esone 27) codone 39 delezione 4q35 IVS1 nt1 G>A inversione IVS 22 IVS1:6 T>C + del alpha 3.7 IVS6+1 G>C Hb Lepore Q302X MLPA in corso. Aplotipo a rischio delezione parziale 3Kb Mutazione lui -3224C>A IVS2-745 D-F508 / 5T HT: C282Y/H63D); FC: 711+5G>A 1564 del CA Y843C (esone 24) Hb S CFTR: D-F508 delezione delta-beta codone 39 IVS1-6 W386R Provenienza Cremona Livorno Milano Milano Novara Como Padova Padova Brescia Como Lecco Agrigento Milano Torino Prato Milano Torino Padova Cagliari Indicazione Nr. di cicli Nr. di coppie Nr. di gravidanze in Nr. di Bambini corso di gestazione già nati Malattie Monogeniche Fibrosi Cistica Beta Talassemia Distrofia Muscolare Duchee (DMD) Distrofia Miotonica Atrofia Muscolare Spinale (SMA) Sordità ereditaria (CX26) X-Fragile (FRAXA) Charcot Marie Tooth (CMTX) Sindrome di Kallman Malattia di Treacher-Collins Traslocazioni Cromosomiche Robertsoniane Reciproche Totale

9 PCGD for CMTX PCGD X-Fragile No. of COC: 19 No. of MII Oocytes: 15 No. of biopsied Oocytes: 15 1PB Diagnosi 1PB Diagnosi Ovocita 1 Presenza di Aplotipo Normale MUTAZIONE PRESENTE 2 Presenza di Aplotipo associato alla Mutazione Assenza di Mutazione 3 Presenza di Aplotipo associato alla Mutazione Assenza di Mutazione 4 Presenza di Aplotipo Normale MUTAZIONE PRESENTE 5 Presenza di Aplotipo Normale MUTAZIONE PRESENTE 6 Presenza di Aplotipo Normale MUTAZIONE PRESENTE 7 Assenza di amplificazione Nessun Risultato 8 Presenza di Aplotipo associato alla Mutazione Assenza di Mutazione 9 Presenza di Aplotipo associato alla Mutazione Assenza di Mutazione 10 Presenza di Aplotipo associato alla Mutazione Assenza di Mutazione 11 Presenza di Aplotipo Normale MUTAZIONE PRESENTE 12 Presenza di Aplotipo associato alla Mutazione Assenza di Mutazione 13 Presenza di Aplotipo Normale MUTAZIONE PRESENTE 14 Ricombinazione Ovocita non diagnosticabile 15 Presenza di Aplotipo associato alla Mutazione Assenza di Mutazione No. of COC: 9 No. of MII Oocytes: 9 No. of biopsied Oocytes: 9 1PB Diagnosis of 1PB Diagnosis of Oocyte 1 Ricombinazione Ovocita non diagnosticabile 2 Ricombinazione Ovocita non diagnosticabile 3 Presenza di Aplotipo Normale ESPANSIONE PRESENTE 4 Presenza di Aplotipo associato alla Espansione Assenza di Espansione 5 Presenza di Aplotipo associato alla Espansione Assenza di Espansione 6 Presenza di Aplotipo Normale ESPANSIONE PRESENTE 7 Presenza di Aplotipo associato alla Espansione Assenza di Espansione 8 Ricombinazione Ovocita non diagnosticabile 9 Ricombinazione Ovocita non diagnosticabile PCGD -Talassemia Conclusioni No. of COC: 17 No. of MII Oocytes: 15 No of biopsied Oocytes: 15 1PB Diagnosi 1PB Diagnosi Ovocita 1 Ricombinazione Ovocita non diagnosticabile 2 Presenza della Mutazione Mutazione Assente 3 Ricombinazione Ovocita non diagnosticabile 4 Assenza di Amplificazione Nessuna Diagnosi 5 Assenza della Mutazione MUTAZIONE PRESENTE 7 Assenza della Mutazione MUTAZIONE PRESENTE 8 Presenza della Mutazione Mutazione Assente 9 Ricombinazione Ovocita non diagnosticabile 10 Ricombinazione Ovocita non diagnosticabile 11 Assenza della Mutazione MUTAZIONE PRESENTE 13 Ricombinazione Ovocita non diagnosticabile 14 Ricombinazione Ovocita non diagnosticabile 16 Ricombinazione Ovocita non diagnosticabile 17 Assenza di Amplificazione Nessuna Diagnosi 18 Assenza della Mutazione MUTAZIONE PRESENTE la diagnosi genetica pre-concepimento consente di superare un sentito problema etico: la manipolazione dell embrione a fini diagnostici. soluzione che permette di conciliare le due opposte visioni di tutela dell embrione. la diagnosi genetica viene eseguita sull ovocita, e non sull embrione. A differenza della diagnosi preimpianto, non si producono ed eliminano embrioni malati. Con le attuali restrizioni legislative, la diagnosi pre-concepimento è più efficace della diagnosi preimpianto. L opzione di un trattamento in Italia, evita alle coppie a rischio genetico i notevoli disagi di natura psicologica ed economica conseguenti al turismo riproduttivo. Una speranza per molte coppie che non possono affrontare i costi di un trattamento all estero, a causa delle limitate disponibilità economiche.